AFLP技術(shù)的基本原理

1、aflp 技術(shù)的基本原理與實驗方法aflp 技術(shù)的基本原理:aflp 技術(shù)是一項新的分子標記技術(shù)，其原理是：基因組dna經(jīng)過二種酶不同的限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生粘性末端，再使用連接酶將人工合成的雙鏈接頭連接在酶切位點的粘性末端。接頭一端具有與內(nèi)切酶同樣的識別粘性末端，互補連接后成為dna模板進行預(yù)擴增。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個堿基序列作為引物的結(jié)合位點。引物由3部分組成: 核心堿基序列，該堿基序列與人工接頭互補；特異性酶切序列；引物3端選擇性堿基。選擇性堿基延伸到酶切片段區(qū)，這樣就只有那些兩端序列能與選擇堿基配對的限制性酶切片段被擴增。另外，通過選擇在末端分別添加了13個選擇性核苷酸的

2、不同引物，可以達到選擇擴增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物選擇性地識別具有特異配對序列的內(nèi)切酶酶切片段。并與之結(jié)合，實現(xiàn)特異性擴增。實驗方法:(1) dna 酶切aflp技術(shù)成功的關(guān)鍵在于dna的充分酶切,所以對模板質(zhì)量要求較高,在dna完全溶解后利用紫外分光光度儀測定dna濃度，將dna濃度用雙蒸水調(diào)整到50ng/ul,應(yīng)避免其他dna污染和抑制物質(zhì)的存在。表1：e-m酶切體系反應(yīng)體系（e-m組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ulecor(10u/ ul)0.25ul0.5 ulmse (10u/ ul)0.15ul0.3 ultango buffer (10)2

3、.50ul5.0 ulddh2o8.10ul16.2 ul總體積12.5ul25 ul表2：p-m酶切體系反應(yīng)體系（p-m組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ulpst(10u/ ul)0.25ul0.5 ulmse (10u/ ul)0.15ul0.3 ulbuffer r (10)1.25ul2.5 ulddh2o9.35ul18.7 ul總體積12.5ul25 ul表3：p-t酶切體系反應(yīng)體系（p-t組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ultaq(10u/ ul)0.15ul0.3 ulpst (10u/ ul)0.5ul1.0 ulb

4、uffer taq (10)1.25ul2.5 ulddh2o9.10ul18.2 ul總體積12.5ul25 ul表4：e-t酶切體系反應(yīng)體系（e-t組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ultaq(10u/ ul)0.3ul0.6 ulecor(10u/ ul)0.25ul0.5 ulbuffer taq (10)1.25ul2.5 ulddh2o9.20ul18.4 ul總體積12.5ul25 ul表5：m-s酶切體系反應(yīng)體系（m-s組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ulsac(10u/ ul)0.5ul1.0 ulmse (10u/

5、ul)0.3ul0.6 ultango buffer (10)1.25ul2.5 ulddh2o8.95ul19.9 ul總體積12.5ul25 ul表6：t-s酶切體系反應(yīng)體系（t-s組合）1/2倍1倍dna（50ng/ul）1.50ul3.0 ulsac(10u/ ul)0.25ul0.5 ultaq(10u/ ul)0.3ul0.6 ulbuffer sac(10)1.25ul2.5 ulddh2o9.2ul18.4 ul總體積12.5ul25 ul表7：常用內(nèi)切酶酶切位點、最適溫度、接頭名稱和預(yù)擴引物內(nèi)切酶酶切位點最適反應(yīng)溫度接頭名稱預(yù)擴引物選擴引物ecorgaattccttaag37

6、eadeaecea01ea16ec01ec16msetta aaatt65madmcmgmc01-mc16mg01-mg16pstctgcaggacgtc37padp0p001- p016taqtcgaagct65tadtctgtc01-tc16tg01-tg16sacgagctcctcgag37sadsasa01-sa16先將模板吸入pcr板中，再將內(nèi)切酶、buffer、雙蒸水配制為mix（因內(nèi)切酶用量很少或者因少數(shù)槍頭質(zhì)量問題，每次吸取內(nèi)切酶時一定要注意觀察吸取是否足量），將配制好的mix加入到模板中，最后在配好的反應(yīng)體系中加入礦物油覆蓋離心，放入pcr儀或水浴鍋中37條件下56小時，然后

7、立即轉(zhuǎn)入65條件下1小時完全酶切。一般做1/2倍體系即可。目前本實驗室擁有的內(nèi)切酶有：ecor；mse；pst；taq；sac,以上內(nèi)切酶均為fermentas公司生產(chǎn)。(2) 連接表8：連接體系連接體系1/2倍1倍接頭ead/pad/sad0.5 ul1.0 ulmad/tad0.5 ul1.0 ult4連接酶（10u/ ul)0.15 ul0.3 ult4連接酶buffer2.5 ul5 ulddh2o8.8 ul17.7 ul總體積12.5 ul25 ul在連接的過程中不同的內(nèi)切酶都有其對應(yīng)的接頭（表7），不同的酶切組合就用相應(yīng)的接頭組合。將配制好的連接mix加入酶切產(chǎn)物中（要與酶切體系

8、等體積），用保鮮膜包好室溫下連接過夜。在配制連接mix時t4連接酶buffer容易產(chǎn)生沉淀，最好待其完全融解后適當振蕩將沉淀溶解。接頭的制備：在公司合成的接頭為單鏈干粉（2 od/管，要將接頭制備為雙鏈。mad的制備程序是，先將mf和mr干粉在12000/分鐘離心一分鐘，然后mf加入127ul，mr加入135ul雙蒸水完全溶解后各取127ul混合，在65水浴鍋中10min再轉(zhuǎn)入37/10min最后室溫下放置10min即可。ead、 pad、sad和tad的制備程序是，先將ef(pf、sf、tf)和er(pr、sr、tr)干粉在12000/分鐘離心一分鐘，然后ef(pf、sf、tf)加入1270

9、ul，er(pr、sr、tr)加入1350ul雙蒸水完全溶解后各取350ul混合，在水65浴鍋中10min再轉(zhuǎn)入37/10min最后室溫下放置10min即可。（3）預(yù)擴增：將連接產(chǎn)物稀釋5倍混勻后作為預(yù)擴增的模板，在預(yù)擴的過程中每一種內(nèi)切酶都有其對應(yīng)的一組或兩組預(yù)擴引物（表7），不同的酶切組合就用對應(yīng)的一組或多組預(yù)擴引物組合。表9：預(yù)擴體系（以e-m組合為例）預(yù)擴體系1倍2倍dna（連接產(chǎn)物稀釋）5 ul10 ulbuffer2.5 ul5.0 ulmgcl22.0 ul4.0 uldntp0.4 ul0.8 ultaq0.2 ul0.4 ulddh2o13 ul26 ulprimer1 ea

10、ec1.0 ul2.0 ulprimer2 mcmg1.0 ul2.0 ul總體積25 ul50 ule-m組合因為e組合有預(yù)擴引物ea和ec，m組合有預(yù)擴引物mc和mg，所以e-m組合一共可以進行四種引物組合的預(yù)擴增，即ea-mc、ea-mg、ec-mc、ec-mg，其它酶切連接組合可依此類推。將預(yù)擴產(chǎn)物在瓊脂糖電泳檢測，帶型應(yīng)為彌散狀。根據(jù)檢測結(jié)果來確定預(yù)擴產(chǎn)物稀釋倍數(shù)，一般為15到30倍。（4）選擇性擴增：根據(jù)預(yù)擴產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測的結(jié)果，將預(yù)擴產(chǎn)物稀釋適當?shù)谋稊?shù)混勻后作為選擇性擴增的模板表10：選擴體系選擴體系1倍2倍dna（預(yù)擴產(chǎn)物稀釋）3 ul3 ulbuffer1.5 ul3.0

11、 ulmgcl21.2 ul2.4 uldntp0.3 ul0.6 ultaq0.2 ul0.4 ulddh2o6.8 ul13.6 ulprimer1 ea01ea16ec01ec161.0 ul2.0 ulprimer2 mc01mc16mg01mg161.0 ul2.0 ul總體積15 ul30 ul每一種預(yù)擴引物組合擴增的產(chǎn)物可以有1616256對對應(yīng)的其選擴引物進行選擇性擴增。例：如果預(yù)擴引物組合為ea-mc，那么ea對應(yīng)的就會有ea01到ea16共16對選擴引物，mc對應(yīng)的就有mc01到mc16共16對選擴引物，而它們進行隨機組合就可以形成1616256對選擴引物組合了。最后將選擇性擴增產(chǎn)物變性后在聚丙烯酰胺變性凝膠上電泳檢測。由于aflp實驗步驟繁瑣，涉及實驗試劑多，極易造成實驗體系不穩(wěn)定導(dǎo)致實驗失敗，所以酶切、連接、預(yù)擴和選擴實驗應(yīng)在冰上操作完成，并嚴格按照操作規(guī)范操作。實驗中所用到的酶、接頭和引物要防止污染和降解。實驗如果失敗應(yīng)首先從酶切開始分步