蛋白質(zhì)的表達(dá)純化[教師教材]

1、實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離、純化和鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)、分離、純化和鑒定 (1)了解重組蛋白表達(dá)的方法和意義。 (2)了解親和層析分離純化的方法。 1青苗輔導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理 克隆基因在細(xì)胞中表達(dá)對(duì)理論研究和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用都具有 重要的意義。通過表達(dá)能探索和研究基因的功能以及基 因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，同時(shí)克隆基因表達(dá)出所編碼的蛋白 質(zhì)可供作結(jié)構(gòu)與功能的研究。大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣 泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高 于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì) 菌總蛋白量的80%。 2青苗輔導(dǎo) 本實(shí)驗(yàn)中，攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿 菌BL21中，在37，IPTG誘導(dǎo)下，超量表

2、達(dá)攜帶有 6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素?；D(zhuǎn)移酶蛋白， 該蛋白可用一種通過共價(jià)偶連的次氨基三乙酸 （NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質(zhì)加以 提純，實(shí)為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質(zhì) 的純化程度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。 3青苗輔導(dǎo) 材料與試劑材料與試劑 試劑 1 LB液體培養(yǎng)基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸餾水配至1000mL. 2 氨芐青霉素：100mg/mL 3 上樣緩沖液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM 2-ME, pH8.0 4 Washi

3、ng Buffer（UWB）： 100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 5 Elution Buffer(洗脫): 100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 6 IPTG 4青苗輔導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 一、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)一、氯霉素?；D(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo) 1. 接種含有重組氯霉素?；D(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌 BL21菌株于5mL LB液體培養(yǎng)基中 （含100ug/mL 氨芐 青霉素），37震蕩培養(yǎng)過夜。 2. 轉(zhuǎn)接1mL過夜培養(yǎng)物于100mL（含100ug/

4、mL 氨芐青霉 素）LB液體培養(yǎng)基中，37震蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 樣品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l, 37繼續(xù)培養(yǎng)1-3h. 4. 12，000rpm 離心10 min, 棄上清，菌體沉淀保存于- 20或-70冰箱中。 5青苗輔導(dǎo) 二、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離，純化二、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離，純化 1.重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融50ml菌體沉淀，加入 5mL上樣緩沖液GLB, 用吸管抽吸重懸, 4 12000rpm 離心 30 min, 將上清（總蛋白細(xì)胞裂解液）吸至一個(gè)干凈的容器中， 并棄沉

5、淀。 2. NTA層析柱的準(zhǔn)備：在層析柱中加入1mL NTA介質(zhì)，并分 別用8mL 去離子水，8mL上樣緩沖液GLB洗滌。(調(diào)速0.5ml/3 分鐘 ) 。 3. 細(xì)胞裂解液3mL以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流 出液。 4.洗脫雜蛋白：用50mL洗滌緩沖液UWB以10-15mL/h流速洗柱， 分別取10ul洗滌開始與結(jié)束時(shí)的樣品用于SDS-PAGE 分析。 5.洗脫目標(biāo)蛋白：用10mL洗脫緩沖液洗柱，每管0.51 mL， 共收集610管，分別取10ul樣品用于SDS-PAGE 分析。 6青苗輔導(dǎo) 1裝配制膠用的玻璃板（由助教演示）。 2制分離膠：按所需的濃度配制12.5

6、分離膠分離膠。 30%Acr- Bis Tris-HCl pH 8.8 H2O10%APTEMED 5ml3ml4ml120ul20ul 灌完分離膠后在膠面上小心加水封（注意不要沖壞膠 面），等膠自然凝聚后（這時(shí)候在膠面與水封之間可以看 見清晰的界限） 7青苗輔導(dǎo) 3制濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠濃縮膠，配 方如下： 30%Arc- Bis Tris-HCl pH 6.7 H2O10%APTEMED 400ul750ul1800ul50ul10ul 8青苗輔導(dǎo) 9青苗輔導(dǎo) 5加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個(gè) 加樣孔加樣不宜過多，一般每孔加樣10L。 6電泳：先恒壓80V，待樣

7、品進(jìn)入分離膠后，調(diào) 電壓為120V（恒壓）。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到離底部約 0.5cm時(shí)，停止電泳。 10青苗輔導(dǎo) 7翹開玻璃板，將濃縮膠切掉, 剝下凝膠，準(zhǔn)備染色。 8 凝膠染色：使用考馬斯亮藍(lán)R250染色。兩塊膠（小 盒子）或四塊膠（大盒子）同步染色脫色。蓋上蓋子 用微波爐加熱約15-20秒，搖床振蕩15分鐘，回收染液回收染液 至指定容器至指定容器。清水漂洗后加入脫色液（25%乙醇，75% 乙酸）脫色，用量和步驟與染色相同，脫色兩次，每 次10分鐘。 11青苗輔導(dǎo) 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) (1) Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用， 操作時(shí)應(yīng)戴手套和口罩。 (2) 玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在

8、電泳時(shí)會(huì)造成 凝膠板與玻璃板之間產(chǎn)生氣泡。 (3) 樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。 (4) 灌凝膠時(shí)不能有氣泡，以免影響電泳時(shí)電流的 通過。 (5) 切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電泳后區(qū) 帶扭曲。 （6）電泳時(shí)應(yīng)選用合適的電流、電壓，過高或者過 低都會(huì)影響電泳效果。 (7) 稀釋5SDS/電泳緩沖液至1濃度灌入電泳槽， 需800毫升。 12青苗輔導(dǎo) 1.將紅色玻璃夾子底座朝 下、卡口打開呈直角狀， 放入厚薄兩片玻璃，薄玻 璃朝向自己。注意厚玻璃 箭頭向上，旁邊兩條小玻 璃條與薄玻璃接觸，使之 形成一個(gè)間隙。 2.在平整的桌面上放下玻 璃與夾子，使玻璃和夾子 的底面完全對(duì)齊，向外扳 動(dòng)塑料卡口，關(guān)緊夾子。 13青苗輔導(dǎo) 3.將做好的玻璃夾放在制膠架 上，注意薄玻璃朝向自己，厚 玻璃上的箭頭向上。按彈簧夾， 將玻璃夾卡入制膠架。在玻璃 的間隙內(nèi)灌膠，放上梳子，待 膠凝固。 4.取出制好的玻璃（連帶膠），將玻璃放入電 極架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向 電極架，厚玻璃的箭頭朝上，玻璃與紅色橡膠 條必須完全緊貼。（需同時(shí)放置兩塊制好的膠， 如只使用一塊則另一面須用提供的塑料板代替， 注意塑料板上的提示，必須使塑料板與橡膠條 完全緊貼。）正常安裝則會(huì)形成一個(gè)密閉的容 器。 14青苗輔導(dǎo)