雙脫氧末端終止測序法原理_過程和目標基因cDNA序列拼接和分析

1、1 雙脫氧末端終止法測序的原理、雙脫氧末端終止法測序的原理、 過程和目標基因序列的分析過程和目標基因序列的分析 教教 師：程師：程 琳琳 2011 年年 11 月月 分子生物學實驗分子生物學實驗 2 實實 驗驗 目目 的的 1、通過本實驗了解雙脫氧鏈終止法的基本原、通過本實驗了解雙脫氧鏈終止法的基本原 理，掌握理，掌握DNA測序的基本方法；測序的基本方法； 2、學會序列查詢、核酸及蛋白質的同源性搜、學會序列查詢、核酸及蛋白質的同源性搜 索和比對。索和比對。 3 DNA測序技術主要有兩種方法，都是在測序技術主要有兩種方法，都是在20世世 紀紀70年代中期發(fā)明的。年代中期發(fā)明的。 A. 雙脫氧鏈終

2、止法雙脫氧鏈終止法（the chain termination method），是通過），是通過合成合成與單鏈與單鏈DNA互補的多核苷互補的多核苷 酸鏈來讀取待測酸鏈來讀取待測DNA分子的順序分子的順序。 B. 化學降解法化學降解法（chemical degradation method），）， 是將雙鏈是將雙鏈DNA分子用化學試劑處理，分子用化學試劑處理，產(chǎn)生切口產(chǎn)生切口， 用同位素標記進行測序。用同位素標記進行測序。 一、一、DNA測序的方法測序的方法 4 1. Sanger雙脫氧鏈終止法測序原理雙脫氧鏈終止法測序原理 利用利用DNA聚合酶和聚合酶和 雙脫氧鏈終止物測定雙脫氧鏈終止物測定

3、DNA核苷酸順序的方法，核苷酸順序的方法， 是由英國劍橋分子生物是由英國劍橋分子生物 學實驗室的生物化學家學實驗室的生物化學家 F. Sanger等人于等人于1977年年 發(fā)明的。發(fā)明的。 5 基本原理：基本原理： 聚丙烯酰胺凝膠電泳可以聚丙烯酰胺凝膠電泳可以 區(qū)分長度只差一個核苷酸的區(qū)分長度只差一個核苷酸的 DNA分子；分子； 利用利用DNA聚合酶不能夠區(qū)聚合酶不能夠區(qū) 分分dNTP和和ddNTP的特性，的特性， 使使ddNTP參入到寡核苷酸鏈參入到寡核苷酸鏈 的的3-末端。因為末端。因為ddNTP 3不不 是是-OH，不能與下一個核苷，不能與下一個核苷 酸聚合延伸，從而終止酸聚合延伸，從而

4、終止DNA 鏈的增長。鏈的增長。 6 7 2、具體操作：具體操作： 測序時分成四個反應測序時分成四個反應, 每個反應除上述成分外每個反應除上述成分外 分別加入分別加入2,3-雙脫氧的雙脫氧的A, C, G, T核苷三磷酸（稱核苷三磷酸（稱 為為ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后進行聚然后進行聚 合反應。在第一個反應中合反應。在第一個反應中, ddATP會隨機地代替會隨機地代替 dATP參加反應，一旦參加反應，一旦ddATP加入了新合成的加入了新合成的 DNA鏈，由于其第鏈，由于其第3位的位的-OH變成了變成了-H, 所以不能所以不能 繼續(xù)延伸繼續(xù)延伸,于是第一個反應中

5、所產(chǎn)生的于是第一個反應中所產(chǎn)生的DNA鏈都是鏈都是 到到A就終止了。就終止了。 8 同理第二個反應產(chǎn)生的都是以同理第二個反應產(chǎn)生的都是以C結結 尾的尾的; 第三個反應的都以第三個反應的都以G結尾結尾, 第四個第四個 反應的都以反應的都以T結尾結尾, 電泳后就可以讀出序電泳后就可以讀出序 列了列了. 9 假如有一個假如有一個DNA, DNA, 互補序列是互補序列是GATCCGAT, GATCCGAT, 我們試著做一下我們試著做一下: : 在第一個反應中由于含有在第一個反應中由于含有dNTP + ddATP, 所以遇到所以遇到G, T, C 三個堿基時沒什么問題三個堿基時沒什么問題, 但遇到但遇到

6、A時時, 摻入的可能是摻入的可能是dATP或或 ddATP, 比如已合成到比如已合成到G, 下一個如果參與反應的是下一個如果參與反應的是ddATP則終則終 止止, 產(chǎn)生一個僅有產(chǎn)生一個僅有2個核苷酸的序列個核苷酸的序列: GA, 否則繼續(xù)延伸否則繼續(xù)延伸, 可以可以 產(chǎn)生序列產(chǎn)生序列GATCCG, 又到了下一個又到了下一個A了了. 同樣有兩種情況同樣有兩種情況, 如果如果 是是ddATP摻入摻入, 則產(chǎn)生的序列是則產(chǎn)生的序列是GATCCGA, 延伸終止延伸終止, 否則可否則可 以繼續(xù)延伸以繼續(xù)延伸, 產(chǎn)生產(chǎn)生GATCCGAT. 將得到如下結果：將得到如下結果： 1 產(chǎn)生的都是以產(chǎn)生的都是以A

7、A結尾的片段結尾的片段: GA,GATCCGA: GA,GATCCGA。 2 3 4 產(chǎn)生的都是以產(chǎn)生的都是以C C結尾的片段結尾的片段: GATC, GATCC: GATC, GATCC 產(chǎn)生的都是以產(chǎn)生的都是以G G結尾的片段結尾的片段: G, GATCCG: G, GATCCG 產(chǎn)生的都是以產(chǎn)生的都是以T T結尾的片段結尾的片段: GAT, GATCCGAT: GAT, GATCCGAT 10 制得的四組混合制得的四組混合 物全部平行地點加在物全部平行地點加在 變性聚丙烯酸受凝膠變性聚丙烯酸受凝膠 電泳板上進行電泳，電泳板上進行電泳， 每組制品中的各個組每組制品中的各個組 分將按其鏈長的

8、不同分將按其鏈長的不同 得到分離，從而制得得到分離，從而制得 相應的放射性自顯影相應的放射性自顯影 圖譜。從所得圖譜即圖譜。從所得圖譜即 可直接讀得可直接讀得DNADNA的堿的堿 基序列?；蛄?。 即可得到測序結果：為即可得到測序結果：為GATCCGAT 11 制備單鏈模板制備單鏈模板 將單鏈模板與一小段引物退火將單鏈模板與一小段引物退火 加入加入DNA多聚酶多聚酶4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸 分別加入少量分別加入少量4種雙脫氧核苷酸種雙脫氧核苷酸 將將4種反應產(chǎn)物分別在種反應產(chǎn)物分別在4條泳道電泳條泳道電泳 根據(jù)根據(jù)4個堿基在個堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列條泳道的終止位置讀出基因序列

9、3、技術路線：技術路線： 12 4、 高通量自動化測序高通量自動化測序 DNA 序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容，一序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容，一 方面是指方面是指“分析反應分析反應”的自動化，另一方面是指的自動化，另一方面是指 “讀片過程讀片過程”的自動化。的自動化。 自動化的自動化的DNA 序列分析，也是根據(jù)序列分析，也是根據(jù)Sanger 雙雙 脫氧鏈終止脫氧鏈終止DNA測序法的基本原理發(fā)展起來的。測序法的基本原理發(fā)展起來的。 13 自動化測序原理自動化測序原理 自動化測序類似于自動化測序類似于PCR反應，反應， 但只用一條引物，反應混合物中但只用一條引物，反應混合物中 含有不同熒光

10、標記的含有不同熒光標記的ddNTP與與4 種種dNTP。由于每種。由于每種ddNTP帶有帶有 各自特定的熒光顏色各自特定的熒光顏色,而簡化為而簡化為 由由1個泳道同時判讀個泳道同時判讀4種堿基。產(chǎn)種堿基。產(chǎn) 物條帶經(jīng)過檢測儀時給出特定信物條帶經(jīng)過檢測儀時給出特定信 號，由計算機判讀并記錄。號，由計算機判讀并記錄。 優(yōu)點優(yōu)點 ：可用雙鏈：可用雙鏈DNA做模板；做模板； 模板用量少，不必克隆；可實現(xiàn)模板用量少，不必克?。豢蓪崿F(xiàn) 高通量自動化。高通量自動化。 14 高速自動高速自動DNA測序儀的結構及工作原理測序儀的結構及工作原理 由激光發(fā)射器產(chǎn)生的激由激光發(fā)射器產(chǎn)生的激 光束，通過精密的光學系統(tǒng)光

11、束，通過精密的光學系統(tǒng) 后被導向凝膠表面的檢測區(qū)。后被導向凝膠表面的檢測區(qū)。 在此，激光束垂直射向凝膠，在此，激光束垂直射向凝膠， 同經(jīng)過檢測孔的同經(jīng)過檢測孔的DNA片段片段 發(fā)生作用，并提供能量激發(fā)發(fā)生作用，并提供能量激發(fā) 熒光發(fā)色基團發(fā)射出具特異熒光發(fā)色基團發(fā)射出具特異 性波長的熒光。這些熒光通性波長的熒光。這些熒光通 過聚焦鏡集中后傳給濾光鏡過聚焦鏡集中后傳給濾光鏡 /棱鏡組件，以便四種堿基棱鏡組件，以便四種堿基 產(chǎn)生的不同標記波長區(qū)別開產(chǎn)生的不同標記波長區(qū)別開 來。經(jīng)成像透像最后由高靈來。經(jīng)成像透像最后由高靈 敏度的相機分段收集信號，敏度的相機分段收集信號， 傳送給計算所分析處理。傳送

12、給計算所分析處理。 15 熒光化合物標記熒光化合物標記 鏈終止法以熒光顏色鏈終止法以熒光顏色 為標記信號，每種為標記信號，每種 ddNTP各有各有1種代表種代表 顏色；整個反應在一顏色；整個反應在一 個試管中進行；當新個試管中進行；當新 合成的終止單鏈通過合成的終止單鏈通過 熒光監(jiān)測儀時，可由熒光監(jiān)測儀時，可由 光信號讀出末端核苷光信號讀出末端核苷 酸并由電腦記錄。酸并由電腦記錄。 16 17 Sanger雙脫氧鏈終止雙脫氧鏈終止DNA測序法的測序能力：測序法的測序能力： 手工測序：最大約手工測序：最大約300 bp； 自動測序：最大約自動測序：最大約1200 bp。 18 二、序列比對分析二

13、、序列比對分析 1. 相似性與同源性相似性與同源性 相似性相似性(similarity)： 是指一種很直接的是指一種很直接的數(shù)量關系數(shù)量關系，比如部分相同或，比如部分相同或 相似的百分比或其它一些合適的度量。比如說，相似的百分比或其它一些合適的度量。比如說，A 序列和序列和B序列的相似性是序列的相似性是80，或者，或者4/5。這是個量。這是個量 化的關系。當然可進行自身局部比較?；年P系。當然可進行自身局部比較。 19 同源性同源性(homology)： 指從一些數(shù)據(jù)中推斷出的兩個基因或蛋白指從一些數(shù)據(jù)中推斷出的兩個基因或蛋白 質序列具而共同祖先的結論，屬于質序列具而共同祖先的結論，屬于質的判

14、斷質的判斷。 就是說就是說A和和B的關系上，只有是同源序列，或的關系上，只有是同源序列，或 者非同源序列兩種關系。而說者非同源序列兩種關系。而說A和和B的同源性的同源性 為為80都是不科學的。都是不科學的。 20 序列的相似性和序列的同源性有一定的關系，序列的相似性和序列的同源性有一定的關系， 一般來說一般來說序列間的相似性越高的話，它們是同源序序列間的相似性越高的話，它們是同源序 列的可能性就更高列的可能性就更高，所以經(jīng)?？梢酝ㄟ^序列的相似，所以經(jīng)?？梢酝ㄟ^序列的相似 性來推測序列是否同源。性來推測序列是否同源。 正因為存在這樣的關系，很多時候對序列的相正因為存在這樣的關系，很多時候對序列的

15、相 似性和同源性就沒有做很明顯的區(qū)分，造成經(jīng)常等似性和同源性就沒有做很明顯的區(qū)分，造成經(jīng)常等 價混用兩個名詞。所以有出現(xiàn)價混用兩個名詞。所以有出現(xiàn)A序列和序列和B序列的同源序列的同源 性為性為80一說。一說。 21 序列相似性比較：序列相似性比較： 就是將待研究序列與就是將待研究序列與DNA或蛋白質序列庫或蛋白質序列庫 進行比較，用于確定該序列的生物屬性，也就進行比較，用于確定該序列的生物屬性，也就 是找出與此序列相似的已知序列是什么。完成是找出與此序列相似的已知序列是什么。完成 這一工作只需要使用兩兩序列比較算法。常用這一工作只需要使用兩兩序列比較算法。常用 的程序包有的程序包有BLAST、

16、FASTA等；等； 22 序列同源性分析：序列同源性分析： 是將待研究序列加入到一組與之同源，是將待研究序列加入到一組與之同源， 但來自不同物種的序列中進行多序列同時比但來自不同物種的序列中進行多序列同時比 較，以確定該序列與其它序列間的同源性大較，以確定該序列與其它序列間的同源性大 小。這是理論分析方法中最關鍵的一步。完小。這是理論分析方法中最關鍵的一步。完 成這一工作必須使用多序列比較算法。常用成這一工作必須使用多序列比較算法。常用 的程序包有的程序包有CLUSTAL等；等； 23 2. Blast簡介及應用簡介及應用 （1）Blast簡介簡介 BLAST 是由美國國立生物技術信息中心是由

17、美國國立生物技術信息中心 （NCBI）開發(fā)的一個基于）開發(fā)的一個基于序列相似性序列相似性的數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)庫 搜索程序。搜索程序。 BLAST是是“局部相似性基本查詢工局部相似性基本查詢工 具具”（Basic Local Alignment Search Tool）的縮）的縮 寫。寫。 24 Blast 是一個序列相似性搜索的程序包，其是一個序列相似性搜索的程序包，其 中包含了很多個獨立的程序，這些程序是根據(jù)中包含了很多個獨立的程序，這些程序是根據(jù) 查詢的對象和數(shù)據(jù)庫的不同來定義的。比如說查詢的對象和數(shù)據(jù)庫的不同來定義的。比如說 查詢的序列為核酸，查詢數(shù)據(jù)庫亦為核酸序列查詢的序列為核酸，查詢數(shù)據(jù)庫

18、亦為核酸序列 數(shù)據(jù)庫，那么就應該選擇數(shù)據(jù)庫，那么就應該選擇blastn程序。程序。 下表列出了主要的下表列出了主要的blast程序：程序： 25 主要的主要的blast程序程序 程序名程序名查詢序列查詢序列數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫搜索方法搜索方法 Blastn核酸核酸核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫中的序列核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫中的序列 Blastp蛋白質蛋白質蛋白質蛋白質蛋白質序列搜索逐一蛋白質數(shù)據(jù)庫中的蛋白質序列搜索逐一蛋白質數(shù)據(jù)庫中的 序列序列 Blastx核酸核酸蛋白質蛋白質核酸序列核酸序列6框翻譯成蛋白質序列后和蛋白框翻譯成蛋白質序列后和蛋白 質數(shù)據(jù)庫中的序列逐一搜索。質數(shù)據(jù)庫中的序列逐一

19、搜索。 Tblastn蛋白質蛋白質核酸核酸蛋白質序列和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列蛋白質序列和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6 框翻譯后的蛋白質序列逐一比對。框翻譯后的蛋白質序列逐一比對。 TBlastx核酸核酸核酸核酸核酸序列核酸序列6框翻譯成蛋白質序列，再和核框翻譯成蛋白質序列，再和核 酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯成的蛋白框翻譯成的蛋白 質序列逐一進行比對。質序列逐一進行比對。 26 （2） Blast資源資源 1、NCBI主站點：主站點： /BLAST/（網(wǎng)絡版）（網(wǎng)絡版） /bl

20、ast/ （單機版）（單機版） 2、其他站點：、其他站點： http:/ http:/nema.cap.ed.ac.uk/ncbi_blast.html /blast/（果蠅）（果蠅） 27 Blast結果會列出跟查詢序列相似性比較高，符合結果會列出跟查詢序列相似性比較高，符合 限定要求的序列結果，根據(jù)這些結果可以獲取以下一限定要求的序列結果，根據(jù)這些結果可以獲取以下一 些信息：些信息： 1.查詢序列可能具有某種功能；查詢序列可能具有某種功能； 2.查詢序列可能是來源于某個物種；查詢序列可能是來源于某個物種； 3.查詢序列可能是某種功能基因的同源基因

21、；查詢序列可能是某種功能基因的同源基因； 這些信息都可以應用到后續(xù)分析中。這些信息都可以應用到后續(xù)分析中。 28 （3）Blast應用應用 登陸登陸ncbi的的 blast主頁主頁 核酸序列核酸序列 蛋白序列蛋白序列 翻譯序列翻譯序列 底下有其他一些針對特底下有其他一些針對特 殊數(shù)據(jù)庫的和查看以往殊數(shù)據(jù)庫的和查看以往 的比對結果等的比對結果等 29 Blast任務提交表單任務提交表單1 1.序列信息部分序列信息部分 填入查詢（填入查詢（query）的序列）的序列 序列范圍序列范圍 （默認全部）（默認全部） 選擇搜索數(shù)據(jù)庫選擇搜索數(shù)據(jù)庫 如果接受其他參數(shù)默認如果接受其他參數(shù)默認 設置，點擊開始搜

22、索設置，點擊開始搜索 30 Blast任務提交表單任務提交表單2 設置搜索的范圍，設置搜索的范圍，entrez關鍵關鍵 詞，或者選擇特定物種詞，或者選擇特定物種 2.設置各種參數(shù)部分設置各種參數(shù)部分 一些過濾選項，包括簡一些過濾選項，包括簡 單重復序列，人類基因單重復序列，人類基因 組中的重復序列組中的重復序列 E值上限值上限 窗口大小窗口大小 如果你對如果你對blast的命令行選項熟悉的話，可以在這里加入更多的參數(shù)的命令行選項熟悉的話，可以在這里加入更多的參數(shù) 31 Blast任務提交表單任務提交表單3 3.設置結果輸出顯示格式設置結果輸出顯示格式 選擇需要顯示的選項選擇需要顯示的選項 以及

23、顯示的文件格式以及顯示的文件格式 顯示數(shù)目顯示數(shù)目 Alignment的的 顯示方式顯示方式 篩選結果篩選結果 E值范圍值范圍 其他一些顯示格式參數(shù)其他一些顯示格式參數(shù) 點擊開始搜索點擊開始搜索 32 提交任務提交任務 返回查詢號（返回查詢號（requestid） 可以修改顯示結果格式可以修改顯示結果格式 修改完顯示格式后修改完顯示格式后 點擊進入結果界面點擊進入結果界面 33 結結果頁面果頁面1 圖形示意結果圖形示意結果 34 結果頁面結果頁面2 目標序列描述部分目標序列描述部分 帶有帶有genbank的鏈接，點擊可以進的鏈接，點擊可以進 入相應的入相應的genbank序列序列 匹配情況，分

24、值，匹配情況，分值，e值值 35 結果頁面結果頁面3 詳細的比對上的序列的排列情況詳細的比對上的序列的排列情況 36 （4）一個例子）一個例子 假設以下為一未知蛋白序列假設以下為一未知蛋白序列 query_seq MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQR RPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDD QIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPY GANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQG TTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPA RMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTK KSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQ DLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWL TYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKK KKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGA SADST QA 我們通過我們通過blas