ELISA常見(jiàn)問(wèn)題和處理

1、問(wèn)題可能原因解決方法1、無(wú)顏色試劑孵育的時(shí)間沒(méi)有按說(shuō)明書操作。確定生物素化抗體，連接的HRP試劑或鏈霉親和素-HRP使用的時(shí)間是否適當(dāng)。2、不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑混用。重新檢查試劑的標(biāo)簽，確準(zhǔn)所有組分都屬于正使用的試劑盒中的。 不能混用不同 試劑盒或不同批號(hào)的試劑。3、漏加酶檢查操作流程，注意不要漏加5、HRF酶污染了疊氮鈉使用新配制的試劑，禁含疊氮鈉 標(biāo)準(zhǔn)品有問(wèn)題（若在標(biāo)本孔中有信號(hào)） 按說(shuō)明書檢查標(biāo)準(zhǔn)品的制備使用1瓶新標(biāo)準(zhǔn)品某一容器未洗凈，殘留滅活酶物質(zhì)盡可能用試劑盒內(nèi)容器，另覓一定要潔凈、可靠使用含血清的緩沖液配制/復(fù)溶抗體重新確認(rèn)所選用的試劑.漏加顯色劑A或B加顯色劑后觀察一下液面

2、高度試劑配制/使用有誤將實(shí)驗(yàn)重做；嚴(yán)格按說(shuō)明書操作，每次配制和使用前看清標(biāo)簽。緩沖液污染配制新新鮮的緩沖液顯色弱超過(guò)有效期的產(chǎn)品可能會(huì)產(chǎn)生很弱的信號(hào)。檢查產(chǎn)品的有效期加入試劑的體積和時(shí)間有誤確定所使用的每一個(gè)試劑的體積正確的和加入的時(shí)間是適當(dāng)?shù)?。試劑、樣品用前未能平衡用前試劑、樣品置室溫平?0分鐘左右 縮短孵育時(shí)間能使實(shí)驗(yàn)的信號(hào)變?nèi)?檢查孵育的時(shí)間。在溫度變化的環(huán)境內(nèi)孵育酶標(biāo)板。確定孵育的溫度，應(yīng)避免溫度的變化。使用了被污染的試劑檢查試劑是否被污染。標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本制備方法不規(guī)范檢查標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本的制備，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按說(shuō)明書進(jìn)行復(fù)溶和稀釋。低溫貯存的標(biāo)本 避免反復(fù)凍融，嚴(yán)禁使用溶血標(biāo)本。樣品用 NaN

3、3防腐,抑制了酶的反應(yīng)顯色底物制備不規(guī)范檢查底物的制備，如體積是否正確，混合是否恰當(dāng)充分。檢測(cè)時(shí)間不當(dāng)是否在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)。儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配。儀器是否設(shè)定正確，濾光片的使用等。高背景（本底）洗滌操作不規(guī)范洗板不充分，使用手工洗板常出現(xiàn)。最好使用洗板機(jī)，或使用洗瓶洗滌。每孔應(yīng) 完全充滿洗滌緩沖液，傾出時(shí)應(yīng)迅速。若使用洗板機(jī)，應(yīng)校準(zhǔn)并設(shè)定足夠充滿每 孔的體積量。板的內(nèi)側(cè)不應(yīng)接觸設(shè)備。檢查每孔是否有殘留的洗液或每孔加樣量 的體積是否準(zhǔn)確。在兩次洗板之間加 30秒的浸泡。實(shí)驗(yàn)中孵育溫度和時(shí)間不適當(dāng)確定每一實(shí)驗(yàn)步驟的孵育溫度和時(shí)間是否適當(dāng) 酶加量過(guò)多加酶前驗(yàn)看移液器調(diào)節(jié)量是否準(zhǔn)確。檢查稀釋

4、度，若必要進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。封閉不完全檢查封閉液的計(jì)算量；提高封閉時(shí)間 標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品中的干擾物質(zhì) 做適當(dāng)?shù)膶?duì)照 顯色劑受光照時(shí)間較長(zhǎng)，或污染顯色劑A和B應(yīng)于使用前10分鐘從冰箱取出整批樣品放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，樣品污染樣品應(yīng)保持新鮮，或低溫保存，防止污染緩沖液污染制備新鮮的緩沖液吸頭重復(fù)使用，未洗凈或消毒不完全而用于加酶或顯色劑 吸頭盡可能一次性使用太多的信號(hào)：全部的板子變成規(guī)則的藍(lán)色不充分的洗滌/洗滌步驟被遺漏-沒(méi)結(jié)合的過(guò)氧化物酶仍有殘留。最好使用洗板機(jī)充分洗滌檢查孔內(nèi)是否有殘留的洗液或加樣量是否準(zhǔn)確 底物溶液混合太早并轉(zhuǎn)成藍(lán)色 應(yīng)控制底物混合的時(shí)機(jī)并立即使用 太多的酶結(jié)合物檢查稀釋度，必要時(shí)進(jìn)行效價(jià)測(cè)

5、定 封板膜或試劑容器被重復(fù)使用，導(dǎo)致 HRF殘留，使TMB底物產(chǎn)生非特異藍(lán)色 使用新鮮的封板膜，每步使用不同的試劑容器 緩沖液中污染金屬或HRP 制備新鮮緩沖液高 CV值（CV： coefficient of variation），花板操作不慎或洗滌不充分按說(shuō)明書洗板、加樣、顯色。洗板尤為重要，如上所述 出現(xiàn)干板，沒(méi)有使用封板膜、封板膜重復(fù)使用確定每?jī)刹襟E間，酶標(biāo)板應(yīng)保持濕潤(rùn)。使用封板膜封口，注意每步使用新鮮的封 板膜。由于操作失誤或板子質(zhì)量差（結(jié)合不均勻）造成包板不均勻。稀釋用的PBS中不要加其它蛋白檢查包被和封閉液體積、時(shí)間和試劑加入的方 法。檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子（不要使

6、用組織培養(yǎng)板） 移液器不準(zhǔn)確，吸頭重復(fù)使用 檢查并校準(zhǔn)移液器。每次取樣必須換吸頭?；仡櫂?biāo)本的加入步驟，確保每次加樣 的準(zhǔn)確性，保證吸取的液體按所設(shè)定的體積吸入和排出，連續(xù)加樣時(shí)注意檢查吸 頭，確保所加液體的體積。樣品離心處理不全，反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細(xì)胞成分標(biāo)本充分離心,3000rpm 6分以上，嚴(yán)禁使用凝血（溶血）的標(biāo)本緩沖液污染制備新鮮的緩沖液標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到，但兩點(diǎn)之間區(qū)別很差（低或平的曲線）酶結(jié)合物不足檢查稀釋度，必要時(shí)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定捕獲抗體沒(méi)有很好結(jié)合到板上檢查所使用的酶標(biāo)板，使用ELISA板子（不要使用組織培養(yǎng)板）稀釋用的PBS中不 要加其它蛋白檢測(cè)抗體不足檢查稀釋度，必要時(shí)進(jìn)行效價(jià)

7、測(cè)定板子顯色不足延長(zhǎng)底物孵育實(shí)驗(yàn)使用推薦品牌的底物溶液操作不慎回顧ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋度計(jì)算有誤核查計(jì)算的情況，制備新的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，但是沒(méi)有任何期望的陽(yáng)性信號(hào)產(chǎn)生在標(biāo)本中無(wú)相應(yīng)的細(xì)胞因子使用內(nèi)參對(duì)照重復(fù)實(shí)驗(yàn)，重新考慮實(shí)驗(yàn)的相應(yīng)參數(shù)標(biāo)本基質(zhì)遮蓋檢測(cè)將標(biāo)本至少做1 ：2相應(yīng)的稀釋，或進(jìn)行系列稀釋觀測(cè)它的恢復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，但是標(biāo)本的判讀值很高 標(biāo)本中含的細(xì)胞因子水平超過(guò)實(shí)驗(yàn)范圍 將標(biāo)本做稀釋并再次實(shí)驗(yàn)當(dāng)使用HRF酶結(jié)合物時(shí)，TMB底物加終止液后顯綠色孔中的試劑顯色不充分輕輕振蕩板子邊緣效應(yīng)工作環(huán)境溫度不均衡避免將板子在變化溫度環(huán)境中孵育漂移實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出

8、現(xiàn)間斷整個(gè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)連續(xù)操作：在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將所有標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本做適當(dāng)?shù)臏?zhǔn)備試劑沒(méi)有按說(shuō)明書平衡至室溫在所有試劑加入孔前，確保它們已平衡至室溫，除非說(shuō)明書中有另外的要求。是否可更改試劑盒所提供的實(shí)驗(yàn)操作步驟？一般廠商為確保最高的靈敏度和特異性， 對(duì)試劑盒都進(jìn)行了優(yōu)化，為確保每一試 劑盒實(shí)驗(yàn)的規(guī)范性應(yīng)按說(shuō)明書操作。是否可混用不同試劑盒中的試劑？不行。絕大多數(shù)試劑在每批試劑盒中是特異的，若有問(wèn)題可與廠家或代理商聯(lián)系。是否可增加或減少標(biāo)本的體積。商品化的試劑盒所需加入的標(biāo)本體積是優(yōu)化的，應(yīng)按說(shuō)明書操作，不建議更改所加標(biāo)本的體積。是否可重確定自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線的點(diǎn)？可以。說(shuō)明書上有建議的制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋

9、度， 可改變稀釋倍數(shù)和增 加曲線的點(diǎn)，但是必須在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，高于試劑盒中最高標(biāo)準(zhǔn)品的點(diǎn)和低于靈敏 度以下的點(diǎn)是無(wú)效的。ELISA操作常見(jiàn)問(wèn)題ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定。但ELI SA測(cè)定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求,在檢測(cè)過(guò)程中除正常反應(yīng)外，有時(shí)常見(jiàn)到一些錯(cuò)誤的結(jié)果。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：標(biāo)本因素；試劑因素；操作因素。下面就一些常見(jiàn)ELISA操作過(guò)程中的問(wèn)題一一分析。1 樣品稀釋酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng)，如果血清不稀釋，不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng)，岀現(xiàn)假陽(yáng)性。因 此，國(guó)外檢測(cè)血清抗體的試劑盒，均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，以降

10、低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反 應(yīng)充分體現(xiàn)岀來(lái)。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過(guò)大量試驗(yàn)確定，以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。但是，有些用戶 未能嚴(yán)格按使用說(shuō)明書操作，如某些產(chǎn)品應(yīng)取10gl樣品進(jìn)行稀釋，個(gè)別用戶取5卩1甚至1gl樣品進(jìn)行稀釋，由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠，因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確，檢測(cè)結(jié)果岀現(xiàn)問(wèn)題。2 試劑盒平衡試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫（約25 C ），一般需在室溫放置 2030分鐘以上。平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠，樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37 C溫箱20分鐘。3 .樣品和試劑的混勻

11、稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗(yàn)的均一性。4 .加樣在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避 免加在孔壁上部，不可濺岀和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被 區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同 的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。5 .溫育溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗最為關(guān)鍵的一個(gè)因素。ELISA作為一種固相免疫測(cè)定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行，要使

12、液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間。溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短。最為常用的溫育溫度有37 C和室溫，其次是43 C和28 C。一些操作者，擅自改變說(shuō)明書操作，使用自己喜歡的溫育時(shí)間和溫育溫度，這樣造成一些不 必要的麻煩。因?yàn)?，不同試劑盒有不同的溫育時(shí)間和溫育溫度的選擇，隨意更改溫育時(shí)間或者溫育溫度將導(dǎo)致試驗(yàn) 結(jié)果岀現(xiàn)偏差。6 洗板固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過(guò)程中吸附的非特異成份分離開(kāi)來(lái)，以保證ELISA測(cè)定的特異性。洗板對(duì)于 ELISA測(cè)定來(lái)說(shuō)，

13、也是極其關(guān)鍵的一步。洗液盡量不要溢岀孔外；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及時(shí)更換吸水紙，尤其是拍過(guò)酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果。7.邊緣效應(yīng)使用96孔板的ELISA測(cè)定中，常發(fā)現(xiàn)有 邊緣效應(yīng)”，即外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯 度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫（通常在 25 C左右）置于37 C溫箱，板也升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶 液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37 C），就可以很容易地排除 邊緣效應(yīng)”，并

14、且可提高測(cè)定的重復(fù)性。8 .顯色顯色一定要控制時(shí)間，根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作即可。一般來(lái)說(shuō)，顯色時(shí)間過(guò)短，結(jié)果偏低；顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，空白增高 或者非特異性顯色增加。9 .比色比色要注意波長(zhǎng)的選擇。以 TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易岀現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問(wèn)題。其次，單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問(wèn)題。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸

15、光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和； 非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標(biāo)儀給岀的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非常感波長(zhǎng)下的吸光度值的差。因此，雙波長(zhǎng)比 色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的 優(yōu)點(diǎn)。由于ELI SA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白 孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在 ELISA測(cè)定比色時(shí)，最好是使用雙波長(zhǎng)比色。綜上所述，盡管ELISA測(cè)定的操作步驟非常

16、簡(jiǎn)單，但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多，分布在測(cè)定操作的各 步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測(cè)定中出現(xiàn)問(wèn)題的可能原因，特對(duì)常見(jiàn)問(wèn)題及原因歸納 總結(jié)于下表。1問(wèn)：請(qǐng)問(wèn)對(duì)同樣培養(yǎng)的相同濃度的細(xì)胞，用ELISA檢測(cè)其上清液相同細(xì)胞因子的濃度，不同的報(bào)道差別為什么很大？參考解析：不同廠家的試劑盒當(dāng)然有很大影響。ELISA非常敏感，即使是同一個(gè)試劑盒，用同一個(gè)廠家同一濃度的刺激因子，incubate 時(shí)間不同也會(huì)影響結(jié)果，這就是為什么每次都要設(shè)內(nèi)部和外部對(duì)照的原因。 這主要和其抗體標(biāo)準(zhǔn)品原料來(lái)源有關(guān)，建議購(gòu)買ELISA試劑盒時(shí)選擇大公司提供的產(chǎn)品，這樣結(jié)果比較可靠一點(diǎn)。2問(wèn)：ELI

17、SA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？參考解析：溫育常采用的溫度有43C、37C、室溫和 4C（冰箱溫度）等。37C是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度3問(wèn)：檢測(cè)疫苗免疫小鼠后的抗體情況。用了商品化的試劑盒。1商品化的板子已經(jīng)用病毒裂解液包被了。2洗3次后，將陽(yáng)性和陰性血清（豬），樣品血清（小鼠） 1 : 40稀釋加入，留2個(gè)空做空 白對(duì)照，30分鐘37度3洗3次，在一個(gè)空白空中加入山羊抗小鼠二抗（1:1000 ），一個(gè)加入商品化已稀釋抗豬二抗（不知稀釋倍數(shù)）。在陽(yáng)和陰中加入抗豬二抗，樣品中加入抗鼠二抗。4洗4

18、次。經(jīng)加入底物 AB侯顯色15分鐘。終止。測(cè)630nm結(jié)果加入豬二抗的空白空為0.277 ;陽(yáng)性為0.964，陰性為0.503%假如鼠二抗的空白空為 0.951 :個(gè)樣品都在1.000作用請(qǐng)問(wèn)為什么兩個(gè)空白空的值差那么多？是不是鼠二抗與包被的病毒抗原結(jié)合，還是二抗的稀釋倍數(shù)不夠？或者其他原因？參考解析：1首先抗豬二抗和抗鼠二抗本來(lái)就是不同的東西（且稀釋度不同），在沒(méi)有非特異性結(jié)合出 現(xiàn)的情況下，應(yīng)該是 OD值相差無(wú)幾，但是從現(xiàn)在的結(jié)果看，肯定是二抗有非特異性的結(jié)合（這一點(diǎn)從加入 的樣品鼠血清孔 與 鼠二抗空白孔差別不大也可以看出來(lái)），故造成兩孔OD值差異。2當(dāng)然這么高的本底也有可能是你的抗體濃

19、度使用稀釋度不當(dāng)或者洗板不徹底（殘余大量未結(jié)合的酶標(biāo)抗體）造成的，請(qǐng)首先查明。3不知道你使用的是什么底物進(jìn)行顯色，好像常規(guī)ELISA實(shí)驗(yàn)的底物是沒(méi)有檢測(cè)波長(zhǎng)在630n m的。4排除了 2.3兩點(diǎn)的問(wèn)題再考慮是否是二抗不純并與包被的病毒裂解物結(jié)合的問(wèn)題。你加入的商品化稀釋的抗豬二抗， 卻不知道稀釋度，這在ELISA實(shí)驗(yàn)中是不可取的， 酶標(biāo)抗體的濃度過(guò)高必然引起顯色本底很高。你可以取包被的板條不加樣品直接加入梯度稀釋的酶標(biāo)記二抗，取OD值在0.1以下時(shí)的稀釋度再進(jìn)行檢測(cè)。若檢測(cè)值很低則是抗體的敏感性問(wèn)題，應(yīng)當(dāng)更換其它抗體。4問(wèn)：請(qǐng)教一下，用雙夾心 ELISA法檢測(cè)，用菌體免疫的小鼠和家兔，免疫后采

20、集血清，可以直接包被血 清嗎，還是需要純化后在包被？菌體與佐劑乳化時(shí)需要無(wú)菌操作嗎？裝血清用無(wú)菌操作嗎？參考解析：血清不可以直接包被，主要是因?yàn)檠宓膒H和離子強(qiáng)度與通用的包被液不同，而且會(huì)造成一些非特異蛋白質(zhì)的吸附，不利于特異性抗原或抗體的檢測(cè)。純化血清的方法很多，一般有鹽析法和柱層析法，也可二者聯(lián)合使用，視對(duì)純度要求不同而異。一般鹽析 法（比如硫酸銨沉淀）純化后就可獲得主要的免疫球蛋白，而去除其他雜蛋白（如白蛋白等），如果需要 進(jìn)一步純化的話，還可用凝膠層析法或離子交換層析法來(lái)進(jìn)一步純化獲得IgG，如果抗原足夠純的話，也可以用親和層析法來(lái)做，但這些實(shí)驗(yàn)會(huì)導(dǎo)致抗體效價(jià)的下降和免疫球蛋白的損失

21、，所以要充分衡量利弊再 做決定5問(wèn)：要在balb/c小鼠上，免疫蛋白，做個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)， elispot檢測(cè)CTL，elisa檢測(cè)抗體，我想不加強(qiáng)免 疫，在第一次免疫一周后，就做能岀結(jié)果嗎？參考解析：加強(qiáng)免疫只是增加血液中抗體滴度，只是量的增加，理論上不影響定性檢測(cè)。elisa的敏感性很高，第一次免疫后，CTL和抗體都應(yīng)該能夠檢測(cè)到，但實(shí)際操作對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大，具體檢測(cè)效果如 何，你應(yīng)該試著做做。本底及假陽(yáng)性產(chǎn)生的原因分析1.基因工程抗原與合成肽抗原的區(qū)別基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：a.分子量大。合

22、成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利 用基因工程制備的抗原，分子量更大。引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：1 標(biāo)本因素；2 試劑因素；3 .操作因素。本文就標(biāo)本因素對(duì) ELISA測(cè)定的影響做如下討論。血清是最常用的ELI SA標(biāo)本，血漿一般可視為與血清同等的標(biāo)本，標(biāo)本引起的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：1.內(nèi)源性物質(zhì)有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測(cè)結(jié)果。常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠lg(s)抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和

23、其它物質(zhì)等。(1) 類風(fēng)濕因子人血清中IgM、IgG型類風(fēng)濕因子(RF)可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標(biāo)記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。解決該情況的辦法是：用F(ab)2替代完整的IgG;標(biāo)本用聯(lián)有熱變性(63C,10 min ) IgG的固相吸附劑處理(將熱變性 IgG加入到標(biāo)本稀釋液中同樣有效)；檢測(cè)抗原時(shí)，可以用 2-巰基乙醇等加入到標(biāo)本稀釋液中，使RF降解。(2) 補(bǔ)體ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標(biāo)記二抗過(guò)程中，抗體分子發(fā)生變構(gòu)，其FC段的補(bǔ)體C1q分子結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來(lái)，使 C1q可以將二者連接起來(lái)，從而造成假陽(yáng)性。解決的辦法是：用EDTA稀釋標(biāo)本；用53C， 10 mi

24、n或56C， 30 min加熱血清使 C1q滅活。(3) 嗜異性抗體人類血清中含有能與嚙齒類動(dòng)物(如鼠等)Ig (s) 結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將 ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來(lái)，也能造成假陽(yáng)性。解決的辦法是：可在標(biāo)本稀釋液中加入過(guò)量的動(dòng)物Ig (s)，但加入量不足或亞類不同時(shí)無(wú)效。(4) 嗜靶抗原的自身抗體抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時(shí)能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，在ELI SA方法中均可干擾抗原抗體測(cè)定結(jié)果。為避免以上情況岀現(xiàn)， 解決的辦法是：測(cè)定前需用理化方法將其解離后再測(cè)定。(5) 醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠Ig (s) 抗體臨床開(kāi)展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性

25、同位素標(biāo)記鼠源性抗體的影像診斷及 靶向治療等新技術(shù)，均有可能使這些病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動(dòng)物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig (s)抗體。這些病人ELISA測(cè)定時(shí)均可產(chǎn)生假陽(yáng)性。解決的辦法是：測(cè)定抗原時(shí)，在標(biāo)本中加入足量的正常鼠Ig (s)，從而克服由于上述原因造成的假陽(yáng)性。(6) 交叉反應(yīng)物質(zhì)類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應(yīng)的物質(zhì)。在用多抗測(cè)定抗原時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié) 果影響不大，但在用單克隆抗體測(cè)定抗原時(shí)，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對(duì)應(yīng)的靶決定簇時(shí)，也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。(7 )標(biāo)本中其它成分的影響血清脂質(zhì)過(guò)高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過(guò)大等，均對(duì)ELISA測(cè)定結(jié)果有干擾作用。2外源性物質(zhì)外源性物質(zhì)常常是由于用于 ELISA測(cè)定的血標(biāo)本的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標(biāo)本溶血、標(biāo) 本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存過(guò)久、標(biāo)本凝集不全和采血管中添加物等影響。(1 )標(biāo)本溶血由于各種人為原因引起的標(biāo)本溶血，均