電色譜的研究與應(yīng)用介紹

1、電色譜的研究與應(yīng)用介紹 【關(guān)鍵詞】 電色譜；色譜柱；檢測(cè)器；應(yīng)用 【中圖分類號(hào)】r318 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a 【文章編號(hào)】1003-8183（2013）11-0280-02 電色譜，是在毛細(xì)管電泳的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高效分離技術(shù)，屬于高效毛細(xì)管電泳的一種模式。最早的電色譜是mould和syng將電場(chǎng)應(yīng)用到薄層液相色譜中，用來分離寡聚糖的。但“電色譜”一詞首先是在1974年，由pretorius等1 首先提出的，他將電場(chǎng)引入到hplc中，顯示了以電滲流為流動(dòng)相的推動(dòng)力進(jìn)行分離的巨大優(yōu)勢(shì)。后來，jogenson等2在170m內(nèi)徑的毛細(xì)管中填充10m粒徑的partisil ods-2，成功地分離了9

2、-甲基蒽等多環(huán)芳烴，獲得了31000 m- 1理論塔板數(shù)的柱效并發(fā)表了論文。這是毛細(xì)管電泳發(fā)展史上的里程碑。之后涌現(xiàn)了許多關(guān)于毛細(xì)管電泳的應(yīng)用和理論研究，從理論和試驗(yàn)中證實(shí)了電色譜的分離效率明顯高于hplc。之后，電色譜開始進(jìn)入商品化，閻超等研制了世界上第一臺(tái)專用梯度加壓電色譜儀。2003年已有集成式加壓毛細(xì)管電色譜商品儀出售。各種聯(lián)用技術(shù)也相繼出現(xiàn)，如毛細(xì)管電色譜與核磁共振、質(zhì)譜的聯(lián)用。毛細(xì)管電色譜正處于不斷蓬勃發(fā)展中。 1 電色譜的特點(diǎn) 電色譜是采用細(xì)顆粒固定相填充的毛細(xì)管柱或?qū)⒐潭ㄏ嗤繚n到毛細(xì)管內(nèi)壁，在電場(chǎng)（有時(shí)候輔助電壓）的驅(qū)動(dòng)下，利用樣品溶液中組分的分配系數(shù)，電泳淌度的差異而實(shí)現(xiàn)分離

3、的液相分離技術(shù)3。在驅(qū)動(dòng)力上，其采用電場(chǎng)作為驅(qū)動(dòng)力，流動(dòng)相為塞狀流型，所以具有毛細(xì)管電泳的高分離效能，同時(shí)引入了hplc中的高壓泵輔助驅(qū)動(dòng)，可以在柱系統(tǒng)電滲流速度較低的情況下，有效地縮短樣品的分析時(shí)間，此外還可以通過改變泵壓和分離電壓來調(diào)節(jié)樣品中各組分的保留，提高分離度3，這也可以彌補(bǔ)毛細(xì)管電泳分離中性混合物的不足4，必要時(shí)還可以采用梯度洗脫來分離極性差別比較大的混合物。另外使用加壓電色譜還可以減少毛細(xì)管中的氣泡產(chǎn)生5，提高重現(xiàn)性。在色譜柱上，毛細(xì)管中可以填充和鍵合各種固定相，除了淌度差異外，還引入了分配、吸附等分離機(jī)制，使其具有hplc的高選擇性。在流動(dòng)相上，電色譜主要使用緩沖鹽，溶劑消耗少

4、，成本低，還可以加入有機(jī)改性劑或者添加劑改善分離效果，甚至完全用有機(jī)溶劑作流動(dòng)相，成為非水毛細(xì)管電色譜（nacec）。因此，電色譜是綜合兩種分離模式的優(yōu)點(diǎn)而產(chǎn)生的，具有高分離效能、高選擇性、高速度、高靈敏度、樣品用量少、溶劑消耗少、應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。 2 色譜柱 同hplc一樣，色譜柱是電色譜的核心。根據(jù)色譜柱固定相的填充方式不同，可以分為填充毛細(xì)管電色譜（pccec），開管毛細(xì)管電色譜（otcec），整體式毛細(xì)管電色譜（mcec）6-7?，F(xiàn)分別對(duì)三種類型的毛細(xì)管電色譜做簡單的介紹。 2.1 填充毛細(xì)管電色譜 填充柱式就是在各種不同孔徑的毛細(xì)管內(nèi)填充高效液相色譜常用填料，如ods、硅膠、硅膠鍵

5、合其他官能團(tuán)（如c18、ph、cn、nh2等）、手性固定相等，以此作為分離基質(zhì)。目前最常見的填料為多孔o(hù)ds，其粒徑為3m或5m8。填充方式主要有勻漿填充法、拉伸填充法和電動(dòng)填充法。電動(dòng)填充法較好，可以得到非常均勻的填充柱床，且填充時(shí)間短，柱效較高9。但填充柱需要制備柱塞，這不僅需要比較高的工藝要求而且柱塞容易產(chǎn)生氣泡，氣泡的產(chǎn)生會(huì)增大組分遷移的阻力，甚至可能中斷電泳過程。 2.2 開管毛細(xì)管電色譜 開管柱是在毛細(xì)管內(nèi)涂敷或者鍵合含有帶電或者分配選擇性的固定相的一種分離柱9。開管柱的制備方法主要有三種：表面涂漬固定相、表面粗糙化后鍵合固定相和溶膠-凝膠技術(shù)9。表面涂漬固定相方法簡單，但柱的壽命

6、短。表面粗糙化鍵合固定相是為了增大毛細(xì)管的內(nèi)表面積，首先對(duì)毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行蝕刻，然后將固定相鍵合到內(nèi)壁上。溶膠-凝膠技術(shù)就是將含烷基鏈的烷氧基硅烷作為溶膠溶液的前體，利用溶膠-凝膠化學(xué)在毛細(xì)管內(nèi)壁形成有孔的有機(jī)硅膠薄膜，從而在增大毛細(xì)管內(nèi)表面的同時(shí)引入具有保留功能的官能團(tuán)9。如采用四乙氧基硅烷（teos）、正辛基三乙氧基硅烷（c8-teos）、乙醇、鹽酸和水按一定的比例攪拌一段時(shí)間，teos和c8-teos水解產(chǎn)生原硅酸，原硅酸縮聚產(chǎn)生硅凝膠。水解和縮聚同時(shí)進(jìn)行，但水解速度大于縮聚速度。在水解結(jié)束后，將凝膠注入活化的毛細(xì)管中，縮聚反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，毛細(xì)管璧上的硅羥基也參與反應(yīng)，從而將部分硅凝膠固定在

7、管壁上；將剩余的凝膠用氮?dú)鉀_出，縮聚反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，固定在管璧上的凝膠通過干燥和老化形成一薄層帶有固定相的多孔硅膠10-11。開管柱缺點(diǎn)是柱效比填充柱低，柱容量比填充柱小。 2.3 整體式毛細(xì)管電色譜 整體式色譜柱又稱為連續(xù)床式色譜柱，是通過原位聚合或熔凝在毛細(xì)管中形成連續(xù)、整體、多孔的固定相床層12。按照聚合物制備的原料，整體柱分為有機(jī)聚合物整體柱，無機(jī)聚合物整體柱和有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱。有機(jī)整體柱是利用兩種有機(jī)物在毛細(xì)管內(nèi)發(fā)生聚合反應(yīng)，形成連續(xù)的固定相。如ye13等采用甲基丙烯酸縮水甘油酯和亞乙基二甲基丙烯酸酯聚合制備了中性的聚合物整體柱，然后再聚合物表面修飾了一層胰島素用于在線消化蛋白質(zhì)。

8、有機(jī)整體柱的不足之處在于有機(jī)物容易發(fā)生溶脹，穩(wěn)定性較差9。 無機(jī)整體柱也叫硅膠整體柱，是以烷氧基為主要原料，以溶膠-凝膠技術(shù)制備的整體柱。硅膠整體柱具有良好的耐溶劑和高低溫性能，比表面積大，易于控制孔結(jié)構(gòu)，機(jī)械強(qiáng)度高等優(yōu)點(diǎn)14。除了一般的硅膠整體柱，利用硅膠基質(zhì)固定相表面帶有大量的硅羥基，可進(jìn)一步進(jìn)行衍生化修飾，如引入強(qiáng)極性基團(tuán)氰基，乙二胺基團(tuán)等，形成表面修飾改性的硅膠毛細(xì)管整體柱。 有機(jī)-無機(jī)整體柱集合了有機(jī)整體柱和無機(jī)整體柱的優(yōu)點(diǎn)，其無機(jī)部分可提供機(jī)械強(qiáng)度穩(wěn)定的聚合骨架，而結(jié)合于無機(jī)相上且均勻分布的有機(jī)基團(tuán)可以改善固定相的性能。其采用溶膠-凝膠法，以硅氧試劑和帶有其他功能基團(tuán)的硅氧烷試劑作

9、為反應(yīng)前驅(qū)體，可以在溫和的條件下制備。 3 檢測(cè)器 毛細(xì)管電色譜是一種微分離，分離通道內(nèi)徑一般為50-100m，進(jìn)樣量一般是納升級(jí)的，這就對(duì)檢測(cè)器的靈敏度提出了很高的要求。除了使用常規(guī)的紫外-可見檢測(cè)外，還需要靈敏度更高的熒光/激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，電化學(xué)檢測(cè)器，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器，為了配合分析的需要，還可以與質(zhì)譜，核磁共振技術(shù)聯(lián)用。 其中，熒光/激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器（fl/lif）是毛細(xì)管電色譜中用的較多的另一種商品化的儀器。其最大的優(yōu)點(diǎn)就是靈敏度高。特別是lif，應(yīng)用強(qiáng)度高，相干性好的激光作為激發(fā)光，其檢測(cè)限可達(dá)10-1410-16mol/l，可進(jìn)行超痕量分析。但是其激發(fā)波長和發(fā)射波長單一，激光器

10、壽命短，價(jià)格昂貴，而且自然界中很多非熒光活性物質(zhì)需要進(jìn)行衍生化處理后才能使用，這些都限制了lif的應(yīng)用。 4 電色譜的應(yīng)用 毛細(xì)管電色譜是一種高效，快速的分離手段，廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，如生物大分子蛋白質(zhì)、核酸的分離分析，環(huán)境監(jiān)測(cè)，殘留農(nóng)藥的檢測(cè)，化工，食品中營養(yǎng)成分和添加劑的分離檢測(cè)，藥物的分析，復(fù)雜中藥成分的分析等。現(xiàn)就其在藥學(xué)方面分離物質(zhì)的應(yīng)用做簡要的介紹。 4.1 手性藥物的分離 手性藥物的分離主要有三種方法：一是使用手性固定相，二是在流動(dòng)相中使用手性添加劑，三是將藥物進(jìn)行手性衍生化生成非對(duì)映異構(gòu)體復(fù)合物。常用的是使用手性毛細(xì)管柱，常用的是將環(huán)糊精、蛋白質(zhì)、膽酸鹽、冠醚，大環(huán)內(nèi)酯，多糖等

11、具有手性識(shí)別作用的物質(zhì)鍵和到毛細(xì)管柱內(nèi)壁。分子印跡毛細(xì)管電色譜整體柱在手性藥物分析及結(jié)構(gòu)很相近物質(zhì)之間的分離中卓有成效。分子印跡技術(shù)（mit）是模擬自然界所存在的分子識(shí)別作用，如酶與底物、抗體與抗原等，以目標(biāo)分子為模板合成分子印跡聚合物的方法，這種印跡聚合物對(duì)目標(biāo)分子具有專一識(shí)別性26。lin等以丹?；?l-亮氨酸作為手性印跡分子，通過本體聚合法制備了mip柱，并在這種柱子上分離了丹?；?d，l-亮氨酸對(duì)映體。 4.2 酸、堿性藥物的分析 在使用常見的ods固定相分析酸性藥物時(shí)，由于在一般的高的ph下，酸性藥物一般帶負(fù)電，分離時(shí)間延長，甚至不出峰。分離堿性藥物時(shí)，由于固定相表面硅羥基對(duì)堿性化合

12、物具有吸附作用，常常會(huì)出現(xiàn)峰拖尾、保留時(shí)間重現(xiàn)性不佳及不出峰等現(xiàn)象?？梢詤⒖糷plc的分離模式，從以下三個(gè)方面進(jìn)行解決。采用離子抑制的分離模式；采用離子對(duì)作用調(diào)節(jié)酸性藥物的分離；采用反相或者親水作用的色譜與陰、陽離子交換混合模式固定相，可以在流動(dòng)相組成較大的范圍內(nèi)得到較強(qiáng)且穩(wěn)定的電滲流。另外，lin15等報(bào)道了一種兩性對(duì)羥基甘氨酸硅膠整體柱，其電滲流的大小和方向可通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的ph值來控制，應(yīng)用于酸性和堿性物質(zhì)的分離。 4.3 藥物膜通透性篩選中的應(yīng)用 脂質(zhì)體與生物膜組成及性質(zhì)上相似，將脂質(zhì)體固定在毛細(xì)管內(nèi)壁形成脂質(zhì)體電色譜，可以研究藥物與脂質(zhì)體的相互作用，能最大程度的反映藥物分子與生物膜相

13、互作用的真實(shí)情況，作為一種體外篩選工具，加快了藥物的膜通透性高通量篩選。其制作方法包括物理涂布和化學(xué)鍵和，除了用于研究藥物與生物膜的作用外，還可以用來研究多肽、蛋白質(zhì)與生物膜的作用16。 4.4 微全分析系統(tǒng)中的應(yīng)用 微全分析系統(tǒng)（-tas）是通過化學(xué)分析設(shè)備的微型化與集成化，最大限度地把分析實(shí)驗(yàn)室的功能轉(zhuǎn)移到便攜的分析設(shè)備中，甚至集成到方寸大小的芯片上，最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)分析實(shí)驗(yàn)室的“個(gè)人化”、“家用化”，從而使分析科學(xué)及分析儀器從化學(xué)實(shí)驗(yàn)室解放出來，進(jìn)入千家萬戶17。由于芯片上通道的直徑只有幾十微米，甚至更低，填充固定相后有效尺寸顯著降低，驅(qū)動(dòng)該系統(tǒng)所需要的壓力將遠(yuǎn)高于目前hplc所采用的壓力

14、18，成為hplc在-tas應(yīng)用中的很大的障礙。cec中產(chǎn)生電滲流為柱塞流，其大小幾乎不受填充介質(zhì)顆粒直徑的限制19-20，說明通過降低孔徑來提高分離效率不會(huì)降低色譜的驅(qū)動(dòng)力-電滲流，從而使cec應(yīng)用于芯片結(jié)構(gòu)時(shí)更有優(yōu)勢(shì)。 5 總結(jié) 電色譜作為上個(gè)世紀(jì)八十年代興起的一種分離技術(shù)，經(jīng)過了約四十年的研究，在理論和應(yīng)用上都得到了發(fā)展。目前在藥學(xué)方向應(yīng)用較多，發(fā)展最快，但是電色譜憑借其高效、快速、高選擇性等優(yōu)勢(shì)，必將活躍于其他領(lǐng)域，如環(huán)境監(jiān)測(cè)，水質(zhì)分析、公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)等。其一，電色譜應(yīng)用最多的流動(dòng)相是緩沖液系統(tǒng)，這與水質(zhì)分析的樣品完全匹配，可以不經(jīng)過處理直接進(jìn)樣；其二，電色譜可以與多種檢測(cè)器聯(lián)用，可以滿

15、足環(huán)境樣品高靈敏度的要求；其三，電色譜具有的小的柱內(nèi)徑和流速，這跟質(zhì)譜有很好的適應(yīng)性，可給出物質(zhì)的分子量和結(jié)構(gòu)信息，可以實(shí)現(xiàn)其對(duì)樣品的定性監(jiān)測(cè)和定量控制。隨著電色譜的發(fā)展與成熟，我們期待其在環(huán)境監(jiān)測(cè)、水質(zhì)分析、公共衛(wèi)生監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域有新的突破。 參考文獻(xiàn) 1 pretorius v，hopkins b j，schieke j d. the research progress of capillary electrochromatographyj. chromatograph，1974，99：23-30. 2 jorgenson j w，lukacs k d. the research progre

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