離子通道藥物篩選策略50中國藥科大學(xué)藥物篩選課件

1、離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 1 五、離子通道藥物篩選五、離子通道藥物篩選 (Screening strategies for ion channel targets) I. Introduction Ion Channel Play a central role in human physiology Help regulate cellular ion homostasis Adjust the electrical activity of nerve and muscle cells 3) Control the release of transmitters and

2、hormones. 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 2 Modulation of ion channel activity represents an effective therapeutic strategy for a wide variety of disorders. 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 3 II. Ion channel function Form a narrow aqueous pore spanning the membrane that selectively allows the passage of one or a few

3、 classes of ions, e.g. Na+, K+, Ca2+, or Cl-. 2. They are gated pores, allowing controlled, rather than continuous, ion flux. Gating mechanisms: “l(fā)igand-binding” (ligand-gated), “voltage-dependent mechanism (voltage-gated) 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 4 III. Ion channel-related disease Long-QT syndromes

4、(遺傳性長QT綜合癥） (K+ ) Defects in cardiac K+ channels (occur in only 1 in 15,000 individuals and result in cardiac arrhythmia (心律失常) and sudden death). Deafness （耳聾)、Hyperinsulinemia (高胰島素癥) (K+ ) Cystic fibrosis (囊腫纖維化) 、Myopathies (肌肉病變) (Cl+ ) Hereditary hypertension (遺傳性高血壓) (Na+) Periodic paralysis

5、(周期性癱瘓) (Na+) Malignant hyperthermia (惡性高熱) (Ca2+) 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 5 【相關(guān)報(bào)道】【相關(guān)報(bào)道】 美國兩位科學(xué)家獲美國兩位科學(xué)家獲2003年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 6 IV. Established assay methods Simple blockers or openers, modulatory compounds. Detect modulation of any of the properties: signal conductance, direc

6、tionality, ion selectively, gating dependence on the binding of a ligand or membrane potential, and desensitization 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 7 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 8 六、抗六、抗HIV藥物篩選藥物篩選 艾滋病由一種逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的艾滋病由一種逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的 1 1）19831983年著名的法國巴斯德研究所腫瘤病毒室主任年著名的法國巴斯德研究所腫瘤病毒室主任蒙嗒尼爾蒙嗒尼爾 (Montagnier)(Montagnier)首先

7、從一名患淋巴結(jié)病綜合癥的男性同性戀者的首先從一名患淋巴結(jié)病綜合癥的男性同性戀者的 淋巴結(jié)中分離到一種艾滋病的淋巴結(jié)中分離到一種艾滋病的淋巴結(jié)病相關(guān)病毒淋巴結(jié)病相關(guān)病毒 (Lymphaenopathy Associated Virus)(Lymphaenopathy Associated Virus)簡稱簡稱LAVLAV。 2 2）19841984年美國國立腫瘤研究所的研究人員也報(bào)告從艾滋病病年美國國立腫瘤研究所的研究人員也報(bào)告從艾滋病病 人血液標(biāo)本中分離到多株逆轉(zhuǎn)錄病毒，命名為人血液標(biāo)本中分離到多株逆轉(zhuǎn)錄病毒，命名為嗜人嗜人THTH淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 三型病毒三型病毒(Human T-Lymph

8、otrophic Virus)(Human T-Lymphotrophic Virus)簡稱簡稱HTLV-HTLV-。 這兩種病毒被認(rèn)為是同一種逆轉(zhuǎn)錄病毒的變種，并肯定為引起這兩種病毒被認(rèn)為是同一種逆轉(zhuǎn)錄病毒的變種，并肯定為引起 艾滋病的病原體、把它稱為艾滋病的病原體、把它稱為LAV/LTLV-LAV/LTLV-。 1、HIV簡介簡介 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 9 1986年年7 7月月2525日日，世界衛(wèi)生組織，世界衛(wèi)生組織(WHO)(WHO)發(fā)布公報(bào)，發(fā)布公報(bào)， 國際病毒分類委員會(huì)會(huì)議決定，將艾滋病病毒改國際病毒分類委員會(huì)會(huì)議決定，將艾滋病病毒改 稱為稱為人類免疫缺陷

9、病毒人類免疫缺陷病毒 (Hmuan Immunodeficiency Virus) (Hmuan Immunodeficiency Virus) 簡稱簡稱HIVHIV。 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 10 HIV呈袋狀球形，直徑約呈袋狀球形，直徑約150毫微米，包膜由一薄層毫微米，包膜由一薄層 類脂質(zhì)構(gòu)成，具有抗原性。類脂質(zhì)構(gòu)成，具有抗原性。HIV有有10%堿基序列不同。堿基序列不同。 是是單鏈單鏈RNA病毒病毒，外有核殼蛋白，此外還有一種特殊，外有核殼蛋白，此外還有一種特殊 的逆轉(zhuǎn)錄酶，能以單鏈的逆轉(zhuǎn)錄酶，能以單鏈RNA作為模塊，轉(zhuǎn)錄為雙鏈作為模塊，轉(zhuǎn)錄為雙鏈 DNA，該雙

10、鏈，該雙鏈DNA可與宿主細(xì)胞的可與宿主細(xì)胞的DNA結(jié)合然后逆結(jié)合然后逆 轉(zhuǎn)錄為病毒的單鏈轉(zhuǎn)錄為病毒的單鏈DNA，因此，因此感染艾滋病病毒后，病感染艾滋病病毒后，病 毒的核酸永遠(yuǎn)與宿主細(xì)胞結(jié)合在一起，使得感染不能毒的核酸永遠(yuǎn)與宿主細(xì)胞結(jié)合在一起，使得感染不能 消失，機(jī)體無法清除病毒。消失，機(jī)體無法清除病毒。 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 11 NC：核殼蛋白：核殼蛋白 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 12 HIV picture 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 13 HIV由皮膚破口或粘膜進(jìn)入人體血液，主要攻擊和破壞的由皮膚破口或粘膜進(jìn)入人體血液

11、，主要攻擊和破壞的 靶細(xì)胞靶細(xì)胞T4淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞(T4淋巴細(xì)胞在細(xì)胞免疫系統(tǒng)中起著中淋巴細(xì)胞在細(xì)胞免疫系統(tǒng)中起著中 心調(diào)節(jié)作用，它能促進(jìn)心調(diào)節(jié)作用，它能促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體細(xì)胞產(chǎn)生抗體)，使得，使得T4細(xì)胞失細(xì)胞失 去原有的正常免疫功能。當(dāng)激活免疫反應(yīng)的去原有的正常免疫功能。當(dāng)激活免疫反應(yīng)的T4細(xì)胞幾乎細(xì)胞幾乎 全部被全部被HIV消除，消除，T4細(xì)胞抑制細(xì)胞在數(shù)量上巨增，相反病細(xì)胞抑制細(xì)胞在數(shù)量上巨增，相反病 人體內(nèi)人體內(nèi)T4細(xì)胞在數(shù)量上驟減，從而導(dǎo)致病人的免疫功能細(xì)胞在數(shù)量上驟減，從而導(dǎo)致病人的免疫功能 全部衰竭，為條件性感染創(chuàng)造了極為有利的條件。全部衰竭，為條件性感染創(chuàng)造了極為有利的條件

12、。 HIV是嗜是嗜T4淋巴細(xì)胞和嗜神經(jīng)細(xì)胞的病毒。淋巴細(xì)胞和嗜神經(jīng)細(xì)胞的病毒。 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 14 The Threat of HIV/AIDS in China According to figures from the Ministry of Public Health, around 850,000 people in China have been infected by the HIV virus since the deadly disease was first detected in the country in 1985. The total

13、 number of people to develop full- blown AIDS is estimated to have reached around 200,000, only 80,000 and 100,000 of whom are still alive, hiding their conditions for fear of discrimination and unable to afford AIDS drugs. 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 15 In the first half of 2002, reported cases of HIV

14、infection rose in China at a rate of 16.7% compared with the same period of 2001. The World Health Organization has warned that China could have over 10 million HIV/AIDS carriers by the year 2010 if no efficient measures to counter the spread of the disease are taken. According to the Ministry of He

15、alth, the sharing of needles among intravenous drug users caused 68 percent of confirmed HIV cases, while unclean blood collecting and transfusions are responsible for 9.7 percent. Another 7.2 percent of HIV carriers contracted the disease through unsafe or unprotected sex. 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 1

16、6 The central governments budget for the prevention of AIDS has increased from 15 million yuan in 2001 to 100 million yuan. A total of 1.25 billion yuan in national bonds has been issued to strengthen supervision of the construction of blood banks in western regions of China, where more people have

17、HIV than in other parts of the country。 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 17 2、HIV life cycle 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 18 3 3、抗、抗HIVHIV藥物設(shè)計(jì)與篩選藥物設(shè)計(jì)與篩選 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 19 1 1）病毒與靶細(xì)胞結(jié)合阻止劑）病毒與靶細(xì)胞結(jié)合阻止劑 （ HIV-gp41, CD4）(invasion) 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 20 HIVHIV與靶細(xì)胞膜表面的與靶細(xì)胞膜表面的CD4CD4受體結(jié)合。受體結(jié)合。 該類藥物設(shè)計(jì)的著眼點(diǎn)放在特

18、異性作用于病毒蛋白（尤其該類藥物設(shè)計(jì)的著眼點(diǎn)放在特異性作用于病毒蛋白（尤其 是被膜蛋白）或靶細(xì)胞是被膜蛋白）或靶細(xì)胞T4T4抗原，病毒結(jié)合位點(diǎn)以及能干擾抗原，病毒結(jié)合位點(diǎn)以及能干擾 病毒被膜的完整上。病毒被膜的完整上。 HIVHIV病毒利用其表面的病毒利用其表面的gp160gp160蛋白辨認(rèn)宿主細(xì)胞膜。蛋白辨認(rèn)宿主細(xì)胞膜。 gp160gp160蛋白由蛋白由gp120gp120與與gp41gp41組成。（組成。（gp120gp120功能為辨認(rèn)，功能為辨認(rèn)， gp41gp41功能為伸入宿主細(xì)胞膜，結(jié)合病毒細(xì)胞膜）。功能為伸入宿主細(xì)胞膜，結(jié)合病毒細(xì)胞膜）。 利用藥物抑制利用藥物抑制gp41gp41的

19、作用，也是目前的一種治療方法。的作用，也是目前的一種治療方法。 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 21 藥物篩選策略藥物篩選策略 尋找特異性結(jié)合尋找特異性結(jié)合 gp41,gp120, CD4蛋白的化合物蛋白的化合物 “第三者第三者”插插 足？足？ SPR 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 22 Virus adsorption (gp 120) inhibitors 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 23 Virus adsorption (gp 120) inhibitors 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 24 Viral fusi

20、on (gp 41) inhibitors 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 25 2 2） HIVHIV病毒逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑病毒逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 (HIV-RT)(HIV-RT)(replication)(replication) 病毒進(jìn)入靶細(xì)胞后，其逆轉(zhuǎn)錄酶病毒進(jìn)入靶細(xì)胞后，其逆轉(zhuǎn)錄酶RT是催化產(chǎn)生正鏈?zhǔn)谴呋a(chǎn)生正鏈DNA共聚物共聚物 的關(guān)鍵。因此，該類藥物設(shè)計(jì)的最佳靶點(diǎn)為逆轉(zhuǎn)錄酶。目前批的關(guān)鍵。因此，該類藥物設(shè)計(jì)的最佳靶點(diǎn)為逆轉(zhuǎn)錄酶。目前批 準(zhǔn)上市的五個(gè)藥物均基于這一著眼點(diǎn)，但它們均屬于核甙類化準(zhǔn)上市的五個(gè)藥物均基于這一著眼點(diǎn)，但它們均屬于核甙類化 學(xué)藥物，毒副作用大，選擇性不

21、高，且有耐藥菌珠出現(xiàn)，故都學(xué)藥物，毒副作用大，選擇性不高，且有耐藥菌珠出現(xiàn)，故都 面臨被淘汰的危險(xiǎn)。面臨被淘汰的危險(xiǎn)。因此，具有選擇性高的非核甙類因此，具有選擇性高的非核甙類RT抑制劑抑制劑 是未來抗是未來抗HIV藥物的研究熱點(diǎn)之一。藥物的研究熱點(diǎn)之一。 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 26 HIV逆轉(zhuǎn)錄酶（逆轉(zhuǎn)錄酶（HIV RT)基本特征基本特征 RT是由是由p66和和p51兩個(gè)亞基組成的異源二聚體，兩兩個(gè)亞基組成的異源二聚體，兩 亞基亞基N端序列相同，端序列相同，p51比比p66缺少了缺少了C端的端的Rnase H 活性區(qū)活性區(qū) RT從結(jié)構(gòu)上分為聚合酶活性區(qū)和從結(jié)構(gòu)上分為聚

22、合酶活性區(qū)和Rnase H 區(qū)兩個(gè)區(qū)兩個(gè) domain，前者又分為，前者又分為 4 subdomains-finger， palm, thumb, connection 兩個(gè)兩個(gè)domain對(duì)應(yīng)對(duì)應(yīng)RT的兩種不同酶活性：的兩種不同酶活性：RNA- or DNA- dependent DNA polymerase activity 和和 ribonuclease (Rnase) H activity 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 27 p66-in color; p51-in gray 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 28 RT的功能的功能 RT在在HIV病毒生

23、活史中將病毒生活史中將HIV的單鏈的單鏈RNA基基 因組反轉(zhuǎn)成為雙鏈因組反轉(zhuǎn)成為雙鏈DNA RT是治療是治療AIDS的重要靶標(biāo)，抑制的重要靶標(biāo)，抑制RT的活性成的活性成 為為AIDS治療的主要手段治療的主要手段 目前的藥物主要針對(duì)目前的藥物主要針對(duì)RT的聚合酶活性的聚合酶活性 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 29 篩選篩選RT抑制劑的方法抑制劑的方法 同位素應(yīng)用的方法同位素應(yīng)用的方法 有較大的局限性有較大的局限性 非同位素方法非同位素方法 比色法比色法Colorometry 熒光法熒光法Fluorescence 發(fā)光法發(fā)光法Luminescence 時(shí)間分辨熒光時(shí)間分辨熒光 H

24、TRF(homogeneous time- resolved fluorescence) 閃爍親和測(cè)定閃爍親和測(cè)定(scintillation proximity assay,SPA) SPR 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 30 RT主要的抑制劑主要的抑制劑 RT抑制劑分為兩類抑制劑分為兩類 Nucleoside RT inhibitors (NRTIs)核苷類核苷類: 10 個(gè)上市個(gè)上市-AZT, Ziagen, Epivir, Viread, Trizivir, Combivir, Zerit, Videx EC, HIVID, Retrovir Nonnucleosid

25、e RT inhibits (NNRTIs)非核非核 苷類：苷類： 3 個(gè)上市個(gè)上市-Rescriper, Sustiva, Viramune 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 31 NNRTI非核苷類抑制劑與非核苷類抑制劑與RT結(jié)合示意圖結(jié)合示意圖 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 32 3 3） HIV-HIV-整合酶抑制劑篩選整合酶抑制劑篩選 (HIV-Integrase)(HIV-Integrase) 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 33 整合酶的基本功能、性質(zhì)整合酶的基本功能、性質(zhì) HIV 整合酶（整合酶（Integrase,IN) ： H

26、IV 第三酶第三酶 HIV病毒病毒pol基因基因3 端編碼端編碼 32KDal 三個(gè)結(jié)構(gòu)域（晶體結(jié)構(gòu)均已解析）三個(gè)結(jié)構(gòu)域（晶體結(jié)構(gòu)均已解析） 基本功能：基本功能： 催化病毒復(fù)制基本步驟病毒雙鏈催化病毒復(fù)制基本步驟病毒雙鏈DNA 整合到宿主整合到宿主DNA 作為治療作為治療AIDS靶標(biāo)優(yōu)點(diǎn)：靶標(biāo)優(yōu)點(diǎn)： 人體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)該酶類似物人體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)該酶類似物 B A C 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 34 病毒雙鏈病毒雙鏈DNA 整合到宿主整合到宿主DNA 整合酶作用部位整合酶作用部位 1. 形成整合酶、病毒形成整合酶、病毒DNA復(fù)合物復(fù)合物 2. 剪切病毒剪切病毒DNA 3 末端末端

27、 3. 轉(zhuǎn)移病毒轉(zhuǎn)移病毒DNA 4. 剪切細(xì)胞剪切細(xì)胞DNA 5. 連接病毒連接病毒DNA 和細(xì)胞和細(xì)胞DNA 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 35 藥物篩選方法藥物篩選方法 SPA: Scintillation Proximity Assay SPA Bead 3H L-731,988 DNA FLAG-integrase Biotinylated anti-FLAG antibody Amy S. Espeseth et al. (2000) PNAS SPA Bead 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 36 主要抑制劑主要抑制劑 Diketo acids 類

28、類 L-731,988. Ryan Reinke et al (2002) A.A.C. Daria J. Hazuda et al (2000) science 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 37 4 4） Drug Screening based on Drug Screening based on Interaction of CypA and HIV capsid 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 38 Packaging of cyclophilin A (CypA) into HIV-1 virions is essential for effici

29、ent replication. Incorporation of CypA into viral particles is mediated through binding to the Gly-89-Pro-90 peptide bond of the N- terminal domain of HIV-1 capsid (CAN) at a CypA: CA ration of about 1:10 . 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 39 Identification of resides within CAN that change in chemical shift

30、 on binding and catalysis by CypA. CypA (blue) is shown bound to the flexible loop between Pro-85 and Pro-93 of CAN (yellow). Backbone amides of CAN that shift on CypA binding by more than 14Hz are highlight in red. Proline within CAN(1- 146) are shown in green. 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 40 Disruption

31、 of CypA incorporation into HIV-1 virions by CSA correlates with inhibition of HIV-1 DNA synthesis Jurkat cells were infected with viral stocks produced in the presence of 0,0.5,2.5uM CSA,as indicated. Virions were pelleted from drug-containing medium and used to infect cells in the absence of the d

32、rug. PCR was performed and phosphorImager quantitation of products shown . 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 41 七、七、 基于基于COXCOX2/5-LOX2/5-LOX為靶點(diǎn)的為靶點(diǎn)的 抗炎藥物篩選抗炎藥物篩選 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 42 炎癥反應(yīng)炎癥反應(yīng) 被 多 種 炎 癥 介 質(zhì) 所 介 導(dǎo) ， 其 中被 多 種 炎 癥 介 質(zhì) 所 介 導(dǎo) ， 其 中 花 生 四 烯 酸花 生 四 烯 酸 （Arachidonic Acid，AA）的代謝產(chǎn)物）的代謝產(chǎn)物前列腺素前列腺素

33、（PGs）和）和白三烯白三烯（LTs）是其中重要的兩個(gè)炎癥介）是其中重要的兩個(gè)炎癥介 質(zhì)。質(zhì)。 離子通道藥物篩選策略50中國藥科 大學(xué)藥物篩選 43 Arachidonic acid cox-2 COX-1 PGH2 PGI2 PGE2 PGD2 PGF 2 TxA2 LTs 5-LOX PLA2 膜磷酸酯經(jīng)由磷酸酯膜磷酸酯經(jīng)由磷酸酯A2(PLA2)產(chǎn)生游離的花生四烯酸產(chǎn)生游離的花生四烯酸(AA), 環(huán)加氧酶環(huán)加氧酶(COX- 1和和COX-2) 將將AA轉(zhuǎn)化為前列腺素轉(zhuǎn)化為前列腺素G2 (PG2), 接著將其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為前列腺素接著將其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為前列腺素 H2(PGH2), 組織特異性的同功酶將組織特異性的同功酶將PGH2代謝為前列