β葡萄糖苷酶的分離純化

1、百度文郵-讓每個(gè)人平等地捉升口我3本章以裂褶菌DS1液體發(fā)酵粗酶液為研究對(duì)象，對(duì)粗酶液中卩葡萄糖昔酶 先后進(jìn)行硫酸鍍沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子層析、SephacrylS-200 分子篩層析等方法對(duì)其進(jìn)行分離純化，并在此基礎(chǔ)上對(duì)該酶的一般性質(zhì)進(jìn)行研 究。材料與方法4.1.1材料4.1.1.1 菌種：裂褶菌DS1,由華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院資源與環(huán) 境微生物所提供4.1.1.2培養(yǎng)基：斜面培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：馬鈴薯(200g),蔗糖(20g),瓊脂(30g),水(lOOOmL)種子培養(yǎng)基(PDY培養(yǎng)基)：馬鈴薯(200g),蔗糖(20g),水(lOOOm

2、L)發(fā)酵培養(yǎng)基：纖維素(3.2 g),蛋白籐(3.0 g), KH2PO4(0.2 g), Ca(NO3)(1.5 g), (0.5 g)，水(lOOmL)4.1.13緩沖溶液L pH=緩沖溶液：稱取6.055g Tris溶于500mL雙蒸水中；量取鹽酸溶液溶 于500mL雙蒸水中；將262mL鹽酸溶液和500mL雙蒸水(含Tris)混合即成PH=緩沖溶液。4.1.1.4 試劑：對(duì)硝基酚-卩-葡萄糖昔(pNPG)對(duì)硝基酚(NPG)DEAE-Sepharose Fast FlowSephacry 1 S-200蛋白腺硫酸鞍過(guò)硫酸按考馬斯亮藍(lán)R-250, G-250丙烯肽胺、甲義雙丙烯肽胺TEME

3、DPMSFSigma公司Sigma公司Amersham 公司Amersham 公司北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司Fluka公司北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司Sigma公司Sigma公司SDSTris甘氨酸甲硫氨酸低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋口PEG-20000快速銀染試劑盒蘆?。?95%）槐角昔（90%）槐角提取物（10： 1）4.1.1.4 儀器TG-332A微量分析天平低速大容量離心機(jī)電泳儀（DYY-m型）UV2000紫外-可見光分光光度計(jì)Sigma公司上海伯奧生物科技有限公司Sigma公司上海伯奧生物科技有限公司天根生化科技（北京）有限公司天津市科密歐實(shí)驗(yàn)

4、化學(xué)試劑開發(fā)中心碧云天生物技術(shù)研究所國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司實(shí)驗(yàn)室自制西安天園生物技術(shù)有限公司上海天平儀器廠上海精密儀器儀表有限公司北京六一儀器廠尤尼柯（上海）儀器有限公司4.1.2方法4.1.2.1粗酶液的獲得方法將菌種DS1接種到PDA斜面活化3d后，挑取一定大小的菌塊接入PDY培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)3d制備一級(jí)液體種，再以10%的接利喔接入PDY培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d制備二級(jí)液體種。按10%的接利|量將二級(jí)種加入含有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中， 于27C, 150 r/min搖床上培養(yǎng)。每天取一瓶發(fā)酵液在4000 r/min條件下離心lOmin 后，取上清液在標(biāo)準(zhǔn)條件下用pNPG測(cè)定卩葡萄糖昔酶的活性

5、。如此持續(xù)取三角 瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)液直至培養(yǎng)的笫10d為止，取卩-葡萄糖昔酶的活性最高的培養(yǎng)液為粗 酶液。4.1.2.3對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制見方法2.122。4.1.2.4卩葡萄糖昔酶酶活測(cè)定對(duì)硝基酚書-葡萄糖昔（pNPG）法【利測(cè)定卩-葡萄糖昔酶酶活。4.1.2.5蛋白質(zhì)含量的測(cè)定考馬斯亮藍(lán)G250法。將測(cè)試酶液稀釋到一定濃度，取于試管中再加入考馬 斯殼藍(lán)G250試劑，搖勻，靜置lOmin后，在595nm條件下進(jìn)行蛋口質(zhì)含量測(cè)定。 以牛血清蛋白做標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y二，R2=(Y為吸光值，X蛋口質(zhì)含量)。4.1.2.6硫酸釵分級(jí)沉淀、脫鹽和濃縮1.確定鹽析時(shí)飽和度范圍(1) 取粗酶液7份,每份15mL;

6、(2) 分別用飽和度為20%-80%相對(duì)飽和度的(NH4)2SO4于4C鹽析12h;(3) 以不加硫酸錢的酶液為對(duì)照，于冰箱中于4C鹽析12h；(4) 8500 r/min 于 4C離心 20min;(5) 分別收集各離心管中的上清液和沉淀，并用的乙酸-乙酸鈉恢復(fù)至原體積, 在A595與A4I0條件下分別測(cè)定其蛋白質(zhì)含量和卩-葡萄糖昔酶活力。2最佳pH條件下鹽析(1) 在100ml粗酶液中緩慢加入硫酸錢至Xi%飽和度；(2) 4C靜置 12h;(3) 4C, 8500r/min條件下離心20min,取上清液,測(cè)量上清液體積;(4) 在上清液中繼續(xù)緩慢加硫酸鍍至X2%飽和度；(5) 4C靜置 1

7、2h;(6) 4C, 8500r/min條件下離心20min,取上清液，沉淀溶于最佳pH值的乙 酸-乙酸鈉中。并在相同的緩沖溶液中透析過(guò)夜，直至檢測(cè)不出SO42+為止, 4500r/min 離心 15min,取上清。4.1.2.7 DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析將收集的上清液施于經(jīng)Tris-HCL緩沖(pH=,50mmol Tris-HCL緩沖溶液) 預(yù)平衡的DEAE-Sepharose .層析柱上(1.0cm x 20cm),酶蛋口先用約5倍柱體積 的緩沖液洗脫至A595不變后，再用300mL pH=,50mmol和300mL含lmol/LNaCl 的相同緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫

8、，流速為min, 5min收集1管。將每管在標(biāo)準(zhǔn) 條件下進(jìn)行活性測(cè)定，收集卩-葡萄糖昔酶酶活性較高的洗脫液。4.1.2.8 Sephacn l S-200 凝膠過(guò)濾層析將上步所收集的酶液用聚乙二醇(PEG)包埋法將酶液濃縮至2mL,進(jìn)行 Sephacry 1 S-200 凝膠過(guò)濾層析(1.6cm x 76cm),用 pH=,50mmol Tris-HCI 緩沖液 洗脫，流速為min, 5min收集1管。進(jìn)行活性測(cè)定后收集具有酶活性的洗脫液 部分，對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE(SDS-聚丙烯猷;胺凝膠電泳)確認(rèn)純度。4.1.2.9 SDS-PAGE電泳溶液及膠的配制表SDSPAGE電泳溶液及膠的配制

9、配制方法保存條件A液丙烯酰胺3.00g凝膠濃度30%,交聯(lián)度雙丙烯酰胺0.08g4C百度文郵-讓每個(gè)人平等地捉升口我加雙蒸水定容至B液(分離膠緩沖溶液)1.5M pH= Tris-HCl 緩沖溶液Tris 18.2g1MHC1調(diào)節(jié)pH至雙蒸水定容至lOOmL4CC液O.5M pH= Tris-HCl 緩沖溶液4 C(濃縮膠緩沖溶液)Tris 1.8g1MHC1調(diào)節(jié)pH至雙蒸水定容至30mL聚合起始劑10%過(guò)硫酸鞍室溫，現(xiàn)配現(xiàn)用0.5g過(guò)硫酸錢，加5mL雙蒸水溶解聚合促進(jìn)劑TEMED4 C電泳緩沖液Tris 9.0g 甘氨酸43.2gSDS 3g加雙蒸水至600mL4 C樣品溶解液0.5M pH

10、= Tris-HCl 甘油SDS炸疏基乙醇%(W/V)漠酚藍(lán) 共計(jì)0.48g4 C染色液考馬四亮藍(lán)R-250 甲醇冰乙酸加去離子水至250ml0.125g23mL室溫脫色液甲醇冰乙酸加去離子水至25 mL500mL室溫表分離膠和濃縮膠的配制膠溶液分離膠(8%)濃縮膠(5%)A液B液/C液/10(W/V)SDS聚合起始液聚合促進(jìn)劑 雙蒸水 共計(jì)12pL20mL10mL10mL4.1.2.10電泳具體操作步驟將配制好的8%的分離膠溶液混合均勻，然后將凝膠溶液迅速傾入制膠玻 璃板中，至膠液面距玻璃板凹槽3cm左右，然后在膠面上輕輕鋪?zhàn)cm高的水 層，垂直放置膠板，待膠凝聚后，用濾紙輕輕吸出膠面上的

11、水，注意不要破壞膠 面。(2) 將配制好的5%濃縮膠迅速注入到分離膠的上層，至液面與玻璃板的凹槽 平齊，插入梳子后，在室溫下放置20-30min,待其完全凝聚后，小心拔出梳子 并倒入電極緩沖液。(3) 將蛋白樣品加入等體積的樣品緩沖液，混勻后在沸水中煮3-5min,冷卻 后用微量進(jìn)樣器將其加入上樣孔中。(4) 將電泳槽與電泳儀相連，保持150V的恒定電壓進(jìn)行電泳，直至樣品中染 料遷移接近至下端時(shí)關(guān)閉電壓，停止電泳。4.1.2.11蛋白質(zhì)的染色及脫色1. 固定：電泳結(jié)束后，取凝膠放入約100mL固定液中，在搖床上室溫?fù)u動(dòng) 20min,搖動(dòng)速度為60-70r/mino固定40 min以上甚至過(guò)夜可

12、以進(jìn)一步降低背景。固定液的配制：依次加入50mL乙醇、10mL乙酸和40mL MilliQ級(jí)純水或 雙蒸水，混勻后即成100mL固定液。2. 30%乙醇洗滌：棄固定液，加入100mL30%乙醇，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)lOmin, 搖動(dòng)速度為60-70r/mino30%乙醇的配制：70mL MilliQ級(jí)純水或雙蒸水中加入30mL乙醇，混勻后 即成100mL30%乙醇。3. 水洗滌：棄30%乙醇，加入200mL MilliQ級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上室 溫?fù)u動(dòng)10min,搖動(dòng)速度為60-70r/mino4. 增敏：棄水，加入100mL銀染增敏液(IX),在搖床上室溫?fù)u動(dòng)2min,搖 動(dòng)速度為60-70r

13、/mino銀染增敬液(IX)的配制：99mL MilliQ級(jí)純水或雙蒸水中加入ImL銀染增敬 液(100X),混勻后即為銀染增敬液(IX)。銀染增敬液(IX)配制后需在2h內(nèi)使用。5. 水洗滌(共2次)：棄原有溶液，加入200mL MilliQ級(jí)純水或雙蒸水，在 搖床上室溫?fù)u動(dòng)lmin,搖動(dòng)速度為60-70r/mino棄水，再加入200mL MilliQ級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)1 min,搖 動(dòng)速度為60-70r/mino6. 銀染：弄水，加入lOOmL銀溶液(IX),在搖床上室溫?fù)u動(dòng)lOmin,搖動(dòng) 速度為 60-70r/mino銀溶液(IX)的配制：99mLMilliQ級(jí)純水或雙蒸

14、水中加入ImL銀溶液(1OOX), 混勻后即為銀溶液(lX)o銀溶液(IX)酉己制后需在2h內(nèi)使用。7. 水洗滌：棄原有溶液，加入lOOmLMilliQ級(jí)純水或雙蒸水，在搖床上室 溫?fù)u動(dòng)，搖動(dòng)速度為60-70r/mino注意：水洗滌的時(shí)間不能超過(guò)。8. 顯色：棄水，加入lOOmL銀染顯色液，在搖床上室溫?fù)u動(dòng)3-10min,直 至出現(xiàn)比較理想的預(yù)期蛋白條帶，搖動(dòng)速度為60-70r/mino銀染顯色液的配制：90mL MilliQ級(jí)純水或雙蒸水中加入10mL銀染基本顯 色液(10X),再加入銀染顯色加速液(2000X),混勻后即為銀染顯色液。銀染顯色液 配制后需在20min內(nèi)使用。9. 終止：棄銀

15、染顯色液，加入lOOmL銀染終止液(IX),在搖床上室溫?fù)u動(dòng) lOmin,搖動(dòng)速度為60-70r/mino終止時(shí)有氣體產(chǎn)生屬正常現(xiàn)象，產(chǎn)生的氣體為 二氧化碳。銀染終止液(IX)的配制：95mLMilliQ級(jí)純水或雙蒸水中加入5mL銀染終止 液(20X),混勻后即為銀染終止液(IX)。銀染終止液(IX)配制后宜當(dāng)d使用。10. 水洗滌：棄銀染終止液，加入lOOmL MilliQ級(jí)純水或雙蒸水，在搖床 上室溫?fù)u動(dòng)2-5min,搖動(dòng)速度為60-70r/mino11. 保存：可在MilliQ級(jí)純水或雙蒸水中保存?；虿捎眠m當(dāng)?shù)姆绞街苽涑筛?膠。4.1.2.12 SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)含量(1) 按4

16、丄4進(jìn)行凝膠電泳(2) 遷移率的計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用直尺分別測(cè)量各蛋白質(zhì)區(qū)帶中心與凝膠頂端的距離。各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶的遷移率(以相對(duì)遷移率Rf表示)按下列公式進(jìn)行汁算： 如卄:工菇、蛋白質(zhì)移動(dòng)距離染色前膠長(zhǎng) 相對(duì)遷移率區(qū))染色后膠長(zhǎng)染料移動(dòng)距離以各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品遷移率作橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)分子量的自然對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo) 作圖，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)分子量測(cè)定測(cè)得待測(cè)蛋白質(zhì)的遷移率后，山標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得其分子量的自然對(duì)數(shù) 值，再換算成分子量即可。4.1.2.12葡萄糖昔酶性質(zhì)的研究(一) 卩葡萄糖昔酶最佳反應(yīng)溫度將酶液分別在不同的溫度下(30C, 40C,50C,60C,70C,80C),測(cè)定A葡

17、萄糖昔酶的活性，將最高的酶活力定義為100%,分別計(jì)算不同溫度條 件下卜葡萄糖昔酶的剩余酶活性(采用相對(duì)酶活性來(lái)表示，即在不同溫度條件下 的剩余的酶活性占其中酶活性的最高值的百分比)。(二) 卩葡萄糖昔酶最佳反應(yīng)pH將酶液分別置于不同pH值，的NaH/POy檸檬酸緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)， 并測(cè)定剩余的酶活性。將最高的酶活力定義為100%,分別計(jì)算不同pH值條件 下卩-葡萄糖昔酶的剩余酶活性(方法同上)。(三) 卩葡萄糖昔酶的熱穩(wěn)定性將酶液分別置于不同的溫度條件下(40C, 50C, 60C, 70C, 80C)保溫不 同的時(shí)間(lOmin, 20min, 30min, 40min, 50min, 6

18、0min)后，將其迅速放置于冰 水浴中，然后測(cè)定剩余的酶活性。將最高的酶活力定義為100%,分別計(jì)算不同 溫度條件下卩-葡萄糖昔酶的剩余酶活性與最高酶活性的比值。(四) 不同金屬離子對(duì)卜葡萄糖昔酶活性的影響在卜葡萄糖昔酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，分別加入不同的金屬離子(Cu2+, Mg2+, Co2+, Na+, Zn2+, Ba2+, Mn2+, K+, Al*, Fe3+, Fe2+, Hg?+并使金屬離 子的最終濃度為L(zhǎng),以不加金屬離子的反應(yīng)體系中的酶活性定義為100%,分別 測(cè)定加入金屬離子后各反應(yīng)體系中卩-葡萄糖昔酶的剩余相對(duì)酶活性。(五) 卩葡萄糖昔酶對(duì)不同物質(zhì)的作用能力在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下

19、，用濃度為10mg/mL的不同物質(zhì)，如槐角昔、染料木昔 和蘆丁與卩-葡萄糖昔酶進(jìn)行反應(yīng)，并用HPLC對(duì)變化前后的成分進(jìn)行檢測(cè)。觀 測(cè)卩葡萄糖昔酶對(duì)不同物質(zhì)的作用能力?；苯俏艮D(zhuǎn)化體系的洗脫條件：見方法3.121。蘆丁轉(zhuǎn)化體系的洗脫條件網(wǎng)：色譜柱：Hypersil C-18反相柱(100mmx4.6 nun .;5pm ):流動(dòng)相甲醇(A) % 磷酸水溶液(B) : 020min(B:6767)； 2025min(B:6762)； 2560min(B:6262)； 6065min(B:6267)；進(jìn)樣量:10L； 流速：mLmin1 ；柱溫：25C ；檢測(cè)波長(zhǎng)355nm.7百度文庫(kù)讓每個(gè)人平等地捉

20、升口我結(jié)果與分析4.2.1不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)生卩葡萄糖昔酶的影響59-O-2 5 1 51 O 0-0- (1)典建 O01234567培養(yǎng)天數(shù)Q)10 11 12圖不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)卩葡萄糖昔酶的影響從圖可知，不同培養(yǎng)天數(shù)里，裂褶菌DS1分泌0-葡萄糖昔酶有很大差異。 隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，卩-葡萄糖昔酶的分泌量成上升趨勢(shì)，從第Id的U/mL升 高到笫8 d時(shí)的酶活最高值，為mL;此后卜葡萄糖昔酶分泌量減少，酶活逐漸 降低，在第12d時(shí)酶活為U/mLo從上可知，搖瓶條件下，裂褶菌S. commune DS1 產(chǎn)卩-葡萄糖昔酶的最佳時(shí)間是第8do在培養(yǎng)的早期，裂褶菌通過(guò)利用培養(yǎng)基中的速效碳源得到生長(zhǎng)

21、，此時(shí)山于速 效碳源濃度較高，卩-葡萄糖昔酶的分泌收到抑制；隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，裂褶菌逐漸 將速效碳源耗盡，此時(shí)不得不通過(guò)分泌纖維素酶將培養(yǎng)基中的纖維素降解。纖維 素酶分泌量的提高，使得卩-葡萄糖昔酶酶量也得到提高，在笫8d時(shí)達(dá)到最高值。 隨后，隨著可利用碳源的枯竭，裂褶菌的生長(zhǎng)受到抑制，并且出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，此 時(shí)A葡萄糖背酶酶活逐漸降低。422硫酸披分級(jí)沉淀B-匍萄糖昔酶+蛋白質(zhì)0. 10. 080. 06。0.04S0. 020圖卩-匍萄糖昔酶硫酸鞍鹽析曲線從圖可知，隨著硫酸讓飽和濃度的增加，卩-葡萄糖昔酶逐漸鹽析出來(lái)。在 飽和濃度為60%80%范圍內(nèi)鹽析所得沉淀的卩-葡萄糖昔酶酶活和總蛋口質(zhì)得

22、 率明顯增加，前者從mL升高到mL,后者從41%升高到100%。因此，可確定卩- 葡萄糖昔酶在粗酶液中的硫酸鍍鹽析范圍是60%到80%飽和度。4.2.3 DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析將收集的上清液施于經(jīng)pH=,50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液預(yù)平衡的 DEAE-Sepharose .層析柱上(1.0cm x 20cm),酶蛋口先用約100mL柱體積的緩沖 液洗脫至A595不變后，再用300mL pH=,50mmol/LTris-HCl緩沖溶液和300mL 含lmol/LNaCl的相同緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為min, 5min收集1管。 將每管在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行活性

23、測(cè)定，收集卩-葡萄糖昔酶酶活性較高的洗脫液。102 1-2111213141516171-A410 -A5950.40.30.2蚩0. 10圖DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析圖譜從圖可知，酶液經(jīng)在DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析后，共洗 脫出3個(gè)蛋白峰(1-1,121-3)。用4.124所述方法對(duì)各蛋口峰進(jìn)行卩-葡萄糖昔酶酶 活的測(cè)定，結(jié)果表明峰1-3處有很強(qiáng)的卩-葡萄糖昔酶，而峰1-1和1-2處則酶活較 低。收集第36管到44管的洗脫液進(jìn)行下一步的分離純化。4.2.4 Sephacryl S-200 凝膠過(guò)濾層析0.40.20.

24、6圖Sephacryl S-200分子篩層析圖譜將經(jīng)DEAE-Sepharose .陰離子交換柱層析后的酶液用PEG-20000濃縮后， 吸取2mL酶液施于經(jīng)pH=,50mmol/L Tris-HCI緩沖液平衡的Sephacryl S-200凝 膠過(guò)濾進(jìn)行層析，流速為min, 5min收集一管(前20mL未收集)。從圖可知， 在Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾層析過(guò)程中，共洗脫出4個(gè)蛋白峰，其中峰II-1和 II-4比較明顯，但是沒有卩-葡萄糖昔酶酶活存在。只有峰II-3具有較高的卩-葡萄 百度文郵-讓每個(gè)人平等地捉升口我糖昔酶活性。收集峰II-3處的洗脫液（35-41管），用PEG-2

25、0000濃縮后進(jìn)行 SDS-PAGE檢測(cè)，確認(rèn)其純度。4.2.5卩葡萄糖昔酶純化過(guò)程總表整個(gè)純化過(guò)程的結(jié)果如圖所示。從該圖可知，卩-葡萄糖昔酶相對(duì)于粗酶液 （lOOmL）已被純化了倍，從酶的酶活力由最初的U/mg提高到了 U/mgo表卩-葡萄糖昔酶純化過(guò)程總表分離步驟總蛋白總酶活比酶活純化倍數(shù)得率stepTotalTotalSpecificPurificationRecoverproteinactivityactivityfactory(mg)(U-10-3)(U/mg1- IO 3)(%)發(fā)酵液471001701100鹽析25600840DEAE-Sepharose156001500F.F.

26、Sephacryl S-200410031004.2.6卩葡萄糖昔酶性質(zhì)研究4.2.6.1蛋白質(zhì)純度鑒定用SDS-PAGE電泳對(duì)經(jīng)過(guò)Sephacryl S-200凝膠層析的蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定, 見圖所示。由圖可知，經(jīng)過(guò)Sephacryl S-200凝膠層析后出現(xiàn)一條帶，說(shuō)明所分 離的卩-葡萄糖昔酶達(dá)到了較高的純度。11百度文庫(kù)讓每個(gè)人平等地捉升口我13卜 glucosidase117,00090,00049,00034,00019,0001.標(biāo)準(zhǔn)蛋口質(zhì)及分子量2經(jīng)Sephacryl S-200凝膠層析的彷葡萄糖昔酶圖卜葡萄糖昔酶的SDS-PAGE電泳圖4262分子量測(cè)定根據(jù)實(shí)驗(yàn)繪制的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)

27、分子量對(duì)數(shù)值和相對(duì)遷移率做圖，線性回歸后得 到的LgMr- Rf標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y二+ , R2= （y二蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)值，x= 蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率）。卩-葡萄糖昔酶經(jīng)SDS-PAGE分析后&值=,山此可推出 其分子質(zhì)量是。表標(biāo)準(zhǔn)蛋口的遷移率標(biāo)準(zhǔn)蛋白分f量(kDa)Rfstandard proteinMolecularweight0-半乳糖昔酶P-galactosidase117兔磷酸化酶BRabbit phosphorylase b90雞卵口蛋口Ovalbumin49碳酸酊酶Caibonic anhydrase34卩-乳球蛋白P-lactoglobulin25溶菌酶Lysozyme19圖S

28、DS-PAGE電泳測(cè)定卜葡萄糖昔酶分子量4.2.63卩葡萄糖昔酶最佳反應(yīng)溫度將0-葡萄糖昔酶置于不同溫度下進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果如圖所示。從該圖可知, A葡萄糖昔酶的最適反應(yīng)溫度為50C o0IIIIIII203040506070S090溫度CC)圖溫度對(duì)卩-葡萄糖昔酶活性的影響4264卩葡萄糖昔酶最佳反應(yīng)pH將卩-葡萄糖昔酶置于不同pH的磷酸緩沖液中進(jìn)行酶活測(cè)定，結(jié)果如圖所示。 從圖可知，卩-葡萄糖昔酶的最適反應(yīng)pH為。圖pH對(duì)葡萄糖昔酶活性的影響百度文郵-讓每個(gè)人平等地捉升口我4265卩葡萄糖背酶的熱穩(wěn)定性將酶液分別置于不同的溫度條件下(40C, 50C, 60C, 70C, 80C)保溫不

29、同的時(shí)間(lOmin, 20min, 30min, 40min, 50min, 60min)后，將其迅速調(diào)至酶的 最適溫度，然后測(cè)定剩余的酶活性。結(jié)果如圖所示，在pH值為的條件下，該酶 在40C和50C時(shí)活性是穩(wěn)定的，酶活沒有損失；在60C時(shí)，酶的半衰期是5min； 在70C和80C保溫lOmin時(shí)，相對(duì)酶活性變成。-ior -5oc 6or x7or sor圖卩-葡萄糖昔酶的熱穩(wěn)定性4.266金屬離子對(duì)卩葡萄糖昔酶酶活的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表，從表中可以看出Fe2+對(duì)酶有強(qiáng)烈的抑制作用，當(dāng)反應(yīng)體系中 濃度為50mmoI/L時(shí)，酶活兒乎被全部抑制;Zn2 K+、C/+和Al”對(duì)酶的抑制性 僅次于Fe2+,在濃度為50mmol/L時(shí)，酶活分別被抑制成16%、%和； Fe3+ 對(duì)卩-葡萄糖昔酶有一定的抑制作用，而其它金屬離子，如Mg2 Co”、Na+、Ba2 M“2+和Hg2+對(duì)酶活無(wú)明顯的影響。表金屬離子對(duì)卩-葡萄糖昔酶活性的影響化學(xué)試劑濃度相對(duì)酶活力ChemicalCo