仁用杏品種SRAP遺傳多樣性分析及指紋檢索系統(tǒng)的開發(fā)

1、園 藝 學(xué) 報 2014，41（6）：11911197 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20131227；修回日期：20140505 基金項目：河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點項目（zh2007116，zd20131025） * 通信作者 author for correspondence（e-mail：apf2002） 仁用杏品種srap遺傳多樣性分析及指紋檢索系統(tǒng)的開發(fā) 艾鵬飛，蘇 姍，靳占忠* （河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018） 摘 要：利用sra

2、p標記對24份仁用杏品種進行了遺傳多樣性分析。15對引物共擴增出280條帶，其中241條為多態(tài)性譜帶，多態(tài)性比率為85.34%；每個引物組合擴增譜帶數(shù)在13 24條之間，平均為18.7條；多態(tài)性信息含量（pic）在0.28 0.65之間，平均為0.51?；谝飉e4-em4擴增的多態(tài)性譜帶，構(gòu)建的指紋檢索系統(tǒng)可以區(qū)分24個仁用杏品種。根據(jù)srap擴增結(jié)果，利用upgma法構(gòu)建樹狀聚類圖，在相似系數(shù)為0.70處可將24個仁用杏品種分為4組，聚類結(jié)果與形態(tài)分類基本一致。 關(guān)鍵詞：仁用杏；srap；遺傳多樣性；指紋檢索系統(tǒng) 中圖分類號：s 662.2 文獻標志碼：a 文章編號：0513-353x（

3、2014）06-1191-07 analysis of genetic diversity and development of fingerprinting key among accessions of kernel-using apricot using srap markers ai peng-fei，su shan，and jin zhan-zhong* （college of biological science and engineering，hebei university of science and technology，shijiazhuang 050018，china）

4、 abstract：in order to evaluate the genetic relationship among accessions of kernel-using apricot，sequence related amplified polymorphism（srap）markers were used to evaluate genetic diversity of 24 samples. fifteen primer pairs generated 280 bands，241 bands（85.34%）of which were polymorphic ones. srap

5、primer pairs amplified 13 to 24 bands with an average of 18.7 bands per primer pair. polymorphic information content（pic）ranged from 0.28 to 0.65 with an average of 0.51. a fingerprinting key，established on the base of polymorphic bands amplified by a primer pair of me4-em4，could discriminate 24 acc

6、essions of kernel-using apricot. a dendrogram was constructed based on srap data using upgma culster method. the 24 accessions were classified into 4 major groups at the genetic similarity coefficient of 0.70，which was basically corresponded with the genetic relationship based on morphological trait

7、s. key words：kernel-using apricot；srap；genetic diversity；fingerprinting key 中國各地栽培的仁用杏品種（系）主要來自民間，就近芽接，以致品種混雜，同物異名和同名異物現(xiàn)象嚴重，其遺傳背景和品種間親緣關(guān)系模糊不清，這對仁用杏的栽培利用和遺傳改良造成了 1192 園 藝 學(xué) 報 41卷 不便（侯智霞 等，2008）。 srap（sequence-related amplified polymorphism，相關(guān)序列擴增多態(tài)性）標記廣泛分布于基因組間（li & quiros，2001），作為遺傳多樣性研究（song et al.

8、，2010）、種質(zhì)鑒定（zhou et al.，2011）、遺傳圖譜構(gòu)建（章秋平 等，2011；zhang et al.，2012）、基因定位（xue et al.，2010）等的有效工具，已被廣泛應(yīng)用于動物、植物基因組的研究（ding et al.，2010；deng et al.，2013）。 本研究中采用srap標記對生產(chǎn)上主栽的仁用杏品種進行遺傳多樣性分析，構(gòu)建srap指紋檢索圖譜和親緣關(guān)系upgma聚類圖，為仁用杏品種鑒別及雜交親本的選配提供依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 植物材料 試驗于20122013年在河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院遺傳工程實驗室進行。供試材料來自河北省張家口市

9、農(nóng)業(yè)科學(xué)院仁用杏資源圃和遼寧國家果樹種質(zhì)熊岳李杏圃，包括24個仁用杏（prunus armeniaca l.）品種和優(yōu)系（表1）。 表1 供試的仁用杏材料及來源 table 1 accessions of kernel-using apricot and their origin in the test 編號 code 品種 cultivar 來源 origin 編號 code 品種 cultivar 來源 origin 1 龍王帽 longwangmao 河北 hebei 13 龍豐 longfeng 河北 hebei 2 超仁 chaoren 遼寧 liaoning 14 80a03 河北

10、 hebei 3 c210-5 遼寧 liaoning 15 80b05 河北 hebei 4 國仁 guoren 遼寧 liaoning 16 79c13 河北 hebei 5 油仁 youren 遼寧 liaoning 17 斑龍 banlong 河北 hebei 6 豐仁 fengren 遼寧 liaoning 18 優(yōu)一 youyi 河北 hebei 7 80e05 河北 hebei 19 中仁1號 zhongren 1 河北 hebei 8 一窩蜂 yiwofeng 河北 hebei 20 新4號xin 4 河北 hebei 9 長城1號 changcheng 1 河北 hebei

11、21 三桿旗 sanganqi 河北 hebei 10 80d05 河北 hebei 22 綠源2號 lyuan 2 內(nèi)蒙古 inner mongolia 11 薄殼1號 boke 1 河北 hebei 23 白玉扁 baiyubian 北京 beijing 12 圍選1號 weixuan 1 河北 hebei 24 串鈴扁 chuanlingbian 北京 beijing 1.2 dna提取和pcr擴增 提取仁用杏嫩葉基因組dna（艾鵬飛 等，2009），經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用紫外分光光度計檢測，將dna濃度稀釋至30 ng l-1，置于20 備用。 設(shè)計正、反向srap引物（l

12、i & quiros，2001）各9條（表2），兩兩配對組成81個組合（me-em）?；谇捌谘芯浚òi飛 等，2009），srap反應(yīng)體系（20 l）包括：模板dna 30 50 ng，dntps 0.2 mmol l-1，mg2+ 2.5 mmol l-1，引物濃度0.9 mol l-1，taqdna聚合酶1.5 u；srap擴增程序為：94 預(yù)變性5 min，94 變性1 min，35 退火1 min，72 延伸1.5 min，5個循環(huán)，94 變性1 min，52 退火1 min，72 延伸1.5 min，28個循環(huán)，72 延伸10 min，4 保存。pcr產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳，

13、eb染色后凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析。 1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 電泳圖譜中每條遺傳變異的帶均為一個分子標記，代表1對srap引物的結(jié)合位點。根據(jù)條帶6期 艾鵬飛等：仁用杏品種srap遺傳多樣性分析及指紋檢索系統(tǒng)的開發(fā) 1193 的有無統(tǒng)計所有的二元數(shù)據(jù)（有帶為1，無帶為0）。根據(jù)二元數(shù)據(jù)計算引物組合多態(tài)性比率（%）= 多態(tài)性條帶數(shù)/總條帶數(shù) 100，多態(tài)性信息含量（pic）= 1pi2，其中pi為第i個等位基因在該位點出現(xiàn)的基因頻率（anderson et al.，1993）。采用軟件ntsys-pc 2.1（rohlf，2000）計算jaccards相似系數(shù)，根據(jù)類平均法（upgma）進行聚類分

14、析，建立樹狀圖。 表2 srap引物及序列 table 2 primers and sequences of srap 引物名稱 primer 正向序列（53） forward sequence 引物名稱 primer 反向序列（53） reverse sequence me1 tgagtccaaaccggagc em1 gactgcgtacgaatttgc me2 tgagtccaaaccggacc em2 gactgcgtacgaatttga me3 tgagtccaaaccggtaa em3 gactgcgtacgaattaac me4 tgagtccaaaccggtcc em4 gac

15、tgcgtacgaattgag me5 tgagtccaaaccggtgc em5 gactgcgtacgaatttca me6 tgagtccaaaccggtca. em6 gactgcgtacgaattctt me7 tgagtccaaaccggaga em7 gactgcgtacgaattgca me8 tgagtccaaaccggaag em8 gactgcgtacgaattgcc me9 tgagtccaaaccggact em9 gactgcgtacgaattatt 2 結(jié)果與分析 2.1 srap標記多態(tài)性分析 在81對srap引物組合（me-em）中，15對擴增出多態(tài)性豐富、穩(wěn)

16、定性好、分辨率高的譜帶。圖1為引物組合me3-em4的擴增圖譜。 圖1 srap引物組合me3-em4對24個仁用杏品種的擴增圖譜 fig. 1 patterns for 24 accessions of kernel-using apricot amplified by the srap primer me3-em4 用此15對引物對24個仁用杏品種進行擴增，結(jié)果（表3）表明，每對引物擴增出13 24條清晰的譜帶，平均每對引物產(chǎn)生18.7條譜帶，15對引物共產(chǎn)生280條帶，其中241條為多態(tài)性譜帶，多態(tài)性比率為85.34%；每對引物擴增多態(tài)性條帶數(shù)為11 24條不等，多態(tài)性比率在76.47%

17、 100%之間，平均每對引物產(chǎn)生16.1條多態(tài)性譜帶；兩個引物組合（me4-em3和me4-em4）分別擴增出的21條和24條譜帶，均為多態(tài)性譜帶，多態(tài)性比率100%。 表3表明，15對srap引物的pic值在0.28 0.65之間，平均為0.51，多數(shù)引物組合（66.7%）的pic值超過0.5，為高度多態(tài)性信息引物，少數(shù)（33.3%）為中度多態(tài)性信息引物（0.25 pic 1194 園 藝 學(xué) 報 41卷 0.5）（anderson et al.，1993），表明供試srap引物組合能高信息量地反映出仁用杏品種基因多樣性水平，可作為仁用杏資源遺傳多樣性分析的有效標記。 表3 srap引物組合

18、擴增的多態(tài)性 table 3 polymorphism revealed by primer combinations of srap 引物組合 primer 總帶數(shù) total bands 多態(tài)性帶數(shù) polymorphic bands 多態(tài)性比率/% polymorphic rate 多態(tài)性信息含量 pic me1-em1 18 15 83.33 0.53 me1-em2 17 13 76.47 0.28 me1-em5 13 11 84.62 0.52 me2-em7 20 16 80.00 0.65 me3-em4 13 11 84.62 0.38 me4-em3 21 21 100.

19、00 0.61 me4-em4 24 24 100.00 0.53 me4-em6 19 15 78.95 0.52 me5-em6 20 16 80.00 0.55 me5-em9 23 20 86.96 0.67 me6-em6 13 10 76.92 0.51 me8-em9 22 20 90.91 0.42 me9-em8 16 14 87.50 0.38 me9-em5 24 21 87.50 0.61 me8-em7 17 14 82.35 0.45 總計total 280 241 平均 mean 18.7 16.1 85.34 0.51 2.2 srap指紋檢索系統(tǒng)開發(fā) 15個s

20、rap引物組合中，me2-em7、me4-em3、me4-em4、me5-em9、me8-em9和me9-em5等6對引物的品種鑒別能力在85%以上。其中，me4-em3和me4-em4對供試的24份仁用杏材料鑒別能力為100%，即各自能根據(jù)擴增譜帶的不同位點及材料間不同帶型逐一鑒別出基因型不同的品種?；谝飉e4-em4構(gòu)建的仁用杏品種srap指紋檢索系統(tǒng)如下，其中，字母b右下角的數(shù)字為擴增帶長度（bp），+為出現(xiàn)條帶，為缺失條帶。 3.1.2 b310- 3.2 b1100+/910- 3.3 b1100-/910+ 中仁1號 zhongren 1 超仁 chaoren 一窩蜂 yiwo

21、feng 1. b1610+/1250+ 1.1 b1100+/910+ 1.1.1 b820+ 1.1.2 b820- 1.2 b1100+/910- 1.3 b1100-/910+ 1.4 b1100-/910- 80d05 79c13 長城1號 changcheng 1 三桿旗 sanganqi 新4號 xin 4 2. b1610+/1250- 2.1 b1100+/910+ 2.2 b1100+/910- 2.2.1 b820+/510+ 2.2.2 b820+/510- 2.3 b1100-/910+ 2.3.1 b640+ 2.3.2 b640- 龍豐 longfeng 圍選1號

22、 weixuan 1 優(yōu)一 youyi 龍王帽 longwangmao c210-5 3. b1610-/1250+ 3.1 b1100+/910+ 3.1.1 b310+ 薄殼1號 boke 1 4. b1610-/1250- 4.1 b1100+/910+ 4.1.1 b820+/510+ 4.1.2 b820+/510- 4.1.3 b820-/510+ b750+ b750- 4.2 b1100+/910- 4.2.1 b820+/750+ 4.2.2 b820-/750+ 4.2.3 b820+/750- 4.3 b1100-/910+ 4.4 b11

23、00-/910- 4.4.1 b820+ 4.4.2 b820- 綠源2號 lyuan 2 國仁 guoren 80b05 80a03 斑龍 banlong 串鈴扁chuanlingbian 白玉扁 baiyubian 豐仁 fengren 80e05 油仁 youren 6期 艾鵬飛等：仁用杏品種srap遺傳多樣性分析及指紋檢索系統(tǒng)的開發(fā) 1195 2.3 基于srap標記的聚類分析 根據(jù)15個srap引物組合擴增的241條多態(tài)性譜帶，對24個仁用杏品種進行遺傳多樣性分析，jaccards相似系數(shù)在0.58 0.91之間?；谙嗨葡禂?shù)大小，80a03與龍王帽的親緣關(guān)系最遠，油仁與豐仁最近。

24、采用upgma法聚類分析，在相似系數(shù)為0.70處，可以將24個仁用杏品種分為4組（圖2）。 第組包括5個品種，其中國仁、豐仁和油仁都是由遼寧省果樹研究所從一窩蜂的優(yōu)系中選育出的新品種，80e05亦為一窩蜂的優(yōu)系。 第組由8個品種組成，劃分為2個小組。第1小組包括龍王帽及其系選品種c210-5超仁、長城1號；第2小組包括優(yōu)一、中仁1號新4號、三桿旗，它們都是扁杏園實生選育品種。 第組包括9個品種，它們來源不盡相同（綠源2號來自內(nèi)蒙古，白玉扁來自北京，其余7個來自河北），但絕大多是從山杏的甜仁類型中選育出來的。最近選育出來的新品種圍選1號也聚類在這組中。 第組只有兩個品種80a03和串鈴扁，與其它

25、3組的親緣關(guān)系較遠。 上述表明，聚類結(jié)果與形態(tài)分類基本一致。 圖2 仁用杏24個品種的srap擴增譜帶的upgma聚類圖 fig. 2 dendrogram of 24 accessions of kernel-using apricot based on upgma of srap polymorphisms 3 討論 3.1 srap標記用于仁用杏遺傳多樣性研究的優(yōu)越性 srap擴增的序列位于orfs（open reading frames，開放閱讀框）區(qū)域，對育種目標性狀評價1196 園 藝 學(xué) 報 41卷 方面較其它分子標記（如rapd、ssr等）表現(xiàn)出更高的多態(tài)性標記比率（song

26、et al.，2010）。本研究中，15對srap引物對24份仁用杏材料的擴增結(jié)果表明，平均每對引物16.1條多態(tài)性帶，多態(tài)性比率85.34%。這比章秋平等（2013）報道的21對ssr引物對67份華北生態(tài)群普通杏（a. vulgaris l.）擴增時平均5.7個等位變異和39.9%多態(tài)性比率高，也比吳樹敬和陳學(xué)森（2000）報道的18個rapd引物對20個杏（armeniaca spp.）品種擴增時平均5.9條多態(tài)性帶和48.6%多態(tài)性比率高。此外，在仁用杏品種鑒定方面，srap也表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。本研究中，采用1對srap引物me4-em4即可鑒別出24個仁用杏品種，而王玉柱等（2006）

27、采用rapd技術(shù)對4個仁用杏品種（龍王帽、一窩蜂、白玉扁和優(yōu)一）鑒定時出現(xiàn)困難。其原因可能與srap擴增的等位位點變異幅度大（如表3中的me4-em4擴增出24條多態(tài)性譜帶，多態(tài)性比率100%）且?guī)拓S富有關(guān)。由此可見，對仁用杏進行遺傳多樣性評價、品種鑒定和系統(tǒng)學(xué)研究時，srap標記高效、可行。 3.2 基于srap標記的仁用杏品種聚類結(jié)果的可靠性 本研究中，24個仁用杏品種的相似系數(shù)在0.58 0.91之間，比普通杏（a. vulgaris l.）品種間的相似系數(shù)0.083 0.987（張淑青 等，2010）變化幅度小得多，這一結(jié)果與馬丹慧（2007）的仁用杏資源遺傳基礎(chǔ)狹窄、群體變異幅度小

28、的觀點一致，也在一定程度上支持劉有春等（2010）仁用杏作為普通杏一個變種的說法。因此，在進行仁用杏雜交育種時，可以根據(jù)品種（系）間的相似系數(shù)大小來選配親緣關(guān)系遠的親本組合，提高育種效率。 根據(jù)srap擴增結(jié)果構(gòu)建的聚類圖在相似系數(shù)0.70處將24份材料分成4組（圖2），這與生產(chǎn)實踐中通過形態(tài)分類的結(jié)果一致。c210-5超仁、長城1號來自龍王帽的優(yōu)系選育（劉威生，2008），80e05、油仁、豐仁、國仁為一窩蜂的系選品種，優(yōu)一、中仁1號新4號和三桿旗是扁杏園實生選育品種，79c13、80b05、80d05綠源2號等來自大山甜杏實生樹的優(yōu)系（馬丹慧，2007），這些品種的形成過程均在聚類圖（圖2

29、）中得到印證，較好地反映出24份仁用杏材料的親緣關(guān)系和遺傳背景。但也有例外，如同樣來自大山甜杏的80a03沒有與其他相同來源的品種聚在一起，表現(xiàn)出較遠的親緣關(guān)系。馬丹慧（2007）采用ssr標記研究80a03時也得到了這樣的結(jié)果。其原因可能與仁用杏的多元化起源（劉有春 等，2010）有關(guān)。 從圖2中也可以看出，同一系列的品種聚在一起，不同系列的品種分別擁有各自的核心種質(zhì)，且彼此間交流較少。這為下一步建立仁用杏核心種質(zhì)資源圃提供了參考資料，在仁用杏雜交親本組合的選配、新品種保護和優(yōu)質(zhì)資源的發(fā)掘等方面也具有參考意義。 references ai peng-fei，zhen zhi-jun，fang

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