復方丹參滴丸人含藥血清中丹參相關代謝產物的分析

1、復方丹參滴丸人含藥血清中丹參相關代謝產物的分析 作者：鄭曉暉，王世祥，趙新鋒，趙欣，劉青，鄭建斌 【關鍵詞】 復方丹參滴丸；含藥血清；色譜法,高壓液相；代謝 analysis on danshenrelated metabolites induced by compound danshen dripping pills in human serum 【abstract】 aim: to detect danshenrelated metabolites induced by compound danshen dripping pills in human serum and elucidate

2、 the possible metabolic pathway of those metabolites. methods: column switchinghigh performance liquid chromatography was used to concentrate and separate the metabolites, which were detected by electrospray ionization trap mass spectrometry. the structure of the metabolites was analyzed by multista

3、ge mass spectrometry. results: five new metabolites were found and their possible metabolic pathways were elucidated. conclusion: this work has contributed to studying the intracorporal substantial foundation of compound danshen dripping pills. 【keywords】 compound danshen dripping pills; ionization;

4、 chromatography, high pressure liquid; metabolism 【摘要】 目的：研究復方丹參滴丸人含藥血清中丹參相關代謝產物，推測其代謝機制. 方法：柱切換高效液相色譜法富集和分離血清樣品中的代謝物，電噴霧離子阱質譜法進行檢測，多級質譜技術確定代謝物的碎片結構，推測其結構. 結果：在人含藥血清中檢測到了5個新的代謝產物，分析了各代謝物的體內形成機制. 結論：本研究可為復方丹參滴丸體內物質基礎的研究打下基礎. 【關鍵詞】 復方丹參滴丸；含藥血清；色譜法，高壓液相；代謝 0引言 復方丹參滴丸是根據(jù)中國藥典1995年版復方丹參片的處方提取有效成分研制而成的中藥滴丸

5、劑，主要成分為丹參、三七和冰片，臨床上用于治療胸中憋悶、心絞痛，現(xiàn)已被定為全國中醫(yī)醫(yī)院急診必備中成藥1. 丹參是復方丹參滴丸的主方藥，活性成分有兩大類，一類是脂溶性的二萜醌類，另一類為水溶性的酚酸類化合物. 王寧生等2采用lcms法對口服復方丹參滴丸后，人含藥血清中丹參相關代謝產物的分子量進行定性檢測，但沒能對其代謝機制進行探討. 液相色譜離子阱質譜以其高效的分離能力和檢測能力，已成為藥物及其代謝物質研究的主要手段3-7. 我們利用lcmsn聯(lián)用技術對舌下含服復方丹參滴丸后，人含藥血清中丹參的相關代謝產物進行了定性分析，并初步探討相應的代謝機制，為復方丹參滴丸中丹參的體內作用物質基礎研究提供一

6、定的參考. 1材料和方法 1.1材料agilent 1100系列高效液相色譜系統(tǒng)（包括2套單元輸液泵，vwd紫外檢測器，dad二極管陣列檢測器，agilent 4.02工作站）；agilent 1100系列sl型離子阱質譜系統(tǒng). 丹參素對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號110855200504），色譜純乙腈（美國fisher公司），超純蒸餾水（自制），其他試劑均為分析純. 1.2方法 1.2.1對照品溶液的制備精密稱取丹參素對照品3.8 mg，用甲醇溶解至10.0 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，配制成0.38 g/l的對照品溶液，4貯藏備用. 1.2.2空白血清供試品溶液的制備健康志愿者空腹，

7、 取空白血清0.5 ml， 置1 ml具塞離心試管中， 加0.3 mol/l的三氯乙酸0.1 ml， 離心10.0 min （12 000 r/min）， 精密量取0.4 ml上清液置于試管中，氮氣吹干，殘渣用150 ml/l甲醇溶解，轉入1.0 ml容量瓶中，加150 ml/l甲醇至刻度，搖勻，過濾，作為供試品溶液，4貯藏備用. 1.2.3空白血清加藥供試品溶液的制備健康志愿者空腹，取空白血清0.5 ml，加入0.5 ml藥品供試品溶液，按1.2.2項下的樣品制備方法制備樣品，即得空白血清加藥供試品溶液. 1.2.4含藥血清供試品溶液的制備健康志愿者10名，空腹舌下含服10粒復方丹參滴丸，分

8、別于服藥后0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，24.0 h，靜脈取血4.0 ml，15 000 r/min離心10 min，制得含藥血清. 取0.5 ml置1 ml具塞離心試管中，按1.2.2項下的樣品制備方法制備樣品，即得含藥血清供試品溶液. 1.2.5分析條件及方法一級柱：agilent sbc18柱(150 mm2.1 mm，5 m)；二級柱：agilent sbc18柱(150 mm2.1 mm，5 m)；一級流動相為甲醇水(3070)，流速為0.8 ml/min；二級流動相為甲醇水甲酸銨(15850.5)，流速為0.2 ml/m

9、in；esi電離源；電離源模式為負離子模式；干燥氣流速為7.0 l/min；霧化氣壓力為1815.2 mmhg (1 mmhg=0.133 kpa)；干燥氣溫度為325. 采用文獻8方法，優(yōu)化后進行樣品分析. 分別取對照品溶液和3種供試品溶液，自動進樣器進樣10 l，5.5 min切換，選擇電噴霧負離子模式檢測. 2結果 2.1丹參對照藥材的esi質譜裂解行為解析在全掃描一級質譜條件下，可獲得丹參對照藥材的總離子流圖（圖1），對總離子流圖中的相對峰度大于5.0%的色譜峰進行一級全掃描分析，得準分子離子m/z 137.2mh-，m/z 196.8mh-，m/z 297.0mh-，m/z 309.

10、2mh-，m/z 293.4mh-. 對這5個分子離子峰分別進行多級質譜分析，發(fā)現(xiàn)：m/z 137.2的二、三、四級碎片離子分別為m/z 109.1, m/z 92.8和m/z 76.9，結合原兒茶醛對照品的質譜信息，證實m/z 137.2為原兒茶醛在此分析條件的分子離子峰；m/z 196.8mh-的二級和三級碎片離子分別為m/z 179.5和m/z 134.4，推測碎片離子m/z 196.8為丹參素對照品的準分子離子峰；m/z 297.0的二級和三級碎片離子分別為m/z 281.7和m/z 266.6，推測m/z 297.0為隱丹參酮的分子離子峰；m/z 309.2的二級和三級碎片離子分別為

11、m/z 278.2和m/z 263.2，推測m/z 309.2為丹參酮b分子離子峰；m/z 293.4的二級和三級碎片離子分別為m/z 278.2和m/z 261.2，推測m/z 293.4為丹參酮a在此分析條件下形成的分子離子峰. 圖1丹參對照藥材供試品溶液總離子流略 2.2血清供試品溶液的分析根據(jù)1.2.5項下的分析條件，對空白血清、空白血清加藥和含藥血清供試品溶液進行分析，得總離子流圖（圖2）. 通過對比分析，排除了內源性成分的干擾，發(fā)現(xiàn)峰1，2，3，4和5為新出現(xiàn)的色譜峰，對應的分子離子峰為m/z 109.4，m/z 166.9，m/z 239.2，m/z 278.2，m/z 377.

12、1，推測其為原藥中丹參相關成分的特征代謝產物. 圖2血清樣品總離子流略 2.3特征代謝產物質譜分析 2.3.1碎片離子m/z 109.4和m/z 166.9的多級質譜分析選m/z 109.4為母離子進行ms2和ms3分析，得到的主要碎片依次為m/z 93.6和m/z 76.6，推測m/z 109.4為原兒茶醛在人體內的代謝物兒茶酚，其產生機制和esi裂解路線如圖3. 圖3特征代謝物m/z 109.4產生機制及裂解路線圖略 選m/z 166.9為母離子進行質譜分析，其二級質譜碎片離子主要為m/z 122.8，再進行裂解碎片的多級質譜分析時，各級質譜相應豐度較大的碎片依次為m/z 122.8, m

13、/z 92.7, m/z 76.8，由香草酸對照品的質譜信息獲知該化合物為香草酸，推測其為原兒茶醛在體內的另一個代謝物，其產生機制和esi裂解路線如圖4. 圖4特征代謝物m/z 166.9產生機制及裂解路線圖略 2.3.2碎片離子m/z 239.2的多級質譜分析選m/z 239.2為母離子進行二級質譜分析，獲得的碎片離子為m/z 223.4，再進行多級質譜分析時發(fā)現(xiàn)，該離子是按照如下過程進行裂解：m/z 239.2m/z 223.4m/z 137.6m/z 120.1 m/z 104.2m/z 76.2，推測m/z 239.2為丹參素在體內的主要代謝產物(3,4二羥基苯基）羥基丙酸異丙酯，其產

14、生機制和esi裂解路線如圖5. 圖5特征代謝物m/z 239.2產生機制及裂解路線圖略 2.3.3碎片離子m/z 278.2的多級質譜分析選擇m/z 278.2為母離子進行ms2分析，得主要碎片離子m/z 263.3和m/z 250.2，結合丹參酮b的多級質譜信息，推測m/z 278.2為丹參酮b在體內的主要代謝產物，產生機制和esi裂解路線如圖6. 圖6特征代謝物m/z 278.2產生機制及裂解行為路線圖略 2.3.4碎片離子m/z 377.1的多級質譜分析選擇m/z 377.1為母離子進行ms2分析，得主要碎片離子m/z 182.2和m/z 152.8. 再分別進行ms3分析，則均形成碎片

15、離子m/z 92.6，推測m/z 377.1為丹參素在udp葡萄糖醛酸轉移酶作用下在體內的主要代謝產物，產生機制和esi裂解路線如圖7. 圖7特征代謝物形m/z 377.1產生機制及裂解行為路線圖略 3討論 對該含藥血清的質譜分析結果顯示，丹參素在酸性條件下易形成不穩(wěn)定的二聚體結構，在體內易被酯化形成(3,4二羥基苯基)羥基丙酸異丙酯，或者與體內葡萄糖醛酸結合形成酯型葡萄糖苷酸；原兒茶醛在體內易被氧化為原兒茶酸，該酸在體內易脫羧形成兒茶酚，或甲基化形成香草酸；丹參酮b在體內易失去羥甲基. 目前對代謝物的研究主要集中在對中藥單體成分的代謝化學研究，對中藥材及其中藥復方的代謝化學研究還處于起步階段

16、，文獻報道的還很少. 我們采用cshplcesimsn聯(lián)用技術對復方丹參滴丸中丹參在人體內的相關代謝產物進行研究，可為丹參在其他體液或組織中代謝產物的研究提供方法學參考. 【參考文獻】 1 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典一部m. 北京:化學工業(yè)出版社, 1995:545-546. 2 王寧生,宓穗卿,洪馨,等. 口服復方丹參滴丸血清中丹參相關成分的lc/ms檢測j.中國新藥與臨床,2000,11(3): 141-142. 3 陳紅,張丹,楊宇. 替拉扎明在家兔體內的代謝研究j.分析化學,2005, 33(10):1045-1048. 4 彭濤,儲曉剛,楊強,等. 高效液相色譜/串

17、聯(lián)質譜法測定奶粉中的硝基呋喃代謝物j. 分析化學, 2005,33(8): 1073-1076. 5 liu ac, lou hx, zhao lx, et al. validated lc/ms/ms assay for curcumin and tetrahydrocurcumin in rat plasma and application to pharmacokinetic study of phospholipid complex of curcumin j. j pharm biomed anal, 2006, 40:720-727. 6 fang tz, wang yg, ma y, et al. a rapid lc/ms/ms quantitation assay for naringin and its two metabolites in rats plasma j. j pharm biomed anal, 2006, 40:454-459. 7 etter ml, george s, gra