分子生物學第08章PCR-聚合酶鏈反應

1、8.1 PCR 的基本原理的基本原理 8.2 PCR 條件的優(yōu)化條件的優(yōu)化 8.3 由基本由基本 PCR 擴展的相關技術及其應用擴展的相關技術及其應用 8 PCR聚合酶鏈反應 PCR的特點 聚合酶鏈反應（聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction，PCR）是一種體外擴增）是一種體外擴增DNA片片 段的方法，與用載體和宿主細胞的體內(nèi)擴段的方法，與用載體和宿主細胞的體內(nèi)擴 增相比，有簡便、快速的優(yōu)點，并有許多增相比，有簡便、快速的優(yōu)點，并有許多 特殊的用處。特殊的用處。 PCR的基本原理一 PCR的基本原理二 圖圖81 PCR的的 基本原基本原 理理 PCR反應的體系 1 D

2、NA模板模板 2 一對引物一對引物 3 耐熱的耐熱的DNA聚合酶聚合酶 4 4dNTP 5 緩沖液緩沖液 6 Mg2+、K+離子離子 7 酶活性保護劑酶活性保護劑 PCR儀 PCR儀實際上就是一種溫度循環(huán)儀，它儀實際上就是一種溫度循環(huán)儀，它 能夠快速地升降溫和保持恒溫，全部由電腦能夠快速地升降溫和保持恒溫，全部由電腦 控制。常用的反應容器有控制。常用的反應容器有0.2ml的薄壁的薄壁 Eppendorf管和毛細玻璃管。管和毛細玻璃管。 對DNA模板的要求 對對DNA模板純度的要求不很高，但必須除去模板純度的要求不很高，但必須除去 DNA聚合酶抑制劑。理論上有一個聚合酶抑制劑。理論上有一個DNA

3、模板分子就模板分子就 可以擴增出大量的產(chǎn)物，實際上使用可以擴增出大量的產(chǎn)物，實際上使用pgng級的模板級的模板 量。模板一般是雙鏈分子，也可以是單鏈分子。模量。模板一般是雙鏈分子，也可以是單鏈分子。模 板板DNA分子不宜太長，可用切點稀少的限制酶切成分子不宜太長，可用切點稀少的限制酶切成 較短的片段。由于環(huán)狀較短的片段。由于環(huán)狀DNA模板的擴增效率較線狀模板的擴增效率較線狀 DNA模板低，所以最好先將環(huán)狀模板低，所以最好先將環(huán)狀DNA用限制酶切成用限制酶切成 線狀再行擴增。線狀再行擴增。 RNA模板應先逆轉(zhuǎn)錄成模板應先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行再進行PCR擴增。擴增。 引 物 1 長度一般為長度一

4、般為1530個核苷酸。引物太短與模個核苷酸。引物太短與模 板結(jié)合的位點特異性差，引物太長與模板結(jié)板結(jié)合的位點特異性差，引物太長與模板結(jié) 合的速率下降，影響合的速率下降，影響PCR的效率。的效率。 2 不應有超過不應有超過3個連續(xù)的個連續(xù)的C或或G。引物自身不存。引物自身不存 在互補序列，兩個引物之間也不能有超過在互補序列，兩個引物之間也不能有超過4 個連續(xù)堿基互補的情況。個連續(xù)堿基互補的情況。 3 當引物的當引物的3端有足夠長與模板互補的序列時，端有足夠長與模板互補的序列時， 引物的引物的5端可以不與模板互補，利用這點可端可以不與模板互補，利用這點可 在在PCR產(chǎn)物的兩端加上特殊序列（如限制性

5、產(chǎn)物的兩端加上特殊序列（如限制性 內(nèi)切酶位點）。內(nèi)切酶位點）。 圖圖82 引物引物5端外加端外加BamH酶切酶切 位點摻入產(chǎn)物的兩端位點摻入產(chǎn)物的兩端 引 物 4 為了方便為了方便PCR產(chǎn)物的檢測和分析，可以在引產(chǎn)物的檢測和分析，可以在引 物的物的5端以同位素或非同位素修飾（端以同位素或非同位素修飾（32P、熒、熒 光素、生物素等）。光素、生物素等）。 5 當要擴增的當要擴增的DNA序列不知，但知其編碼的氨序列不知，但知其編碼的氨 基酸序列，可反推出基酸序列，可反推出DNA序列，為設計引物序列，為設計引物 提供依據(jù)。因簡并密碼的存在，反推出的提供依據(jù)。因簡并密碼的存在，反推出的 DNA序列是不

6、唯一的，這時應采用簡并引物。序列是不唯一的，這時應采用簡并引物。 表表8 81 1 引物引物 5 5 端修飾技術端修飾技術 修飾法修飾法用途用途修飾法修飾法用途用途 1.附加核酸序列附加核酸序列2.功能基因修飾功能基因修飾 酶切位點酶切位點便于克隆等便于克隆等同位素同位素(35S, 32P)檢測，定量檢測，定量 噬菌體啟動子噬菌體啟動子 測序，合成測序，合成 RNA探針等探針等 生物素生物素檢測，純化，定量檢測，純化，定量 蛋白質(zhì)結(jié)合序列蛋白質(zhì)結(jié)合序列產(chǎn)物純化，檢測產(chǎn)物純化，檢測熒光素熒光素檢測，純化檢測，純化 酶酶檢測檢測 Taq DNA聚合酶 現(xiàn)在常用的現(xiàn)在常用的Taq酶，在酶，在95的變

7、性溫度下的變性溫度下 （20秒），經(jīng)過秒），經(jīng)過50次循環(huán)仍保持次循環(huán)仍保持65 %的酶活性。的酶活性。 對于對于Taq酶的聚合酶活性來說，最佳作用溫度為酶的聚合酶活性來說，最佳作用溫度為 7580，60時聚合酶活性僅剩時聚合酶活性僅剩1/2，37時時 聚合酶活性僅剩聚合酶活性僅剩1/10。但在許多情況下，需要。但在許多情況下，需要 在低于最適溫度條件下進行聚合反應，以免引在低于最適溫度條件下進行聚合反應，以免引 物從模板上解離下來。物從模板上解離下來。 Taq DNA聚合酶 Taq酶有酶有53的聚合活性和的聚合活性和53的外切活性，的外切活性， 但缺少但缺少35的外切活性，所以沒有校正功能，

8、有的外切活性，所以沒有校正功能，有 時會發(fā)生錯誤合成。使用時會發(fā)生錯誤合成。使用Taq酶還往往在所有擴增酶還往往在所有擴增 產(chǎn)物的產(chǎn)物的3端增加一個非模板依賴的端增加一個非模板依賴的A?，F(xiàn)在作為商?，F(xiàn)在作為商 品供應的品供應的Taq酶有從嗜熱水生菌中提純的天然酶和酶有從嗜熱水生菌中提純的天然酶和 利用大腸桿菌生產(chǎn)的基因工程酶。利用大腸桿菌生產(chǎn)的基因工程酶。 PCR的反應體系 PCR中常用的緩沖液是中常用的緩沖液是1050 mmol / L的的 Tris-HCl緩沖液，緩沖液，pH8.38.9，還需要合適的，還需要合適的Mg2+ 濃度（約濃度（約1.5 mmol / L）和）和K+濃度（濃度（5

9、0 mmol / L），）， 其中其中Mg2+濃度須經(jīng)過預備實驗確定合適的值，在濃度須經(jīng)過預備實驗確定合適的值，在 0.05 mmol / L和和5 mmol / L之間試驗，按每之間試驗，按每0.5 mmol / L增加。增加。Mg2+濃度太高時非特異擴增增加，濃度太高時非特異擴增增加， 太低時產(chǎn)物減少。太低時產(chǎn)物減少。 PCR的反應體系 Taq酶的用量必須適當，一般典型的擴增反酶的用量必須適當，一般典型的擴增反 應加應加2單位的酶，太高非特異擴增增加，太低時單位的酶，太高非特異擴增增加，太低時 擴增效率下降。擴增效率下降。4種種dNTP的濃度應相等，濃度的濃度應相等，濃度 在在20200m

10、ol/L之間。反應體系中加入之間。反應體系中加入BSA或或 明膠可以保護明膠可以保護Taq酶活性。在無熱蓋的酶活性。在無熱蓋的PCR儀上，儀上， 反應液表面應加礦物油以阻止蒸發(fā)。反應液表面應加礦物油以阻止蒸發(fā)。 循環(huán)條件的設定 變性變性-退火退火-鏈延伸鏈延伸 循環(huán)循環(huán)變性變性退火退火鏈延伸鏈延伸 首輪循環(huán)首輪循環(huán)94 5 min50 2 min72 3 min 中間循環(huán)中間循環(huán)94 1 min50 2 min72 3 min 末輪循環(huán)末輪循環(huán)94 1 min50 2 min7210min 循環(huán)條件舉例循環(huán)條件舉例 循環(huán)條件的設定 在循環(huán)溫度的設定中，最重要的是退在循環(huán)溫度的設定中，最重要的是

11、退 火溫度。退火溫度較低可提高擴增效率，火溫度。退火溫度較低可提高擴增效率， 但產(chǎn)物的特異性較差；退火溫度較高可提但產(chǎn)物的特異性較差；退火溫度較高可提 高產(chǎn)物的特異性，但擴增效率較低。高產(chǎn)物的特異性，但擴增效率較低。 嵌套PCR ( nested PCR) 嵌套PCR提高產(chǎn)物特異性的原理 單用第一對引物擴增，得一特異性產(chǎn)物和一非特異性產(chǎn)物。單用第一對引物擴增，得一特異性產(chǎn)物和一非特異性產(chǎn)物。 單用第二對引物擴增，得一特異性產(chǎn)物和一非特異性產(chǎn)物。單用第二對引物擴增，得一特異性產(chǎn)物和一非特異性產(chǎn)物。 以第一對引物擴增的產(chǎn)物為模板，用第二對引物再次擴增，只得到特以第一對引物擴增的產(chǎn)物為模板，用第二對

12、引物再次擴增，只得到特 異性產(chǎn)物。異性產(chǎn)物。 特異性產(chǎn)物特異性產(chǎn)物 特異性產(chǎn)物特異性產(chǎn)物 非特異性產(chǎn)物非特異性產(chǎn)物 非特異性產(chǎn)物非特異性產(chǎn)物 反向PCR ( inverted PCR) 錨式PCR ( anchored PCR) RACE Rapid Amplification of cDNA Ends 擴增擴增mRNA3端或端或5端的序列稱為端的序列稱為RACE。 錨式PCR擴增已知序列3側(cè)序列 錨式PCR擴增已知序列5側(cè)序列 錨式PCR擴增全長的mRNA序列 要擴增全長的要擴增全長的mRNA，先用，先用oligo(dT) 作引物逆轉(zhuǎn)錄該作引物逆轉(zhuǎn)錄該mRNA成全長的成全長的cDNA第一第一

13、 鏈，再給鏈，再給cDNA第一鏈的第一鏈的3端進行同聚物加端進行同聚物加 尾（如尾（如GGGGG），最后用），最后用oligo(dT)和和 oligo(dC)進行擴增。進行擴增。 不對稱PCR ( asymmetric PCR) 定量PCR 嚴格地掌握實驗條件，使嚴格地掌握實驗條件，使PCR擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物 量與模板量成正比。這樣可將痕量的模板擴量與模板量成正比。這樣可將痕量的模板擴 增后檢測，從而得到原模板的量。增后檢測，從而得到原模板的量。 此法常用于低豐度此法常用于低豐度mRNA的檢測。先將的檢測。先將 mRNA反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以，再以cDNA為模板擴為模板擴 增出產(chǎn)物，檢測

14、產(chǎn)物的量從而推算出低豐度增出產(chǎn)物，檢測產(chǎn)物的量從而推算出低豐度 mRNA的量。這種方法稱為反轉(zhuǎn)錄的量。這種方法稱為反轉(zhuǎn)錄PCR（RT PCR）。）。 ( quantitative PCR ) 定量PCR中的內(nèi)標 由于影響擴增產(chǎn)量的因素較多，模板與擴增由于影響擴增產(chǎn)量的因素較多，模板與擴增 產(chǎn)物量的比例關系難以確定，所以必須在同一次產(chǎn)物量的比例關系難以確定，所以必須在同一次 PCR中加入內(nèi)標。在一次中加入內(nèi)標。在一次PCR中同時加入兩種模中同時加入兩種模 板，一種是待測模板，另一種是按確定量加入的板，一種是待測模板，另一種是按確定量加入的 作為內(nèi)標的對照模板，二者使用相同的引物，對作為內(nèi)標的對照

15、模板，二者使用相同的引物，對 照模板與待測模板的差異應盡量小，以便最大程照模板與待測模板的差異應盡量小，以便最大程 度地減少擴增效率的系統(tǒng)誤差。對照模板擴增產(chǎn)度地減少擴增效率的系統(tǒng)誤差。對照模板擴增產(chǎn) 物和待測模板擴增產(chǎn)物必須能由電泳分辨出來，物和待測模板擴增產(chǎn)物必須能由電泳分辨出來， 比如二者的分子量有一定的差異，或是二者序列比如二者的分子量有一定的差異，或是二者序列 中有限制酶切位點的差異。中有限制酶切位點的差異。 熒光定量PCR 1995年美國年美國PerKin Elmer公司研制成功具有公司研制成功具有 革命性意義的熒光定量革命性意義的熒光定量PCR技術，它融合了技術，它融合了 PCR

16、高靈敏性、高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技雜交的高特異性和光譜技 術的高精確定量等優(yōu)點。熒光定量術的高精確定量等優(yōu)點。熒光定量PCR是直接是直接 探測探測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的過程中熒光信號的變化以獲得定量的 結(jié)果，不需要結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測，完全閉后處理或電泳檢測，完全閉 管操作，在整個過程中，僅有加入樣品的一次開管操作，在整個過程中，僅有加入樣品的一次開 蓋。蓋。 TaqMan熒光探針 （線性探針）（線性探針） 在在PCR擴增體系中加入一個特異性的、能與擴增體系中加入一個特異性的、能與PCR 產(chǎn)物中部雜交的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩產(chǎn)物中部雜交的熒

17、光探針，該探針為一寡核苷酸，兩 端分別標記一個熒光報告基團（端分別標記一個熒光報告基團（R）和一個熒光淬滅）和一個熒光淬滅 基團（基團（Q）。探針完整時，）。探針完整時，R基團發(fā)射的熒光信號被基團發(fā)射的熒光信號被 Q基團吸收，結(jié)果是沒有熒光出現(xiàn)?；鶊F吸收，結(jié)果是沒有熒光出現(xiàn)。PCR擴增時，擴增時， Taq酶的酶的53外切活性將探針酶切降解，使外切活性將探針酶切降解，使R基基 團與團與Q基團分離，基團分離，Q基團對基團對R基團的熒光淬滅作用消基團的熒光淬滅作用消 失，于是產(chǎn)生熒光信號。每擴增一條失，于是產(chǎn)生熒光信號。每擴增一條DNA鏈，就有鏈，就有 一個一個R基團分離，游離的基團分離，游離的R基

18、團數(shù)量（也就是熒光強基團數(shù)量（也就是熒光強 度）與度）與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。通過檢測熒光強度產(chǎn)物的形成完全同步。通過檢測熒光強度 的變化，機內(nèi)的電腦可以計算并直接給出初始模板的的變化，機內(nèi)的電腦可以計算并直接給出初始模板的 數(shù)量。數(shù)量。 TaqMan熒光探針工作原理 分子信標（環(huán)狀探針）（環(huán)狀探針） 分子信標熒光探針的設計與分子信標熒光探針的設計與TaqMan熒光探針熒光探針 相似，只不過探針的相似，只不過探針的5端和端和3端的一小段序列被端的一小段序列被 設計成互補的，探針沒有與靶序列雜交時會形成莖設計成互補的，探針沒有與靶序列雜交時會形成莖 環(huán)結(jié)構(gòu)，環(huán)結(jié)構(gòu)，R基團和基團和Q基團靠近，不能產(chǎn)生熒光。當基團靠近，不能產(chǎn)生熒光。當 分子信標與靶序列雜交時，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被展開，使得分子信標與靶序列雜交時，莖環(huán)結(jié)構(gòu)被展開，使得 R 基團和基團和Q基團分開基團分開 足夠遠，足夠遠，