朱砂根種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程

1、ICS11.120.01C 23團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/CACM 00X2019朱砂根種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程Technical procedures for cryopreservation of Ardisia crenata Sims seeds2019-0X-0X發(fā)布2019-0X-0X實(shí)施中華中醫(yī)藥學(xué)會 發(fā)布T/CACM 0012019目 次目 次I前言II1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語和定義14 種子的選擇15 種子前處理26 種子保存量27 種子冷凍方式28 恢復(fù)培養(yǎng)2附錄3參考文獻(xiàn)4前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.12009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫給出的規(guī)則起草。

2、本標(biāo)準(zhǔn)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由中華中醫(yī)藥學(xué)會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：曾琳，魏建和，鄭希龍，李榕濤，王秋玲，何明軍，金鉞，顧雅坤，符麗。IIT/CACM 0012019朱砂根種子超低溫保存技術(shù)規(guī)程1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了朱砂根（Ardisia crenata Sims）種子超低溫保存過程中的術(shù)語和定義、種子的選擇、種子前處理、種子保存量、種子冷凍方式、恢復(fù)培養(yǎng)等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于朱砂根種子的超低溫長期貯藏。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是標(biāo)注日期的引用文件，

3、僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 3543.6 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 水分測定GB/T 3543.7 農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 其他項(xiàng)目檢驗(yàn)3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1朱砂根 Ardisia crenata Sims為紫金?？疲∕yrsinaceae）紫金牛屬（Ardisia Swartz）常綠小灌木，果可食，亦可榨油，油可供制肥皂；可供觀賞，在園藝方面的品種亦很多。為民間常用的中草藥之一，根、葉可祛風(fēng)除濕，散瘀止痛，通經(jīng)活絡(luò)，用于跌打風(fēng)濕、消化不良、咽喉炎及月經(jīng)不調(diào)等癥。收載于中國藥典（2015）。3.2 朱

4、砂根果實(shí) Ardisia crenata Sims fruits果實(shí)球形，直徑68 mm，鮮紅色，具腺點(diǎn)。3.3朱砂根種子 Ardisia crenata Sims seeds朱砂根的繁殖材料為完整種子，貯藏特性判斷為頑拗性種子。種子外種皮呈淺棕色、內(nèi)種皮紅棕色，球形，表面光滑有縱條紋，質(zhì)地較軟。3.4種子超低溫保存 seed of cryopreservation 指將經(jīng)過前處理的朱砂根種子置于液氮（-196）中保存。4 種子的選擇4.1 果實(shí)采收10 月至次年4 月，當(dāng)果皮呈暗紅色時(shí)，即可采收，去除果皮和果肉，取出種子。4.2 種子選擇挑選發(fā)育飽滿、均勻、健康的種子為保存材料，置于10種子

5、低溫低濕儲藏柜中保存?zhèn)溆茫ù娣艜r(shí)間不超過2個(gè)月）。5 種子前處理5.1 生活力檢測參照植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)中的溴麝香草酚藍(lán)（BTB）法測定朱砂根種子生活力。待測種子在30 35 溫水中浸種2 h，隨后取吸脹種子20 粒，整齊地埋于備好的瓊脂凝膠中，注意要將胚埋入凝膠中。將培養(yǎng)皿置于35 溫箱中4 h后觀察結(jié)果。5.2 生活力計(jì)算在光下用放大鏡對染色結(jié)果進(jìn)行觀察鑒定。凡種胚周圍出現(xiàn)黃色暈圈的種子為有活力的種子，否則為無活力的種子。計(jì)算：生活力=有活力的種子數(shù)/總的種子數(shù)100%待保存的朱砂根種子生活力應(yīng)70%。5.3 含水量范圍用尼龍網(wǎng)袋包裹朱砂根種子，置于盛有變色硅膠的干燥器內(nèi)，硅膠與種子的體積

6、比為15000:1，室溫條件下干燥處理1055 h，在干燥過程中可定期測定種子含水量，將種子含水量由45%55%降至15%40%。參照GB/T 3543.6中的高恒溫烘干法（130烘干1h）測定種子含水量（W0），W0=（鮮重-絕干重）/鮮重100%。6 種子保存量朱砂根種子保存量不少于360粒，以便后期的活力檢測使用。7 種子冷凍方式朱砂根種子超低溫保存的冷凍方式為玻璃化冷凍法，即將裝有裝載液（LS）和種子的5 mL凍存管（每管60粒種子）置于25 處理種子20 min，再用玻璃化保護(hù)溶液（PVS2）冰浴處理種子30 min，換上預(yù)冷新鮮的PVS2后迅速投入液氮中進(jìn)行超低溫保存。8 恢復(fù)培養(yǎng)

7、8.1 種子解凍處理液氮中至少凍存24 h后，取出1個(gè)凍存管，立即放入40 水浴中快速解凍2 min，而后用洗滌液（DS）浸泡3次，每次5 min，并用純凈水沖洗干凈。8.2 凍后種子生活力檢測取出30粒解凍后的種子，參照5.15.2生活力檢測方法，進(jìn)行超低溫保存后的初始生活力檢測。當(dāng)種子生活力70%時(shí)視為保存成功。8.3 恢復(fù)培養(yǎng)將剩下30粒解凍后的朱砂根種子，播種到帶有無菌濾紙的帶蓋發(fā)芽盒中，溫度25 30 ，濕度70%85%條件下培養(yǎng)。朱砂根種子出芽周期大概1030 d。附錄1 BTB的配制和保存方法精密稱取BTB 0.1 g，溶解于煮沸過的100 mL純水中，然后用濾紙去殘?jiān)?。濾液若呈

8、黃色，可加數(shù)滴氫氧化鈉溶液，使之變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)綠色，此液長期貯存于棕色瓶中。1.5% BTB瓊脂凝膠：稱量0.1% BTB溶液40 mL置于燒杯中，稱取0.5 g瓊脂，將其剪碎后加入杯中，加熱并不斷攪拌使之完全溶解。待溶液稍稍冷卻即可趁熱倒入9 cm培養(yǎng)皿中，使之成一均勻的薄層，完全冷卻后備用。2 裝載液（LS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖13.7 g，稱量甘油11.9 mL，溶于液體MS培養(yǎng)基中，調(diào)pH至5.8后定容至100 mL，高溫高壓滅菌，4 冷藏。3 玻璃化溶液（PVS2）的配制及保存方法精密量取甘油23.8 mL、乙二醇13.6 mL、二甲亞砜13.6 mL，稱取蔗糖13.7 g，溶

9、于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100 mL，高溫高壓滅菌，4 冷藏。注意：配置時(shí)需戴手套，并在通風(fēng)廚內(nèi)操作。4 洗滌液（DS）的配制及保存方法精密稱取蔗糖41.1 g溶于MS溶液中，調(diào)pH至5.8后定容至100 mL，高溫高壓滅菌，4冷藏。參考文獻(xiàn)1 中國植物志委員會.中國植物志第58卷 M. 科學(xué)出版社.2004(1979)：0682 Chen Jie.John J. Pipoly III. Myrsinaceae M /Flora Of China Beijing: Science Press/St. Louis: Missouri Botanical Garden Press. 1996. 15:1-38.3 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典M.北京，中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1384 傅家瑞，宋松泉. 頑拗