生物科學(xué)專業(yè)論文人參總皂苷對小鼠骨髓干細(xì)胞M719的影響研究

1、本科生畢業(yè)論文(設(shè)計)開題報告書 題 目 人參總皂苷對小鼠骨髓干_細(xì)胞M719的影響研究_ 學(xué)生姓名 曾平文 學(xué) 號 2 專業(yè)班級 生科11101 指導(dǎo)老師 唐琳 2015年 01 月 10日論文（設(shè)計）題目人參總皂苷對小鼠骨髓干細(xì)胞M719的影響研究課題目的、意義及相關(guān)研究動態(tài)： 目的意義：通過體外貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)的小鼠骨髓干細(xì)胞系M719并利用藥物對其進行處理，驗證人參總皂苷是否對其有促進增殖的作用；為臨床上骨髓移植種子干細(xì)胞的體外擴增提供借鑒。人參總皂苷(Total Ginsenoside Ginseng Root)，又名人參總皂甙，是人參提取物的主要成分。人參提取物可使皮膚光滑，柔軟有彈

2、性，延緩衰老，還可以抑制黑色素的產(chǎn)生。 用在護發(fā)產(chǎn)品中，可以提高頭發(fā)的強度，防止脫發(fā)，白發(fā)，長期使用可使頭發(fā)烏黑亮澤。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived Mesenchymal stemcells，骨髓MSCs）是骨髓內(nèi)除造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSC）之外的另一類干細(xì)胞，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，在體內(nèi)外均具有支持和調(diào)控造血的作用。因其比較容易貼壁，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由于其來源廣泛，易于分離培養(yǎng)，并且具有較強的分化潛能和可自體移

3、植等優(yōu)點，越來越受到學(xué)者們的青睞，被認(rèn)為是不久即將被引入臨床治療的最優(yōu)干細(xì)胞。 相關(guān)研究動態(tài)：有關(guān)研究人士通過實驗得出人參皂苷能促進體外原代培養(yǎng)的小鼠骨髓MSCs及其傳代擴增細(xì)胞的增殖3;人參總皂苷不僅能抑制人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞（K562細(xì)胞）增殖,還可以誘導(dǎo)其分化,人參總皂苷增殖抑制作用可能與誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡有關(guān)4; 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報上刊登的有關(guān)論文得出人參總皂苷對馬立克氏病腫瘤細(xì)胞系MSB一1細(xì)胞的增殖存在抑制作用5；還有研究者通過實驗表明在一定的濃度,人參三醇組皂苷Rh1和ppt能減低小鼠原代骨髓MSC的集落生成能力,抑制MSC傳代細(xì)胞的增殖,而Re、Rg對這些細(xì)胞的體外增殖無明顯

4、影響6; 在環(huán)磷酸胺導(dǎo)致的骨髓抑制移植狀態(tài)下,人參皂苷可促進骨髓造血功能的恢復(fù),增加骨髓細(xì)胞總數(shù),提高HSCP、硯犯P及ER二的比例,但是否促進骨髓干細(xì)胞的動員或分化還需進一步研究7。貼壁培養(yǎng)篩選得到的小鼠MSCs，除了具有多能性的干細(xì)胞，還可能含有各胚層的原始細(xì)胞推測體外誘導(dǎo)分化所觀察到的定向分化現(xiàn)象，既可能是多能性細(xì)胞被定向誘導(dǎo)分化，也可能是由存在骨髓的各胚層原始細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下優(yōu)勢增殖的結(jié)果，有待進一步的研究證實。課題的主要內(nèi)容（觀點）、創(chuàng)新之處： 課題的主要內(nèi)容： 通過對小鼠骨髓干細(xì)胞系M719進行人參總皂苷藥物處理，并利用酶標(biāo)檢測儀分析軟件對小鼠骨髓干細(xì)胞系M719進行數(shù)據(jù)分析，從而

5、探討本實驗室所建小鼠骨髓干細(xì)胞系M719在經(jīng)過藥物（人參總皂苷）處理后的增殖影響。 創(chuàng)新之處：在哺乳類實驗動物中，由于小鼠體小，飼養(yǎng)管理方便，易于控制，生產(chǎn)繁殖快，研究最深，有明確的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，已擁有大量的近交系、突變系和封閉群，因此在各種實驗研究中，用量最大，用途最多。但是以活鼠做實驗，成本較高，通過建立小鼠干細(xì)胞系，培養(yǎng)出生長快速的小鼠干細(xì)胞，可以大大降低對小鼠干細(xì)胞的研究成本，且為實驗取材提供方便。通過建立小鼠干細(xì)胞系，培養(yǎng)出生長快速的小鼠干細(xì)胞，可以大大降低對小鼠干細(xì)胞的研究成本，且為實驗取材提供方便。本次實驗為求驗證所建小鼠骨髓干細(xì)胞系M719與原代小鼠細(xì)胞在經(jīng)過藥物（人參總皂苷）

6、處理后是否具有促進增殖的作用，可為以后對臨床上骨髓移植種子干細(xì)胞的體外擴增提供借鑒。研究方法、設(shè)計方案或論文撰寫提綱：1. 材料和方法：1.1 實驗材料：小鼠骨髓干細(xì)胞系M719細(xì)胞1.2 實驗試劑：DMEM培養(yǎng)液(Dulbeccos Modified Eagles Medium)：DMEM粉(低糖，Sigma公司生產(chǎn))用三蒸水溶解，培養(yǎng)基加入NaHCO3 3.7 g/L，調(diào)pH至7.2，過濾除菌，4保存，使用期2個月以內(nèi)。胎牛血清(FBS)：杭州四季青公司產(chǎn)品（批號：20070704、20070616、20070510、20061024、），56滅活30min，分裝后-20貯存。胰蛋白酶溶液

7、：取0.25g胰蛋白酶溶于100 ml PBS緩沖液(pH8.0)中，充分溶解，過濾除菌。磷酸鹽生理鹽水緩沖液(PBS)：取NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Na2HPO4H2O 1.56 g，KH2PO4 0.20 g，用三蒸水溶解，定容至1 L，高壓滅菌，4保存?zhèn)溆谩Ｋ幬铮ㄈ藚⒖傇碥账巹?00mmol/ml）、1.25%Et-OH（酒精）、MTT檢測試劑、DMSO細(xì)胞裂解試劑。1.3 實驗設(shè)備與器材：小試劑瓶若干，小離心管 ，細(xì)胞培養(yǎng)瓶（新），計時器，移液槍，槍頭（5ml、1ml、0.1ml各若干支），血球計數(shù)板、超凈工作臺。2. 實驗流程2.1小鼠骨髓干細(xì)胞系M719細(xì)胞的培

8、養(yǎng)2.2 藥物處理： （1）取兩日內(nèi)傳代的M719細(xì)胞，通過胰酶處理，離心去除死細(xì)胞，混勻計后配制成4104個/ml 的細(xì)胞混合液，給96孔板加注100ul細(xì)胞混合液備用。（2） 取10個1.5毫升的離心管依次排好，配置含不同濃度的Rb1液，加入NBS和DMEM混勻，給98孔板標(biāo)上濃度梯度后依次加入藥物混合液，每個梯度組滴加8個孔，蓋上蓋子，標(biāo)上日期等信息。（3） 待細(xì)胞貼壁大致完成前加入MTT處理4小時，然后倒掉板子里的液體，加入100-150ul的DMSO,放至搖床搖勻（10分鐘），最后用酶標(biāo)儀檢測，得出數(shù)據(jù)。2.3 數(shù)據(jù)的整理：去除不合理數(shù)據(jù)，求平均數(shù)，得出最適的人參總皂苷藥劑濃度。2.

9、4 最適濃度的藥物處理細(xì)胞：取兩瓶同代的小鼠骨髓干細(xì)胞系M719細(xì)胞，一瓶加入最適濃度的人參總皂苷藥劑，另一瓶作為對照，不加人參總皂苷藥劑。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期和活性，從而驗證試驗的結(jié)論。完成期限和預(yù)期進度：2014.12-2015.01 相關(guān)文獻查詢，實驗設(shè)計，實驗材料準(zhǔn)備與預(yù)備試驗2015.01-2015.03 畢業(yè)論文實驗實施，數(shù)據(jù)處理與分析2015.04-2015.05 畢業(yè)論文寫作與答辯相關(guān)參考資料：1 于美娟，張雅尼，馮善偉，熊符，張成；小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立J；解剖學(xué)研究；2009年9月31卷6期424-427. 2 周進明，鄒仲敏

10、，郭朝華，何穎，張勇，王勁，王蒙，羅成基，程天民;小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特點及分化潛能鑒定J；第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報；2002年1月24卷1期58-61.3 吳晶晶；人參皂苷對小鼠骨髓MSC體外增殖及成骨分化的影響D；2010年4月.4 雷翠蓉,姜 蓉,王紅寧,何 軒,左國偉,陳地龍,官 濤,王建偉；人參總皂苷對K562細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)分化作用J；激光雜志；2011年32卷2期69-73.5 付本懂，許小琴，申海清，王春元，王魯，褚秀玲礴，韋旭斌人參總皂苷對MSB一1細(xì)胞的增殖抑制作用及其機理初探J；中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報；2007年6月29卷6期471-474.6 朱海林；人參三醇組皂昔對小鼠骨髓MSC體外生長的影響及相關(guān)實驗技術(shù)的研究D；2009年5月.7 徐尚福，余麗梅，方寧，劉杰，吳芹；人參皂苷Rg1對小鼠