第九章 植物胚胎培養(yǎng)與離體受精

1、 l胚胎培養(yǎng)（胚胎培養(yǎng)（embryo culture）是植物組是植物組 織培養(yǎng)的一個(gè)主要領(lǐng)域。植物胚胎培養(yǎng)織培養(yǎng)的一個(gè)主要領(lǐng)域。植物胚胎培養(yǎng) 是指對(duì)植物的胚（種胚）及胚器官（如是指對(duì)植物的胚（種胚）及胚器官（如 子房、胚珠）進(jìn)行人工離體無菌培養(yǎng)，子房、胚珠）進(jìn)行人工離體無菌培養(yǎng)， 使其發(fā)育成幼苗的技術(shù)。使其發(fā)育成幼苗的技術(shù)。 l從離體胚到完整的植株，其發(fā)育途徑有從離體胚到完整的植株，其發(fā)育途徑有3 條：條：1、正常胚胎發(fā)育途徑、正常胚胎發(fā)育途徑 2、脫分化、脫分化 形成愈傷組織形成愈傷組織 3、早熟萌發(fā)產(chǎn)生畸形苗、早熟萌發(fā)產(chǎn)生畸形苗 l1、克服雜種胚的敗育，獲得稀有雜種、克服雜種胚的敗育，獲得

2、稀有雜種 l例：程桂琴等（例：程桂琴等（2000）通過離體胚培養(yǎng)）通過離體胚培養(yǎng) 成功地獲得了纖毛鵝觀草和成功地獲得了纖毛鵝觀草和5個(gè)四倍體小個(gè)四倍體小 麥種（品種）的屬間雜種植株及愈傷組麥種（品種）的屬間雜種植株及愈傷組 織，有效地克服了纖毛鵝觀草和四倍體織，有效地克服了纖毛鵝觀草和四倍體 小麥雜種胚發(fā)育小的問題。小麥雜種胚發(fā)育小的問題。 2、獲得單倍體和多倍體植株、獲得單倍體和多倍體植株 例例1：孫敬三等利用小麥：孫敬三等利用小麥X玉米獲得了小麥玉米獲得了小麥 單倍體。單倍體。 l例例2：伊華林等以柑橘異源四倍體雜種為：伊華林等以柑橘異源四倍體雜種為 父本與單胚的二倍體柑橘類型雜交，通父本

3、與單胚的二倍體柑橘類型雜交，通 過幼胚獲得了三倍體植株。過幼胚獲得了三倍體植株。 2、獲得單倍體和多倍體植株、獲得單倍體和多倍體植株 例例1：孫敬三等利用小麥：孫敬三等利用小麥X玉米獲得了小麥玉米獲得了小麥 單倍體。單倍體。 l例例2：伊華林等以柑橘異源四倍體雜種為：伊華林等以柑橘異源四倍體雜種為 父本與單胚的二倍體柑橘類型雜交，通父本與單胚的二倍體柑橘類型雜交，通 過幼胚獲得了三倍體植株。過幼胚獲得了三倍體植株。 l3、打破種子休眠，促進(jìn)胚萌發(fā)、打破種子休眠，促進(jìn)胚萌發(fā) l例：例：Arrillaga等（等（1992）證明用各種方）證明用各種方 法處理未經(jīng)層積處理的花白蠟完整種子，法處理未經(jīng)層

4、積處理的花白蠟完整種子， 都不能明顯提高種子的發(fā)芽率，但將種都不能明顯提高種子的發(fā)芽率，但將種 子浸泡子浸泡24h后，取出胚進(jìn)行離體的胚培養(yǎng)，后，取出胚進(jìn)行離體的胚培養(yǎng)， 胚萌發(fā)率高達(dá)胚萌發(fā)率高達(dá)90%以上。因此他們認(rèn)為以上。因此他們認(rèn)為 離體胚培養(yǎng)可以解除種子休眠。離體胚培養(yǎng)可以解除種子休眠。 l5、克服種子生活力低下和自然不育性，、克服種子生活力低下和自然不育性， 提高種子發(fā)芽率提高種子發(fā)芽率 l例：例：Musa balbisiana 是商品香蕉的是商品香蕉的1個(gè)個(gè) 野生親緣物種，其種子在自然條件下不野生親緣物種，其種子在自然條件下不 能萌發(fā)，然而通過離體胚的培養(yǎng)很容易能萌發(fā)，然而通過離體

5、胚的培養(yǎng)很容易 產(chǎn)生幼苗產(chǎn)生幼苗 1、胚培養(yǎng)、胚培養(yǎng) （1）成熟胚培養(yǎng)）成熟胚培養(yǎng) （2）幼胚培養(yǎng)）幼胚培養(yǎng) 2、胚珠培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng) 3、子房培養(yǎng)、子房培養(yǎng) 4、胚乳培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng) 5、植物離體受精、植物離體受精 1、胚培養(yǎng)、胚培養(yǎng) （1）成熟胚培養(yǎng)）成熟胚培養(yǎng) （2）幼胚培養(yǎng)）幼胚培養(yǎng) 2、胚珠培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng) 3、子房培養(yǎng)、子房培養(yǎng) 4、胚乳培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng) 5、植物離體受精、植物離體受精 l1.來自同一花粉管的兩個(gè)精子是定向 l還是隨機(jī)運(yùn)動(dòng)到卵細(xì)胞或中央細(xì)胞？ l2.配子之間是否有識(shí)別過程以至特異 l結(jié)合？ l3.配子融合的動(dòng)力學(xué)機(jī)制？ l4.植物如何避免多精入卵問題？ l5.受精對(duì)卵細(xì)胞的

6、激活作用始自何時(shí)？ l通過何種機(jī)制？何種信號(hào)？ l 離體受精（離體受精（IVF） 指在離體環(huán)境中完成指在離體環(huán)境中完成被子植物被子植物的精、卵融合的精、卵融合 而且利用受精所產(chǎn)生的而且利用受精所產(chǎn)生的“離體合子離體合子”培養(yǎng)再生植培養(yǎng)再生植 株，做到整個(gè)受精與胚胎發(fā)育過程完全在離體條株，做到整個(gè)受精與胚胎發(fā)育過程完全在離體條 件下完成。（件下完成。（90年代）年代） 1.1.配子分離配子分離 1) 1) 卵細(xì)胞的分離卵細(xì)胞的分離 酶學(xué)的方法酶學(xué)的方法 直接解剖法直接解剖法 2) 精細(xì)胞的分離精細(xì)胞的分離 滲透壓沖擊法滲透壓沖擊法 機(jī)械分離法機(jī)械分離法 2. 2. 單對(duì)配子融合單對(duì)配子融合 微電

7、融合微電融合 85% 85%融合率，只有此法融合的產(chǎn)物再生了植株。融合率，只有此法融合的產(chǎn)物再生了植株。 高鈣高鈣低低PHPH介導(dǎo)融合介導(dǎo)融合 電融合方法的代替技術(shù)。電融合方法的代替技術(shù)。 一般鈣條件融合一般鈣條件融合 PEGPEG誘導(dǎo)的融合誘導(dǎo)的融合 3. 3. 人工合子的培養(yǎng)人工合子的培養(yǎng) 培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法目前常采用目前常采用微室飼養(yǎng)微室飼養(yǎng)培養(yǎng)培養(yǎng) 將商品生產(chǎn)的微室置入飼養(yǎng)細(xì)胞的小培養(yǎng)皿中，將商品生產(chǎn)的微室置入飼養(yǎng)細(xì)胞的小培養(yǎng)皿中， 培養(yǎng)物接微室內(nèi)，通過室底部微孔濾膜吸取周圍培養(yǎng)物接微室內(nèi)，通過室底部微孔濾膜吸取周圍飼飼 養(yǎng)細(xì)胞養(yǎng)細(xì)胞釋放的活性物質(zhì)，促進(jìn)其發(fā)育。釋放的活性物質(zhì)，促進(jìn)其發(fā)育

8、。 Feeder Cell:Feeder Cell: 未未成熟胚懸浮細(xì)胞或小孢子細(xì)胞成熟胚懸浮細(xì)胞或小孢子細(xì)胞 Feeder CellFeeder Cell促進(jìn)被飼養(yǎng)物生長(zhǎng)的原因：促進(jìn)被飼養(yǎng)物生長(zhǎng)的原因： 1）增加細(xì)胞密度）增加細(xì)胞密度 2）細(xì)胞旺盛分裂或分化過程中產(chǎn)生活性物細(xì)胞旺盛分裂或分化過程中產(chǎn)生活性物 質(zhì)質(zhì) 生長(zhǎng)促進(jìn)因子生長(zhǎng)促進(jìn)因子( (GPF)GPF) （維持細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的）（維持細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的） 1. 為受精生物學(xué)的重要理論問題的探索為受精生物學(xué)的重要理論問題的探索 與解決開辟了新的途徑；與解決開辟了新的途徑； 2. 用于遺傳育種中可以克服自交不親和用于

9、遺傳育種中可以克服自交不親和 性，進(jìn)行作物改良。性，進(jìn)行作物改良。 1. 配子識(shí)別配子識(shí)別判別糖蛋白的作用判別糖蛋白的作用 利用分離的雌、雄配子對(duì)其細(xì)胞膜特征，如表面膜蛋白利用分離的雌、雄配子對(duì)其細(xì)胞膜特征，如表面膜蛋白 特別是糖蛋白的分布等直接進(jìn)行分析，這可以幫助判斷特別是糖蛋白的分布等直接進(jìn)行分析，這可以幫助判斷 糖蛋白在被子植物中是否和在動(dòng)物及低等植物中一樣是糖蛋白在被子植物中是否和在動(dòng)物及低等植物中一樣是 配子識(shí)別必不可少的；配子識(shí)別必不可少的； 2. 膜融合膜融合多精入卵問題的探討多精入卵問題的探討 3. 胞質(zhì)融合胞質(zhì)融合精細(xì)胞質(zhì)全部進(jìn)入卵細(xì)胞精細(xì)胞質(zhì)全部進(jìn)入卵細(xì)胞 4. 核融合核融

10、合融合過程中的信號(hào)問題融合過程中的信號(hào)問題 1. 配子識(shí)別配子識(shí)別判別糖蛋白的作用判別糖蛋白的作用 2. 膜融合膜融合多精入卵問題的探討多精入卵問題的探討 膜融合的方式，在不同的離體受精系統(tǒng)中融合的原理是膜融合的方式，在不同的離體受精系統(tǒng)中融合的原理是 不同的，一種是精細(xì)胞質(zhì)很快進(jìn)入卵細(xì)胞，精細(xì)胞膜作不同的，一種是精細(xì)胞質(zhì)很快進(jìn)入卵細(xì)胞，精細(xì)胞膜作 為其中的一部分參與了受精卵細(xì)胞膜的重組。另一種是為其中的一部分參與了受精卵細(xì)胞膜的重組。另一種是 精細(xì)胞整體進(jìn)入卵細(xì)胞，精細(xì)胞膜并不參與融合產(chǎn)物細(xì)精細(xì)胞整體進(jìn)入卵細(xì)胞，精細(xì)胞膜并不參與融合產(chǎn)物細(xì) 胞膜的形成。胞膜的形成。 3. 胞質(zhì)融合胞質(zhì)融合精細(xì)

11、胞質(zhì)全部進(jìn)入卵細(xì)胞精細(xì)胞質(zhì)全部進(jìn)入卵細(xì)胞 4. 核融合核融合融合過程中的信號(hào)問題融合過程中的信號(hào)問題 1. 配子識(shí)別配子識(shí)別判別糖蛋白的作用判別糖蛋白的作用 2. 膜融合膜融合多精入卵問題的探討多精入卵問題的探討 3. 胞質(zhì)融合胞質(zhì)融合精細(xì)胞質(zhì)全部進(jìn)入卵細(xì)胞精細(xì)胞質(zhì)全部進(jìn)入卵細(xì)胞 體內(nèi)自然受精過程中，至少部分被子植物的精細(xì)胞質(zhì)未體內(nèi)自然受精過程中，至少部分被子植物的精細(xì)胞質(zhì)未 能進(jìn)入卵細(xì)胞；而在離體受精時(shí)，精細(xì)胞質(zhì)則能進(jìn)入卵細(xì)胞；而在離體受精時(shí)，精細(xì)胞質(zhì)則全部全部進(jìn)入進(jìn)入 卵細(xì)胞卵細(xì)胞 。 4. 核融合核融合融合過程中的信號(hào)問題融合過程中的信號(hào)問題 1. 配子識(shí)別配子識(shí)別判別糖蛋白的作用判別糖

12、蛋白的作用 2. 膜融合膜融合多精入卵問題的探討多精入卵問題的探討 3. 胞質(zhì)融合胞質(zhì)融合精細(xì)胞質(zhì)全部進(jìn)入卵細(xì)胞精細(xì)胞質(zhì)全部進(jìn)入卵細(xì)胞 4. 核融合核融合融合過程中的信號(hào)問題融合過程中的信號(hào)問題 核融合一般在精核融合一般在精卵融合后卵融合后35-90min出現(xiàn)出現(xiàn) 。煙草卵細(xì)胞煙草卵細(xì)胞 有明顯的極性即液泡端和胞質(zhì)端，但無論精子在卵細(xì)胞有明顯的極性即液泡端和胞質(zhì)端，但無論精子在卵細(xì)胞 哪一端融合，卵細(xì)胞質(zhì)都可很快地移向精核處將其納入哪一端融合，卵細(xì)胞質(zhì)都可很快地移向精核處將其納入 并包被。并包被。 1. 為受精生物學(xué)的重要理論問題的探索與解決為受精生物學(xué)的重要理論問題的探索與解決 開辟了新的途徑；開辟了新的途徑； 2. 用于遺傳育種中可以克服自交不親和性，進(jìn)用于遺傳育種中可以克服自交不親和性，進(jìn) 行作物改良。行作物改良。 離體受精所能克服的是那些以花粉離體受精所能克服的是那些以花粉柱頭或花粉柱頭或花粉 花柱相互作用為基礎(chǔ)的不親和障礙，并不是萬能的?；ㄖ嗷プ饔脼榛A(chǔ)的不親和障礙，并不是萬能的。 利用離體受精系統(tǒng)研究受精與早期胚胎發(fā)生過程利用離體受精系統(tǒng)研究受精與早期胚胎發(fā)生過程 中