最新第七章1固定化細(xì)胞和酶1PPT文檔

1、 酶催化劑的優(yōu)點(diǎn)：酶催化劑的優(yōu)點(diǎn)： 專(zhuān)一性強(qiáng)，專(zhuān)一性強(qiáng)， 反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)條件溫和， 反應(yīng)速度較快。反應(yīng)速度較快。 弱點(diǎn)：弱點(diǎn)： 溶液酶在反應(yīng)后，分離困難，重復(fù)利用困難；溶液酶在反應(yīng)后，分離困難，重復(fù)利用困難； 溶液酶穩(wěn)定性差，易失活。溶液酶穩(wěn)定性差，易失活。 19691969出現(xiàn)了固定化酶技術(shù)。出現(xiàn)了固定化酶技術(shù)。 固定化酶就是把原來(lái)游離的水溶性酶，設(shè)法限制固定化酶就是把原來(lái)游離的水溶性酶，設(shè)法限制 或固定于某一或固定于某一 局部的空間或者固定于載體上。局部的空間或者固定于載體上。固定化酶生物反應(yīng)器固定化酶生物反應(yīng)器 實(shí)際應(yīng)用中，固定實(shí)際應(yīng)用中，固定化酶可以裝在反應(yīng)化酶可以裝在反應(yīng)器中，連

2、續(xù)生產(chǎn)有器中，連續(xù)生產(chǎn)有利于生產(chǎn)的自動(dòng)化，利于生產(chǎn)的自動(dòng)化，提高生產(chǎn)率。提高生產(chǎn)率。 鑒于此，鑒于此，70年代以年代以來(lái)，該技術(shù)受到各來(lái)，該技術(shù)受到各國(guó)學(xué)者的矚目，紛國(guó)學(xué)者的矚目，紛紛開(kāi)展固定化酶的紛開(kāi)展固定化酶的研究研究。8.18.1 固定化方法及固定化后酶和固定化方法及固定化后酶和細(xì)胞的性質(zhì)細(xì)胞的性質(zhì) 一、一、 固定化的原則和方法固定化的原則和方法 由于酶催化作用依靠它的由于酶催化作用依靠它的高級(jí)結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu)及及活性中心活性中心。 固定化時(shí)，活性中心的固定化時(shí)，活性中心的必需基團(tuán)避免參加反應(yīng)必需基團(tuán)避免參加反應(yīng)； 避免避免高溫、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑高溫、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑以及以及高濃度鹽高濃度鹽的處

3、理，的處理，保護(hù)保護(hù)靠氫鍵、離子鍵、疏水鍵等弱鍵維系的酶蛋靠氫鍵、離子鍵、疏水鍵等弱鍵維系的酶蛋白質(zhì)的白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)高級(jí)結(jié)構(gòu)。盡可能在。盡可能在溫和條件溫和條件下進(jìn)行固定下進(jìn)行固定化反應(yīng)?；磻?yīng)。 固定化方法固定化方法： 載體結(jié)合法載體結(jié)合法：將酶（細(xì)胞）固定在不溶：將酶（細(xì)胞）固定在不溶性載體上?？抗矁r(jià)結(jié)合、離子結(jié)合、和性載體上?？抗矁r(jià)結(jié)合、離子結(jié)合、和物理吸附。物理吸附。常用的載體常用的載體：纖維素、葡聚糖、瓊脂糖：纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等多糖衍生物顆?；蚨嗫撞ＡУ?。等多糖衍生物顆?；蚨嗫撞ＡУ?。載體結(jié)合法載體結(jié)合法交聯(lián)法交聯(lián)法包埋法包埋法8.18.1 固定化方法及固定化后酶和細(xì)胞的的性質(zhì)

4、固定化方法及固定化后酶和細(xì)胞的的性質(zhì) 交聯(lián)法交聯(lián)法：使酶與具有兩個(gè)以上官能：使酶與具有兩個(gè)以上官能團(tuán)的試劑（戊二醛）進(jìn)行反應(yīng)，應(yīng)團(tuán)的試劑（戊二醛）進(jìn)行反應(yīng)，應(yīng)用化學(xué)鍵把酶固定用化學(xué)鍵把酶固定。 包埋法包埋法：將酶包在凝膠微小格子內(nèi)，：將酶包在凝膠微小格子內(nèi)，或是將酶包裹在半透性聚合物膜內(nèi)的或是將酶包裹在半透性聚合物膜內(nèi)的固定化方法。固定化方法。常用的凝膠常用的凝膠為聚丙烯酰胺、海藻酸鈣、為聚丙烯酰胺、海藻酸鈣、膠原、卡拉膠等。膠原、卡拉膠等。包埋法簡(jiǎn)單，可適用于大多數(shù)酶包埋法簡(jiǎn)單，可適用于大多數(shù)酶。二、二、 固定化酶和細(xì)胞的性質(zhì)固定化酶和細(xì)胞的性質(zhì) 1 1、固定化后的活性固定化后的活性 酶經(jīng)固

5、定化后，活力降低。酶經(jīng)固定化后，活力降低。 原因是原因是： a.a. 酶和載體結(jié)合時(shí)，活性中心的氨基酸也或酶和載體結(jié)合時(shí)，活性中心的氨基酸也或多或少地參與了結(jié)合多或少地參與了結(jié)合 ，使得酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生部，使得酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生部分變化，酶活力有一部分喪失。分變化，酶活力有一部分喪失。 b.b. 由于載體的存在，有空間位阻，影響底物由于載體的存在，有空間位阻，影響底物和酶接觸，酶的活性得不到全部表達(dá)。和酶接觸，酶的活性得不到全部表達(dá)。 細(xì)胞固定化后，一般酶活力不下降。細(xì)胞內(nèi)酶細(xì)胞固定化后，一般酶活力不下降。細(xì)胞內(nèi)酶受細(xì)胞膜、壁的保護(hù)。受細(xì)胞膜、壁的保護(hù)。8.18.1 固定化方法及固定化后酶和細(xì)胞的的性質(zhì)

6、固定化方法及固定化后酶和細(xì)胞的的性質(zhì)固定化酶結(jié)構(gòu)的改變固定化酶結(jié)構(gòu)的改變 2 2、穩(wěn)定性、穩(wěn)定性 酶或細(xì)胞被固定化后，由于載體的酶或細(xì)胞被固定化后，由于載體的存在，酶分子的存在，酶分子的結(jié)構(gòu)或細(xì)胞被約束結(jié)構(gòu)或細(xì)胞被約束，對(duì)外部惡劣環(huán)境的對(duì)外部惡劣環(huán)境的敏感性下降，使敏感性下降，使其穩(wěn)定性增加其穩(wěn)定性增加（對(duì)熱、對(duì)各種化學(xué)（對(duì)熱、對(duì)各種化學(xué)試劑等）。而且有時(shí)穩(wěn)定性增加的試劑等）。而且有時(shí)穩(wěn)定性增加的幅度比較大。幅度比較大。3 3、催化活性、催化活性 （底物專(zhuān)一性，反應(yīng)的（底物專(zhuān)一性，反應(yīng)的phph值，值，t t，動(dòng)力學(xué)常數(shù)）動(dòng)力學(xué)常數(shù)）a.a. 底物專(zhuān)一性底物專(zhuān)一性：當(dāng)?shù)孜餅榇蠓肿訒r(shí)，酶或細(xì)：當(dāng)

7、底物為大分子時(shí)，酶或細(xì)胞對(duì)底物專(zhuān)一性下降；當(dāng)?shù)孜餅樾》肿訒r(shí)，胞對(duì)底物專(zhuān)一性下降；當(dāng)?shù)孜餅樾》肿訒r(shí)，酶或細(xì)胞對(duì)底物專(zhuān)一性變化不大。酶或細(xì)胞對(duì)底物專(zhuān)一性變化不大。 b b最適最適phph：依固定化載體與酶分子、細(xì)胞上依固定化載體與酶分子、細(xì)胞上所分布電荷的相互作用不同而異。有的變化，所分布電荷的相互作用不同而異。有的變化，有的不變化，有的向有的不變化，有的向phph小的方向移動(dòng)，有的小的方向移動(dòng)，有的向向phph大的方向移動(dòng)。大的方向移動(dòng)。3 3、催化活性、催化活性 （底物專(zhuān)一性，反應(yīng)的（底物專(zhuān)一性，反應(yīng)的phph值，值，t t，動(dòng)力學(xué)常數(shù)）動(dòng)力學(xué)常數(shù)） c.c.反應(yīng)的反應(yīng)的最適溫度最適溫度 固定

8、化酶、細(xì)胞的最適溫度往往升高，固定化酶、細(xì)胞的最適溫度往往升高，升高的幅度不同，升高的幅度不同，215215 o oc c不等。不等。d.d.動(dòng)力學(xué)常數(shù)動(dòng)力學(xué)常數(shù) 酶：米氏常數(shù)酶：米氏常數(shù)kmkm反映了酶和底物的親和力。反映了酶和底物的親和力。固定化酶的表現(xiàn)固定化酶的表現(xiàn)km(app)km(app)與游離酶的與游離酶的kmkm相比相比有些不變，有的變化很大。有些不變，有的變化很大。3 3、催化活性、催化活性 （底物專(zhuān)一性，反應(yīng)的（底物專(zhuān)一性，反應(yīng)的phph值，值，t t，動(dòng)力學(xué)常數(shù)）動(dòng)力學(xué)常數(shù)） 原因可能是原因可能是：載體間的靜電作用，以及擴(kuò)：載體間的靜電作用，以及擴(kuò)散效應(yīng)。如果固定化酶區(qū)域的

9、散效應(yīng)。如果固定化酶區(qū)域的底物濃度比底物濃度比外部液相主體溶液高外部液相主體溶液高，km(app)km(app)下降。相反，下降。相反，用包埋法的固定化酶的用包埋法的固定化酶的km(app)km(app)值，可較游值，可較游離酶多兩個(gè)數(shù)量級(jí)。這是由于凝膠中的離酶多兩個(gè)數(shù)量級(jí)。這是由于凝膠中的擴(kuò)擴(kuò)散效應(yīng)使底物濃度減少，散效應(yīng)使底物濃度減少，導(dǎo)致內(nèi)部底物濃導(dǎo)致內(nèi)部底物濃度低于外部區(qū)域的濃度，度低于外部區(qū)域的濃度，km(app)km(app)上升。上升。 對(duì)于固定化細(xì)胞，情況類(lèi)似。對(duì)于固定化細(xì)胞，情況類(lèi)似。 vmax vmax 一般不變化。一般不變化。8.2 8.2 固定化酶和固定化細(xì)胞的應(yīng)用固定化

10、酶和固定化細(xì)胞的應(yīng)用 在在7070年代初，首先固定年代初，首先固定單一的酶單一的酶，催化單一，催化單一反應(yīng)；反應(yīng)； 隨后同隨后同時(shí)固定兩種酶或兩種以上的酶時(shí)固定兩種酶或兩種以上的酶，以及，以及固定化酶和輔酶，催化復(fù)雜一些的反應(yīng)；固定化酶和輔酶，催化復(fù)雜一些的反應(yīng)； 再后來(lái)發(fā)展起來(lái)的固定化細(xì)胞技術(shù)，使得不再后來(lái)發(fā)展起來(lái)的固定化細(xì)胞技術(shù)，使得不易提取的不穩(wěn)定的酶的利用有了方便條件，易提取的不穩(wěn)定的酶的利用有了方便條件，還可以還可以利用活細(xì)胞的完整代謝體系來(lái)完成復(fù)利用活細(xì)胞的完整代謝體系來(lái)完成復(fù)雜的反應(yīng)。雜的反應(yīng)。如乙醇的生產(chǎn)。如乙醇的生產(chǎn)。8.2 8.2 固定化酶和固定化細(xì)胞的應(yīng)用固定化酶和固定化

11、細(xì)胞的應(yīng)用 在固定化酶、固定化細(xì)胞的研究中發(fā)展在固定化酶、固定化細(xì)胞的研究中發(fā)展起來(lái)的起來(lái)的親和層析技術(shù)親和層析技術(shù)，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了 利用酶和微生物進(jìn)行催化反應(yīng)的范疇。利用酶和微生物進(jìn)行催化反應(yīng)的范疇。例如抗體抗原的提純是利用了特異的免例如抗體抗原的提純是利用了特異的免疫吸附反應(yīng)。疫吸附反應(yīng)。 固定化酶和細(xì)胞技術(shù)的顯著特點(diǎn)固定化酶和細(xì)胞技術(shù)的顯著特點(diǎn)： 1 1連續(xù)反應(yīng)；連續(xù)反應(yīng)； 2 2獲得的產(chǎn)物純度高；獲得的產(chǎn)物純度高； 3 3固定化酶或細(xì)胞可重復(fù)使用，減少固定化酶或細(xì)胞可重復(fù)使用，減少 了浪費(fèi)；了浪費(fèi)； 4 4易實(shí)現(xiàn)自控易實(shí)現(xiàn)自控。應(yīng)用實(shí)例：應(yīng)用實(shí)例： dl-dl-氨基酸的光

12、學(xué)拆分氨基酸的光學(xué)拆分 人體只能利用人體只能利用l-l-氨基酸，所以氨基酸，所以l-l-氨基酸氨基酸在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛，并且在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛，并且需要量不斷增加。需要量不斷增加。 化學(xué)合成法是生產(chǎn)氨基酸的方法之一，化學(xué)合成法是生產(chǎn)氨基酸的方法之一，該法成本低，但生產(chǎn)出來(lái)的氨基酸是該法成本低，但生產(chǎn)出來(lái)的氨基酸是dl dl 外消旋體。要想把外消旋體。要想把l-l-氨基酸分離出來(lái)，氨基酸分離出來(lái)，需要進(jìn)行光學(xué)拆分。需要進(jìn)行光學(xué)拆分。 復(fù)習(xí)幾個(gè)概念：復(fù)習(xí)幾個(gè)概念： 外消旋體外消旋體：對(duì)映體的右旋體和左旋：對(duì)映體的右旋體和左旋體等量混合后，它們的旋光性相互體等量混合后，它們的旋光

13、性相互抵消，不再有旋光性。這樣的混合抵消，不再有旋光性。這樣的混合物稱(chēng)為外消旋體，以物稱(chēng)為外消旋體，以d、l表示。外表示。外消旋體可以用適當(dāng)方法拆開(kāi)或分開(kāi)。消旋體可以用適當(dāng)方法拆開(kāi)或分開(kāi)。復(fù)習(xí)幾個(gè)概念：復(fù)習(xí)幾個(gè)概念： 外消旋化外消旋化：在一般情況下，和不對(duì)稱(chēng)碳在一般情況下，和不對(duì)稱(chēng)碳原子相連的四個(gè)原子或原子團(tuán)，不能隨原子相連的四個(gè)原子或原子團(tuán)，不能隨意調(diào)換位置，因此對(duì)映體不能相互轉(zhuǎn)換，意調(diào)換位置，因此對(duì)映體不能相互轉(zhuǎn)換，旋光度維持不變。旋光度維持不變。 但在熱、光、或者化學(xué)試劑的影響下，但在熱、光、或者化學(xué)試劑的影響下，不對(duì)稱(chēng)碳原子上的原子或原子團(tuán)可發(fā)生不對(duì)稱(chēng)碳原子上的原子或原子團(tuán)可發(fā)生調(diào)換現(xiàn)

14、象，使旋光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為它的對(duì)映調(diào)換現(xiàn)象，使旋光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為它的對(duì)映體，最后得到外消旋體體，最后得到外消旋體，原來(lái)，原來(lái)100%的左的左旋體，經(jīng)變化后，變成旋體，經(jīng)變化后，變成50%左旋體和左旋體和50%的右旋體，這種現(xiàn)象稱(chēng)為外消旋化。的右旋體，這種現(xiàn)象稱(chēng)為外消旋化。 dl-dl-氨基酸光學(xué)拆分中，以酶法最佳，它氨基酸光學(xué)拆分中，以酶法最佳，它是利用?；被崴饷?，制備純度高是利用酰化氨基酸水解酶，制備純度高的的l-aal-aa，且收率高且收率高。 氨基?；被；痚dl-r-chcooh + h2o l-r-ch-cooh + d-r-chcooh 不對(duì)稱(chēng)水解不對(duì)稱(chēng)水解 nh2 nh2 nhco

15、r 溶解度小溶解度小酰化?；?dl-aa l-aa 酰化?；痙-aa 外消旋化外消旋化外消旋體外消旋體固定化酶光學(xué)拆分固定化酶光學(xué)拆分dl-dl-氨基酸生產(chǎn)流程氨基酸生產(chǎn)流程 19691969年，日本千鈿一郎成功地利用固年，日本千鈿一郎成功地利用固定化?；被崴饷?，由?；ɑ；被崴饷?，由?；? -dl-dl-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)氨基酸連續(xù)生產(chǎn)l-aal-aa獲得成功。獲得成功。 這是這是世界上世界上固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的用的第一個(gè)實(shí)例第一個(gè)實(shí)例。各種光學(xué)活性氨基。各種光學(xué)活性氨基酸都用這種方法生產(chǎn)。該項(xiàng)技術(shù)成功酸都用這種方法生產(chǎn)。該項(xiàng)技術(shù)成功的關(guān)鍵是制造出適合于工業(yè)化要求的的關(guān)鍵是制造出適合于工業(yè)化要求的固定化酶。固定