TRIzol中文說明書.doc

1、TRIzol2-8 避光保存產(chǎn)品包裝： 100ml 藍色透明液體產(chǎn)品簡介：TRIzol 試劑適用于從細胞和組織中快速分離 RNA。 TRIzol 試劑有多組分分離作用,TRIzol 使樣品勻漿化， 細胞裂解，溶解細胞內(nèi)含物， 同時保持 RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機相， RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收 RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機相可回收蛋白質(zhì)。TRIzol 試劑可用于小量樣品（50100mg組織、 5 106 細胞）也適用于大量樣品7（ 1g 組織、 10 細胞）。對人，動物，植物組織，細菌均適用，整個提取過程在一小時內(nèi)即可完成。分

2、離的總RNA無蛋白質(zhì)和DNA污染，可用于Northernblot，dotblot， ployA 篩選，體外翻譯，RNase保護分析和分子克隆。在用于 RT-PCR時如果兩條引物存在于一個單一外顯子內(nèi)，建議用無RNase的DNase處理 RNA樣品，避免出現(xiàn)假陽性。共純化的DNA可用作標準，比較不同樣品 RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白質(zhì)可用于westernblotting。注意事項 ：請勿直接接觸皮膚或吞咽，以免灼傷。如接觸皮膚應立即用洗滌劑和大量水沖洗。忌用乙醇擦洗，乙醇會加重灼傷。預防 RNase污染注意事項 ：1經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細菌，霉菌可能成為RNase的來源。2

3、使用滅過菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。3RNA在 TRIzol 試劑中時不會被 RNase污染，但提取后繼續(xù)處理過程中應使用不含 RNase的塑料和玻璃器皿。 玻璃器皿可在 150烘烤 4 小時，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡 10 分鐘，然后用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除RNase。4配制溶液應使用無RNase的水（將水加入處理過不含RNase的玻璃瓶中，加入 DEPC至終濃度 0.01 v/v, 放置過夜 , 高壓滅菌。注： DEPC有致癌之嫌，需小心操作。）RNA的提取準備試劑 ：氯仿，異丙醇，75乙醇，無 RNase的水或 0.5 SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制

4、)操作步驟 :1. 勻漿處理 :a. 組織將組織在液氮中磨碎 , 每 50-100mg組織加入 1mlTRIzol, 用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積 10。b. 單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入2面TRIzol 裂解細胞， 每 10cm積加 1ml，用移液器吸打幾次。 TRIzol 的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。 TRIzol 加量不足可能導致提取的 RNA有 DNA污染。c細胞懸液離心收集細胞，每5-10 106 動物、植物、酵母細胞或1107 細菌細胞加入 1mlTRIzol ，反復吸打。加 TRIzol 之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌

5、細胞需用勻漿儀處理。2將勻漿樣品在室溫（15-30 ）放置 5 分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。3可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8 10000 g 離心 10 分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。5. 每使用 1mlTRIzol 加入 0.2ml 氯仿，劇烈振蕩 15 秒，室溫放置 3 分鐘。6.2-8 10000g 離心 15 分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約

6、為所用TRIzol 試劑的 60。7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中（如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相），用異丙醇沉淀水相中的 RNA。每使用 1mlTRIzol加入 0.5ml 異丙醇，室溫放置10 分鐘。8.2-8 10000g 離心 10 分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。9. 用 75乙醇洗滌 RNA沉淀。每使用 1mlTRIzol 至少加 1ml75乙醇。 2-8 不超過 7500g 離心 5 分鐘，棄上清。10. 室溫放置干燥或真空抽干 RNA沉淀，不要晾得過干，否則不易溶解，大約晾5-10 分鐘。加入 25-200 l 無 RNase的水或 0.5

7、SDS,用槍頭吸打幾次 ,55-60 放置 10 分鐘使 RNA溶解 . 如 RNA用于酶切反應 , 勿使用 SDS溶液。RNA也可用 100的去離子甲酰胺溶解，-70 保存。注意事項：1. 從少量樣品（ 1-10mg 組織或 102-10 4 細胞）中提取 RNA是可加入少許糖原以促進 RNA沉淀。例如加 800mlTRIzol 勻漿樣品， 沉淀 RNA前加 5-10 gRNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml 是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。2勻漿后加氯仿之前樣品可在-60 -70 保存至少一個月。RNA沉淀可保存在75%酒精中 2-8 一

8、個星期以上或-5-20 一年以上。3分層和 RNA沉淀時也可使用低速臺式離心機，2600 g 離心 30-60 分鐘。預期產(chǎn)量： 1mg組織或 1 106 細胞提取 RNA分別為：肝和脾 6-10 g, 腎 3-4 g, 骨骼肌和腦組織1-1.5 g, 胎盤 1-4 g, 上皮細胞8-15 g, 成纖維細胞5-7 g.常見問題分析：得率低： A. 樣品裂解或勻漿處理不徹底BRNA沉淀未完全溶解A260/A 28012000g 離心 10 分鐘除去。DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水測A260 值。一單位A260 值相當于50g/ml 雙鏈 DNA。根據(jù)細胞含 DNA的量分別為D

9、NA產(chǎn)量可估計細胞數(shù)，人，大鼠，小鼠 7.1 g,6.5 g,5.8 g。1 106 二倍體預期產(chǎn)量： 1mg組織或 1 106 細胞提取 DNA分別為肝和腎 3-4 g 骨骼肌，腦組織，胎盤 2-3 g 人，大鼠，小鼠培養(yǎng)細胞（ 1 106）5-7 g, 成纖維細胞 5-7 g應用：1. 用于 PCR溶于 8mMNaOH的 DNA用 0.1MHEPES調(diào) pH至 8.4, 取 0.1-1 gDNA用作模板。2. 酶切反應用 HEPES或 1mMEDTA調(diào)節(jié) pH至適當值。每 gDNA使用 3-5 單位的酶，80-90%的 DNA是可消化的。1ml8mMNaOH溶解的 DNA樣品 pH值調(diào)節(jié)：

10、Final pH0.1M HEPES( l)Final pH1M HEPES( l)8.4867.2238.2937.0328.01017.81177.5159注意事項：1.DNA在中間層和有機相中時可在2-8 保存過夜。2 DNA沉淀在 75%乙醇中 2-8 可保存幾個月。3DNA在 8mMNaOH溶液中 4可放置過夜， 如長期保存需用HEPES調(diào)節(jié) pH至 7-8并且加 EDTA至 1mM可置于 4或 -20 長期保存。常見問題分析：得率低： A. 樣品勻漿和裂解的不徹底B最終得到的DNA沉淀沒有完全溶解A260/A 2801.70 ： A. 檢測吸光度時， RNA樣品沒有溶于水，而溶于了

11、TE中B酚除去的不徹底，可用0.1M 檸檬酸鈉（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。DNA降解： A. 組織取出后沒有馬上處理或冷凍B. 待提取 RNA的樣品沒有保存于-60 至 -70 , 而保存在了 -5 至 -20 C樣品勻漿時使用了高速勻漿儀RNA污染： A. 氯仿分層后水相去除的不干凈B DNA沉淀用 0.1M 檸檬酸鈉（含 10%乙醇）洗的不徹底蛋白質(zhì)的提取準備試劑： 異丙醇含 0.3M 鹽酸胍的 95%乙醇無水乙醇 1%SDS 操作步驟：1. 取沉淀 DNA后剩余的上清， 用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。 每使用 1mlTRIzol 加 1.5ml異丙醇，室溫放置10 分鐘， 2-8 12000 g 離心 10 分鐘棄上清。2用含 0.3M 鹽酸胍的 95%乙醇洗滌蛋白質(zhì)沉淀。每使用 1mlTRIzol 加 2ml 洗滌液，室溫放置20 分鐘， 2-8 7500 g 離心 5 分鐘，棄上清，重復兩次。用2ml無水乙醇同樣方法再洗一次。3真空抽干蛋白質(zhì)沉淀5-10 分鐘，用 1%SDS溶解蛋白質(zhì)，反復吸打，50溫浴使其完全溶解，不溶物2-8 10000g 離心 10 分鐘除去。分離得到的蛋白質(zhì)樣品可用于 Westernblot或 -5-20 保存?zhèn)溆?。注意事項?. 蛋白質(zhì)沉淀可保存