基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2MMP9及其抑制劑TIMP1與乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究

1、基質(zhì)金屬蛋白酶mmp2，mmp9及其抑制劑timp1與乳腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究 吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文此論文是在我的導(dǎo)師劉國(guó)津 教授悉心指導(dǎo)下完成的。感謝他在 我三年的學(xué)習(xí),工作和生活等諸多 方面給予的諄諄教誨、殷切關(guān)懷和 辛勤的培養(yǎng)。在此,謹(jǐn)向我的導(dǎo)師 表示深深的敬意和由衷的感謝。?1?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文 目 錄提要?1 前言?2 材料和方法?6 結(jié)果?9 討論?12 結(jié)論?16 參考文獻(xiàn)?17 照片?20 致謝?23 中文摘要?1 英文摘要?4 ?2?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文提 要 臨床觀察表明,惡性腫瘤患者大多死于轉(zhuǎn)移。作為癌細(xì)胞最重要的生物學(xué)特性,浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是許多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前研究

2、表明,基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteineses,mmps)可有效的降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracell matrix,ecm)成分,破壞基底膜,從而排除了浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的首遇障礙,其家族成員中的 mmp2,mmp9及其組織抑制劑 timp1(tissue inhibitor of metalloproteinase,timp1)表達(dá)異常與人類惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)1移密切相關(guān) 。目前在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶和乳腺癌的關(guān)系的報(bào)告。因此,我們采用臨床觀察和免疫組化法對(duì) 31例乳腺癌組織進(jìn)行標(biāo)記及分析,探討基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps)在乳腺癌中表達(dá)的意義,顯示 mmp2和 m

3、mp9及其組織抑制劑 timp1的異常表達(dá)與乳腺癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。mmp2和 mmp9陽(yáng)性表達(dá)率,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。表明 mmp2和mmp9在乳腺癌細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)(ecm),基底膜向外擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用,兩者參與了乳腺癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程。timp1則可抑制它們對(duì) ecm的降解而抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。通過(guò)對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps)的研究,揭示乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。鑒于 mmps家族最早參與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,抑制 mmps的藥物可作為防止癌癥轉(zhuǎn)移的有效藥物,這將為腫瘤的治療開(kāi)辟一條新的途徑。?3?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文 前 言 惡性腫瘤的典型特征是對(duì)外周組織極具侵襲

4、性,在遠(yuǎn)隔器官2-4有形成轉(zhuǎn)移腫瘤的能力 。腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征,也是惡性腫瘤患者的主要死因。近年來(lái),人們?cè)谀[瘤浸潤(rùn)機(jī)制及抗浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移治療領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛研究,并已取得了相當(dāng)?shù)倪M(jìn)展。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)在腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移過(guò)程中起了關(guān)鍵性的作用,惡性腫瘤細(xì)胞必須通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)(ecm),及基底膜這一首遇障礙才能經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)的缺損處向外擴(kuò)散。在上述過(guò)程中基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps)發(fā)揮著重要作5,6用 ?；|(zhì)金屬蛋白酶(mmps)通過(guò)對(duì) ecm的降解進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞對(duì)周圍組織的浸潤(rùn),最后達(dá)到癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 mmps在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用可概括如下:(1)破壞局部組織結(jié)構(gòu),

5、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。(2)破壞基底膜屏障,促發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移。(3)通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的改建,增進(jìn)腫瘤新生血管的形成。自 1962年 gross和 lapiere首次報(bào)道膠原酶以來(lái),目前已發(fā)現(xiàn)了大約 14種左右基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps)。它們幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分,因而成為近年來(lái)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移研究的熱點(diǎn)?；|(zhì)金屬蛋白酶是一組鋅離子依賴性蛋白酶,同一種 mmp可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分,而某一種細(xì)胞外基質(zhì)成分又可被多種 mmp降解,但不同酶的降解效率可以有所不同。mmps幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分,它們既參與某些生理過(guò)程(胚胎發(fā)育、產(chǎn)后子宮復(fù)舊、排卵和創(chuàng)傷愈合等);又參與某些病理過(guò)7程(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)

6、炎和腫瘤浸潤(rùn)等 )。經(jīng)典的 mmps主要分為4?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文 三大類:1)間質(zhì)膠原酶類;2) 明膠酶類;3)間質(zhì)溶解素。分子量為 72kd的 mmp2和分子量為 92kd的 mmp9為明膠酶或iv型膠原酶,二者特性相似,不但可以酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分,8還能酶解基底膜主要成分型膠原 。已有大量研究顯示 iv型膠原酶與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。主要降解明膠和、型膠原;但 mmp2為非糖基化,主要由成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞合成,而 mmp9多被糖基化,主要由中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、腫瘤轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生。目前發(fā)現(xiàn) mmp2和 mmp9在惡性腫瘤中如:結(jié)腸直腸癌、胃癌、鼻咽癌等的癌細(xì)胞和細(xì)

7、胞外基質(zhì)中都有較高的表達(dá),與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。在眾多學(xué)者通過(guò)體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)研究,對(duì)各種惡性腫瘤中9mmp2,mmp9的過(guò)度表達(dá)進(jìn)行了深入的探討。李楠等人 利用免疫組化和原位雜交的方法對(duì) 41例人胃癌和 17例癌旁組織中的mm9及 timp1進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn) mmp9與 timp1蛋白在癌組織內(nèi)的陽(yáng)性率均高于癌旁組織,且 mmp9/timp1的比值與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān), mmps陽(yáng)性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率10(64%)明顯高于 mmps陰性的腫瘤(33%)。jeziorska等人對(duì)結(jié)腸癌的研究發(fā)現(xiàn)除了中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞外還有一些惡性11 12上皮細(xì)胞也可以發(fā)現(xiàn) mmp9的免疫反

8、應(yīng)性 。zeng zs等人 研究了 71例原發(fā)性結(jié)直腸癌病例,發(fā)現(xiàn)腫瘤組織 mmp9濃度較正常粘膜明顯高(p0.01),mmp9表達(dá)與性別、年齡、腫瘤位置、大小、分化或腸壁浸潤(rùn)深度無(wú)明顯相關(guān)性,有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)隔臟器轉(zhuǎn)移的病例較無(wú)轉(zhuǎn)移的病例 mmp9表達(dá)增高,而且高表達(dá)的病例5?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文 術(shù)后無(wú)病存活期明顯短于低表達(dá)者,可見(jiàn) mmp9的檢測(cè)對(duì)于判定腫瘤的預(yù)后也有意義。在此之前,zeng zs等人還研究了伴有肝轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌,發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移灶中 mmp9mrna較其原發(fā)病灶的表達(dá)更高,這充分說(shuō)明了 mmp9和結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。在前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌均有 mmp2a mrna表達(dá)的增加

9、。在mmp9與肺癌關(guān)系的研究中人們發(fā)現(xiàn):mmp9在 12例鱗癌患者的切片上均有表達(dá)。mmp9的 mrna定位于腫瘤細(xì)胞和腫瘤周圍宿主基質(zhì)細(xì)胞,而非正常肺成纖維細(xì)胞。mmp9在肺腺癌未見(jiàn)表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)在一些正常肺組織,包括支氣管上皮、支氣管上皮的基底細(xì)胞增生灶、肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管粘液腺均可有 mmp9的低水平表達(dá)。另外尚有一些研究證明 mmps中基質(zhì)分解素 iii與原發(fā)性肺癌、頭頸部鱗癌、基底細(xì)胞癌的浸潤(rùn)及惡性程度有關(guān)。13結(jié)腸、直腸癌的免疫組化研究表明 :基質(zhì)細(xì)胞及鄰近癌細(xì)胞巢的膠原纖維間質(zhì)膠原酶染色增強(qiáng);而正常組織或良性上皮組織未見(jiàn)此酶染色。結(jié)腸、直腸癌患者間質(zhì)膠原酶過(guò)度表達(dá)預(yù)后不良。40

10、%的原發(fā)性肺惡性腫瘤組織間質(zhì)膠原酶轉(zhuǎn)錄增強(qiáng),而鄰近的正常肺組織則不然。頭、頸部鱗狀細(xì)胞癌的原位雜交研究表明:鄰近惡性腫瘤細(xì)胞團(tuán)塊的基質(zhì)成纖維細(xì)胞間質(zhì)膠原酶轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。所有基質(zhì)金屬蛋白酶都受到天然抑制劑?金屬蛋白酶組織14抑制劑(timp)的抑制 。其在抑制腫瘤 mmps活性的同時(shí),也抑制了腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(timp1)可通過(guò)下調(diào)金屬蛋白酶的降解活性而抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。兩者的不平衡導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生,如腫瘤的侵6?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文 入及轉(zhuǎn)移。合成金屬蛋白酶組織抑制劑能起到控制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生及進(jìn)一步擴(kuò)散。迄今為止,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑

11、制劑與乳腺癌的相關(guān)性的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法,旨在揭示基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的主要成員?明膠酶,包括明膠酶 a(mmp2),明膠酶 b(mmp9)及其組織抑制劑(timp1)對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移方面的作用,為判定腫瘤性質(zhì)及預(yù)后提供可靠依據(jù),也為惡性腫瘤的治療提供了一條新的思路。?7?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文 材 料 與 方 法 (一)材料來(lái)源所有臨床材料及病理組織標(biāo)本均取自白求恩醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤外科和基本外科。隨機(jī)選出 31例乳腺癌患者,均經(jīng)病理檢查確診為乳腺癌。其中導(dǎo)管內(nèi)癌 2例,浸潤(rùn)性小葉癌 1例,其余均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。病人平均年齡為 47.1歲,最大 73歲,最小 26歲,均未經(jīng)化學(xué)及放射等抗

12、癌治療。10例乳腺良性病變作為良性病例對(duì)照。 (二)一般組織學(xué)處理所取組織均用 10%福爾馬林固定液固定標(biāo)本,標(biāo)本固定后,經(jīng)乙醇梯度脫水,二甲苯透明,浸蠟包埋。做連續(xù)組織切片,厚度為 4m,備 he染色及免疫組織化學(xué)染色。 (三)免疫組織化學(xué)染色1、試劑 所使用的一抗 mmp2,mmp9和 timp-1均為單克隆鼠抗人抗體,其與 sp染色試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司。2、染色步驟 免疫組織化學(xué)染色采用 sp 法。步驟如下:(1)組織切片梯度脫蠟至水。(2)0.01m枸櫞酸鹽緩沖液微波處理至 98溫靜置 30分,pbs洗 53(timp-2適用)。(3)應(yīng)用 3%的 h o蒸餾水阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物

13、15分鐘,pbs液沖洗2 25分鐘三次(53)。(4)滴加正常羊血清封閉 20分鐘。(5)去除多余血清。(6)滴加第一抗體(37)孵育 60分鐘。(7)8?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文 pbs液沖洗 53。(8)滴加第二抗體(37)孵育 25分鐘。(9)pbs液沖洗 53。(10)滴加第三抗體(37)孵育 25分鐘。(11)pbs液沖洗 53。(12)dab發(fā)色 15分鐘。(13)marrys蘇木精復(fù)染核。(14)脫水、透明、封片。3、對(duì)照:免疫組織化學(xué)染色過(guò)程中,以 pbs代替一抗作陰性對(duì)照;以已知的 mmp2,mmp9和 timp-1陽(yáng)性的胃癌組織切片做陽(yáng)性對(duì)照;以 pbs液代替第一抗體作為陰性對(duì)

14、照。4、結(jié)果判定: 在不知道任何臨床和病理資料的情況下,對(duì)免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行觀察判定,以在腫瘤細(xì)胞胞漿,胞膜及癌巢周圍基質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒,其著色強(qiáng)度高于背景非特異性染色者判定為陽(yáng)性。 (四)形態(tài)學(xué)定量及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 15,161、組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(bloom and riohardson 1957年) a.管腔形成:1分?切片顯示明顯的腺腔形成2分?部分腺腔形成3分?小的或不分化的細(xì)胞呈片狀或海岸線生長(zhǎng)b.染色質(zhì)過(guò)多和核分裂像:1分?在高倍視野中,偶爾找到 1個(gè)濃染核或核分裂像2分?大多數(shù)高倍視野中,有 2-3個(gè)這類細(xì)胞3分-該類細(xì)胞更多?9?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文c.核大小、形狀和染色質(zhì)不規(guī)則:

15、1分-輕度差別2分-中等度不一致3分-明顯的多形性把 a,b,c三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)得分相加,計(jì)算總分,確定分級(jí)。35分為 i級(jí),低度惡性;67分為 ii級(jí),中度惡性;89分為 iii級(jí),高度惡性。2、形態(tài)定量方法:mmp2和 mmp9免疫組織化學(xué)染色的計(jì)量方法采用 eastham的方法;即無(wú)著色為 0;切片中癌組織陽(yáng)性染色弱,著色面積(50%判定為 1+;染色弱,面積)50%判定為 2+;染色強(qiáng),面積(50%判定為 3+;染色強(qiáng),面積)50%判定為 4+。此計(jì)量判斷由兩名觀察者獨(dú)立完成。并依據(jù)文獻(xiàn),將染色強(qiáng)度(0-2+)化為低表達(dá),染色強(qiáng)度(3+-4+)化為高表達(dá)。timp1的計(jì)量則根據(jù)著色范圍,著色范

16、圍大于 50%為 2+,小于 50%為 1+,無(wú)表達(dá)為(-)。 (五)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 2 將全部臨床資料輸入計(jì)算機(jī),采用 檢驗(yàn)和 fisher檢驗(yàn),所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用 spass軟件包處理,以 p0.05或 p0.01為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.05,而與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有明顯的關(guān)系,即在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組中,mmp2,mmp9的表達(dá)例數(shù)明顯高于陰性組;而 timp1的表達(dá)例數(shù)明顯低于陰性組p0.001。3. 乳腺癌 mmp2,mmp9及 timp1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間的多因素分析發(fā)現(xiàn):mmp9(+)/timp1(-)組 5例全部為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。而在 mmp9(-)/timp1(+)組中 18例均無(wú)淋巴

17、結(jié)轉(zhuǎn)移。兩者比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p0.001。在 mmp2高/timp1(-)組中,5例均為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性,而 mmp2低/timp1(+)組 16例中 14例為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性,只有 2例陽(yáng)性。兩者比較亦有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 p0.001。?25?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文總之,本研究闡明了 mmp2,mmp9及 timp1在乳腺癌中的表達(dá)特點(diǎn)及其與臨床指標(biāo)間的關(guān)系;為進(jìn)一步研究腫瘤轉(zhuǎn)移的判定標(biāo)準(zhǔn)和研制抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。關(guān)鍵詞:基質(zhì)金屬蛋白酶 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑 乳腺癌 腫瘤轉(zhuǎn)移?26?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文 abstract one of important characte

18、ristic for malignant tumor is invasiving crosponding normal tissue and becoming metastatic focus. with the development from in situ carcinoma to infiltrative and metastatic carcinoma, tumor cell must has a capability to degradate extracellular matrix ecm and basement membrance. this needs a series o

19、f protein hydrolase to take part in. among them, matrix metalloproteineses mmps is most important. with the process of tumor metastasis, tumor cell passing through basement membrance is the key point of forming metastasis. basement membrance is formed by collagen , laminin and other molecules. among

20、 them, collagen is the main part of basement membrance. study of these years found that mmps may promote tumor growth through destroying partly tissue structure, destroying basement membrance as abarricade and promote tumor angingenesis through reconstructing extra cellular matrix in the process of

21、tumor metastasis. therefore, it sounds like very important to study mmps expression and regulation mechanism in carcinoma. mmp2 and mmp9 of mmps are enzyme of collagen , which can degradate collagen of basement membrance efficiently. in normal condition, mmp9 takes part in metabolize of extracellula

22、r matrix and embodies significant role in many tissues reconstruction such as embryo dysplasia, bone tissue reconstruction, discriminating?27?吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文 outsiders and damage repair. when its active is abnormal, it takes important role in tumor invasion and metastasis the purpose of this study is to

23、detect the meaning of mmps and tissue inhibitor of metalloproteinase timp expression and its relationship with tumors invasion and metastasis in breast carcinomaclinical observation and immunohistochemistry method were used to analyze mmp2, mmp9 and timp1 in 31 cases of breast carcinomameanwhile, sole-and multi-factor analysis were carried out with related referencethe results were:1. mmp2 expression is positive weakly 1+-2+ in 10 cases of breast benign tumor. but, mmp9 expression is negative. ti