細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室SOP

1、1 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 目錄 飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)流程圖 2 干細(xì)胞培養(yǎng)流程圖 3-4 細(xì)胞室無(wú)菌操作 5 原代飼養(yǎng)細(xì)胞分離 6-7 飼養(yǎng)細(xì)胞傳代 8 飼養(yǎng)細(xì)胞的絲裂霉素c處理 9 飼養(yǎng)細(xì)胞凍存 10 飼養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇 11 胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇100mm 12 陽(yáng)性克隆復(fù)蘇96孔板 13 胚胎干細(xì)胞傳代100mm 14 胚胎干細(xì)胞傳代96孔板 15 胚胎干細(xì)胞傳代6孔板 16 胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染 17-18 挑克隆 19-20 胚胎干細(xì)胞凍存100mm 21 胚胎干細(xì)胞凍存96孔板 22 胚胎干細(xì)胞凍存6孔板 23 96孔板提取dna 24 附錄1干細(xì)胞培養(yǎng)中的常用試劑 25 附錄2常用試劑

2、的分裝和保存 26 附錄3常用培養(yǎng)基 27 附錄4細(xì)胞培養(yǎng)試劑用量明細(xì)及細(xì)胞計(jì)數(shù) 28 附錄5平皿、平板、凍存管書(shū)寫(xiě)規(guī)則 29-32 附錄6實(shí)驗(yàn)記錄 33-34 2 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室課題流程圖 飼養(yǎng)細(xì)胞feeder cell培養(yǎng)流程圖 第16天 收獲并凍存mmc mef-3 第10天 mef-1到mef-2的傳代1皿分4皿 第1天 解剖孕13.5天小鼠制備原代飼養(yǎng)細(xì)胞mef-0 第5 - 7天 收獲并凍存原代飼養(yǎng)細(xì)胞mef-0 第8天 解凍mef-0恢復(fù)培養(yǎng)1-2天 第15天 mmc處理mef-3恢復(fù)培養(yǎng)1天 第12天 mef-2 到mef-3的傳代4皿分

3、16皿 3 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 干細(xì)胞embryonic stem cell培養(yǎng)流程圖 第16 - 18天 96孔板挑克隆4板 第7天 收獲escs并計(jì)數(shù)隨后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染恢復(fù)培養(yǎng)一天 第8 - 15天 g418篩選轉(zhuǎn)染后的escs 第1天 復(fù)蘇escs 第5天 第二次escs傳代6皿 第3天 第一次escs傳代2皿 4 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 干細(xì)胞embryonic stem cell培養(yǎng)流程圖 第1天 陽(yáng)性克隆復(fù)蘇 第4天 48孔板到6孔板傳代 5 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 第7天 6孔板傳代一孔分三孔 第9天 陽(yáng)性克隆的凍存兩孔 第

4、11 - 12天 陽(yáng)性克隆的復(fù)篩 陽(yáng)性克隆顯微注射4個(gè) 6 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 細(xì)胞室無(wú)菌操作 1. 進(jìn)入細(xì)胞室時(shí)需檢查風(fēng)機(jī)是否正常開(kāi)啟。 2. 進(jìn)入緩沖間前需穿好白大褂、戴好鞋套衣袖需翻折到肘部以上。 3. 進(jìn)入緩沖間后需戴好口罩、帽子及手套。 4. 進(jìn)入無(wú)菌室操作之前需用70酒精對(duì)雙手進(jìn)行消毒。 5. 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前生物安全柜需紫外照射至少30分鐘用70酒精擦拭操作臺(tái)、擋風(fēng)玻璃及金屬邊框后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 6. 開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前需檢查生物安全柜風(fēng)機(jī)是否達(dá)到指定風(fēng)量至少3檔。 7. 放置于生物安全柜的物品都需用70酒精噴撒消毒。 8. 在生物安全柜中拆包的平皿需將開(kāi)口翻折封口后方

5、可拿出。 9. 巴氏吸管在使用前需在酒精燈火焰上反復(fù)過(guò)火。 10.在生物安全柜內(nèi)打開(kāi)的各種瓶蓋及皿蓋擺放時(shí)需蓋口朝下放置。 11.雙手不得在開(kāi)蓋的平皿、瓶口、管口等上方經(jīng)過(guò)以免細(xì)菌落入。 12.使用加樣槽加液時(shí)需用移液管逐次加入不得用瓶直接傾倒。 13.不得將無(wú)菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)的細(xì)胞在生物安全柜以外打開(kāi)。 14.觀察細(xì)胞前需用70酒精擦拭顯微鏡操作臺(tái)。 15.將培養(yǎng)的細(xì)胞放置于孵箱前需用70酒精噴撒皿底進(jìn)行消毒。 16.結(jié)束實(shí)驗(yàn)后用70酒精擦拭操作臺(tái)、擋風(fēng)玻璃及金屬邊框。 注意食物、植物及任何適合微生物生長(zhǎng)的物品禁止帶入實(shí)驗(yàn)室。 7 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 開(kāi)啟全屋紫外消毒前

6、需關(guān)閉風(fēng)機(jī)。 原代飼養(yǎng)細(xì)胞mefs分離 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1手術(shù)器械滅菌小號(hào)彎嘴鑷x2小號(hào)直鑷x2精細(xì)鑷x1眼科剪x2 2小鼠解剖臺(tái)及固定針頭若干 3取出ef培養(yǎng)基、pbs常溫備用0.05胰酶冰浴備用 1. 脫頸處死孕13.5天小鼠取出胚胎用pbs清洗后放置到含10ml pbs的平皿中。 2. 分離胎膜胎盤(pán)剪去頭部、解剖鏡下去除內(nèi)臟組織用pbs盡可能洗盡血液。 3. 收集處理后的胚胎用手術(shù)剪盡可能剪碎置碎塊到50ml離心管中。 4. 按每個(gè)胚胎加入1.52ml 0.05胰酶37水浴消化30min每隔5分鐘搖晃一次離心管。 5. 在離心管中加入兩倍體積的新鮮ef培養(yǎng)基中和胰酶吹打混勻如遇培養(yǎng)基特別粘

7、稠可用100目無(wú)菌細(xì)胞篩過(guò)濾。注意用細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞損失量會(huì)加大 6. 1000rpm4離心5min。 8 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 7. 小心吸走上清用手輕輕拍散細(xì)胞加入ef培養(yǎng)基吹打混勻后均分至150mm平皿中。按每胚胎鋪一個(gè)皿每皿25ml細(xì)胞懸液 8.“8”字水平輕搖平皿使細(xì)胞均勻分布于皿底上。 9. 標(biāo)記后37c、5 co2孵育箱培養(yǎng)。 10.將小鼠尸體、組織塊用封口袋包裹后置-80保存不得隨意丟棄。 11.兩天更換一次ef培養(yǎng)基。 9 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 飼養(yǎng)細(xì)胞傳代 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1取出ef培養(yǎng)基、pbs常溫備用0.05胰酶冰浴備用 注意150m

8、m平皿需分批4皿一做避免污染。 1. 吸走mef-0內(nèi)的ef培養(yǎng)基。 2. 在150mm平皿中沿壁加入10ml pbs清洗2次輕輕搖晃后吸出。 3. 取3.5ml/皿 0.05 胰酶加入平皿中鋪勻后置37孵育箱消化3 min。注意在顯微鏡下快速觀察是否消化徹底 4. 在平皿中加入6.5ml/皿 ef 培養(yǎng)基終止消化輕輕吹打細(xì)胞4-6次/皿并輕輕沿壁沖洗平皿1-2次。 5. 將細(xì)胞懸浮液加入50ml離心管。 6. 1000rpm、4離心5min。 7. 小心吸走上清用手輕輕拍散細(xì)胞在離心管中加入ef 培養(yǎng)基吹打混勻后沿壁加入4個(gè)150mm平皿。每皿25ml細(xì)胞懸液 8.“8”字水平輕搖平皿使細(xì)胞

9、均勻分布于皿底上。 10 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 9. 標(biāo)記后37c、5 co2孵育箱培養(yǎng)。 飼養(yǎng)細(xì)胞的絲裂霉素cmmc處理 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1制備mmc10mg母液: 將9.5ml pbs和0.5ml dmso混勻后加入mmc瓶中將混合液加入5ml無(wú)菌注射器中經(jīng)0.22um過(guò)濾器過(guò)濾到15ml離心管中 用錫紙包裹離心管標(biāo)記后4避光保存。注意母液配置后需在1個(gè)月內(nèi)用完 2取出ef培養(yǎng)基、pbs常溫備用0.05胰酶冰浴備用 注意150mm平皿需分批4皿一做避免污染。 1. 吸走mef-3內(nèi)的ef培養(yǎng)基。 2. 每個(gè)150mm平皿沿壁加入15ml mmc工作液。注意mmc母液用培養(yǎng)

10、基稀釋100倍即為工作液工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配 3. 37c5 co2孵育箱培養(yǎng)4小時(shí)。 4. 吸走平皿內(nèi)的mmc工作液。 11 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 5. 每皿沿壁輕輕加入10ml pbs洗滌后吸出清洗兩遍。 6. 每個(gè)150mm平皿沿壁加入20ml ef培養(yǎng)基。 7. 37c、5 co2孵育箱恢復(fù)培養(yǎng)1天。 注意mmc處理后的飼養(yǎng)細(xì)胞在收獲時(shí)需取1x106試鋪一個(gè)100mm平皿每天觀察是否繼續(xù)生長(zhǎng)及是否有污染連續(xù)觀察2天。 飼養(yǎng)細(xì)胞凍存 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1制備凍存液 fbsdmso 91用錫紙包裹離心管標(biāo)記后4避光備用。 注意凍存液常溫具有細(xì)胞毒性且不穩(wěn)定需現(xiàn)用現(xiàn)配 2標(biāo)記凍存

11、管 3取出ef培養(yǎng)基、pbs常溫備用0.05胰酶冰浴備用 注意150mm平皿需分批4皿一做避免污染。 1. 吸走150mm平皿內(nèi)的ef培養(yǎng)基。 2. 在150mm平皿中沿壁加入10ml pbs清洗2次輕輕搖晃后吸出。 3. 每皿加入3.5ml 0.05胰酶 鋪均至平皿后37孵育箱消化3min。 12 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 4. 每皿加入6.5ml ef培養(yǎng)基終止消化吹打混勻后加入50ml 離心管中。注意吹打次數(shù)嚴(yán)格控制在6次以內(nèi)不得過(guò)度吹打細(xì)胞 5. 計(jì)數(shù)細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)40ul細(xì)胞懸液20ul稀釋倍數(shù)3倍 6. 1000rpm、4離心5min。 7. 吸走上清用手輕輕拍散細(xì)胞

12、加入適量?jī)龃嬉夯靹蚝蠹尤霕?biāo) 記好的凍存管中。每管1ml凍存液凍存規(guī)格為1x107和3x106 8. 將凍存管封口膜包裹后置泡沫盒-80c 過(guò)夜次日轉(zhuǎn)液氮凍存。 飼養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇 已經(jīng)過(guò)mmc處理 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1取出ef培養(yǎng)基常溫備用 2準(zhǔn)備防爆面罩及防凍手套 3提前30 min用0.1明膠對(duì)需要鋪板的平皿、平板做預(yù)處理 1. 在50ml離心管中加入10ml ef培養(yǎng)基。 2. 戴上防爆面罩及防凍手套后迅速將含有mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的凍存管從液氮中取出放入37水浴鍋的凍存架中迅速扣上水浴鍋蓋計(jì)時(shí)2min如液氮罐至水浴鍋的距離較遠(yuǎn)則需將凍存管放入泡沫盒內(nèi)轉(zhuǎn)移2min后打開(kāi)水浴鍋蓋用手握住凍存管蓋在水 13

13、 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 浴鍋中迅速搖晃融化直至含少許冰晶。注意不得將冰晶全部化完在水浴鍋中的時(shí)間控制在3min內(nèi) 3. 70酒精噴撒凍存管后將凍存管中的懸液用1000ul單道槍移至離心管中取少許離心管內(nèi)的ef培養(yǎng)基涮洗一下凍存管將離心管擰緊后輕輕顛倒數(shù)次混勻一次最多同時(shí)解凍3管 4. 1000rpm4離心5min。 5. 吸走上清拍散后沿壁加入適量ef培養(yǎng)基重懸后鋪于若干100mm平皿中。注意每皿10ml細(xì)胞懸液根據(jù)品系1x107的細(xì)胞量最多可鋪6個(gè)100mm平皿、3x106的細(xì)胞量最多可鋪2個(gè)100mm平皿 6.“8”字水平輕搖平皿使細(xì)胞均勻分布于皿底上。 7. 標(biāo)記后3

14、7c、5co2孵育箱培養(yǎng)。 胚胎干細(xì)胞復(fù)蘇100mm 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1取出es培養(yǎng)基常溫備用 2提前一天準(zhǔn)備鋪有mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的100mm平皿觀察有無(wú)污染 1. 在15ml離心管中加入10ml es培養(yǎng)基。 2. 戴上防爆面罩及防凍手套后迅速將含有干細(xì)胞的凍存管從液氮中取出放入37水浴鍋的凍存架中迅速扣上水浴鍋蓋計(jì)時(shí) 14 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 2min如液氮罐至水浴鍋的距離較遠(yuǎn)則需將凍存管放入泡沫盒內(nèi)轉(zhuǎn)移2min后打開(kāi)水浴鍋蓋用手握住凍存管蓋在水浴鍋中迅速搖晃融化直至含少許冰晶。注意不得將冰晶全部化完在水浴鍋中的時(shí)間控制在3min內(nèi) 3. 70酒精噴灑后將凍存管中的懸液用

15、1000ul單道槍移至離心管中取少許離心管內(nèi)的es培養(yǎng)基涮洗一下凍存管將離心管擰緊后輕輕顛倒數(shù)次混勻。一次最多同時(shí)解凍3管 4. 1200rpm4離心5min。 5. 吸走上清拍散細(xì)胞后沿壁加入10ml es培養(yǎng)基重懸后鋪于一個(gè)含mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的100mm平皿中。注意每皿10ml細(xì)胞懸液1x106的細(xì)胞量可鋪1個(gè)100mm平皿 6.“8”字水平輕搖平皿使細(xì)胞均勻分布于皿底上。 7. 標(biāo)記后37c、5co2孵育箱培養(yǎng)。 陽(yáng)性克隆復(fù)蘇96孔板 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1取出g418培養(yǎng)基常溫備用 2提前一天準(zhǔn)備鋪有mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的48孔板觀察有無(wú)污染 1.從-80冰箱取出96孔板陽(yáng)性克隆用保鮮膜封扎后迅速在

16、37水浴鍋中水浴2-3min。注意96孔板外圍部分孔的冰晶快要化完 15 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 時(shí)需立即將96孔板從水浴鍋中拿出 2.在需要復(fù)蘇的孔中加入100ul/孔 g418培養(yǎng)基待冰晶融化后隨即轉(zhuǎn)至含mmc飼養(yǎng)細(xì)胞、200ul/孔 g418培養(yǎng)基的48孔板的孔中。 3.標(biāo)記后37c、5co2孵育箱培養(yǎng)。 注意由于凍存液中含有dmso復(fù)蘇的陽(yáng)性克隆需于第二天早上更換新鮮g418培養(yǎng)基。盡量選擇下午復(fù)蘇 胚胎干細(xì)胞傳代100mm 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1取出es培養(yǎng)基、pbs常溫備用0.25胰酶冰浴備用 2提前一天準(zhǔn)備鋪有mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的100mm平皿觀察有無(wú)污染 1. 吸走10

17、0mm平皿的es培養(yǎng)基。注意傳代前1h需更換新鮮 16 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 es培養(yǎng)基 2. 每皿沿壁加入5ml pbs輕輕搖魏笪鑾逑戳獎(jiǎng)欏?3. 每皿沿壁加入1.5ml 0.25胰酶鋪勻后置37孵育箱消化3min。 4. 每皿沿壁加入3.5ml es培養(yǎng)基終止消化充分吹打使大部分細(xì)胞都處于單個(gè)懸浮狀態(tài)注意吹打次數(shù)約15次/皿如遇吹打不散的情況請(qǐng)檢查吹打力度及胰酶活性。 5. 將細(xì)胞懸浮液加入50ml離心管輕輕吹打混勻。 6. 計(jì)數(shù)細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)40ul細(xì)胞懸液20ul稀釋倍數(shù)3倍 7. 1200rpm、4離心5min。 8. 吸走上清用手輕輕拍散細(xì)胞在離心管中沿壁加入適量

18、es培養(yǎng)基吹打混勻后沿壁注入若干含mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的100mm平皿。注意每皿10ml細(xì)胞懸液。需兩天后傳代每皿細(xì)胞數(shù)需控制在6x105內(nèi) 9.“8”字水平輕搖平皿使細(xì)胞均勻分布于皿底上。 10. 標(biāo)記后37c、5 co2孵育箱培養(yǎng)。 胚胎干細(xì)胞傳代96孔板 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1取出es培養(yǎng)基、pbs常溫備用0.05胰酶冰浴備用 2提前一天準(zhǔn)備鋪有mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板觀察有無(wú)污染 3準(zhǔn)備含70乙醇的加樣槽過(guò)火前蘸一下建議去除此步驟 17 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 1. 吸走96孔板的培養(yǎng)基。8道吸頭過(guò)火幾次后 2. 每板加入100ul/孔 pbs輕搖后吸出清洗兩遍。 3. 每板加入

19、50ul/孔0.25胰酶鋪勻后置37孵育箱消化3min。 4. 每板加入100ul/孔g418培養(yǎng)基終止消化吹打混勻。注意吹打次數(shù)控制在20次左右且排槍量程不得超過(guò)150ul120ul量程吹打否則會(huì)出現(xiàn)過(guò)多泡沫 5. 根據(jù)需要將細(xì)胞懸液均分至若干含mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中。注意轉(zhuǎn)至新鋪96孔板時(shí)每板細(xì)胞懸液最終為200ul/孔 6. 標(biāo)記后37c、5 co2孵育箱培養(yǎng)。 胚胎干細(xì)胞傳代6孔板 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1取出es培養(yǎng)基、pbs常溫備用0.05胰酶冰浴備用 2提前一天準(zhǔn)備鋪有mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的6孔板觀察有無(wú)污染 18 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 1. 吸走6孔板的es培養(yǎng)基。

20、2. 每板沿壁加入1ml/孔 pbs輕搖后吸出清洗兩遍。 3. 每板沿壁加入0.4ml/孔0.05胰酶鋪勻后置37孵育箱消化3min。 4. 每板沿壁加入0.8ml/孔es培養(yǎng)基終止消化吹打混勻。注意用1000ul單道槍吹打次數(shù)控制在8次內(nèi)量程選擇1000ul 5. 根據(jù)需要將細(xì)胞懸液均分至若干含mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的6孔板中。注意轉(zhuǎn)至新鋪6孔板時(shí)每板細(xì)胞懸液最終為2ml/孔 6. 采用前后左右輕拍的方式將細(xì)胞懸液拍勻。 7. 標(biāo)記后37c、5 co2孵育箱培養(yǎng)。 胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1取出es培養(yǎng)基常溫備用pbs、0.25胰酶、電擊杯冰浴備用 19 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公

21、司 2提前一天準(zhǔn)備鋪有mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的100mm平皿觀察有無(wú)污染 3線性化dna不少于30ug不多于75ug-20凍一晚上除菌 4電轉(zhuǎn)儀預(yù)熱30min 1. 吸走100mm平皿的es培養(yǎng)基。注意電轉(zhuǎn)1小時(shí)前需更換新鮮es培養(yǎng)基 2. 每皿沿壁加入5ml pbs側(cè)壁加pbs輕輕搖晃后吸出清洗兩遍。 3. 每皿沿壁加入1.5ml 0.25胰酶鋪勻后置37孵育箱消化3min。 4. 每皿沿壁加入3.5ml es培養(yǎng)基終止消化充分吹打使大部分細(xì)胞都處于單個(gè)懸浮狀態(tài)注意10ml移液管吹打次數(shù)約15次/皿如遇吹打不散的情況請(qǐng)檢查吹打力度及胰酶活性。 5. 將細(xì)胞懸浮液加入50ml離心管輕輕吹打混勻。 6.

22、 計(jì)數(shù)細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)40ul細(xì)胞懸液20ul稀釋倍數(shù)3倍 7. 取出1.2x107的細(xì)胞懸液加入50ml離心管中。 8. 1200rpm、4離心5min。 9. 吸走上清輕輕拍散細(xì)胞加入20ml 冰浴的pbs后重懸混勻。 10.1200rpm、4離心5min。 11.重復(fù)步驟910一次。 12. 將高速離心除菌的線性化dna懸液轉(zhuǎn)入1.5ml無(wú)菌ep管中注 20 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 意高速離心機(jī)12000rpm5min棄50ml離心管上清用手輕輕拍散細(xì)胞加入適量冰浴的無(wú)酚紅rpmi重懸混勻后轉(zhuǎn)入含dna的1.5ml無(wú)菌離心管中輕輕混勻。注意重懸細(xì)胞的rpmi懸液與重懸dna

23、的pbs懸液總體積需嚴(yán)格控制在800ul 13. 冰水浴5min轉(zhuǎn)入冰浴的4mm電擊杯中。 14. 280v500uf進(jìn)行電擊記錄電擊時(shí)間一般為10-13ms。 15. 將電擊杯冰水浴5min后常溫靜置5min。 16. 將電擊杯內(nèi)的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入含40ml es培養(yǎng)基的50ml離心管中輕輕吹打混勻均分至4個(gè)含飼養(yǎng)細(xì)胞的100mm平皿。 16. “8”字水平輕搖平皿使細(xì)胞均勻分布于皿底上。 17. 標(biāo)記后37c、5 co2孵育箱培養(yǎng)20小時(shí)后更換g418培養(yǎng)基。 ps關(guān)于加電轉(zhuǎn)對(duì)照的方法及電轉(zhuǎn)前的細(xì)胞準(zhǔn)備 取同一批進(jìn)行電轉(zhuǎn)的野生型干細(xì)胞3x106用800ul 無(wú)酚紅rpmi重懸后進(jìn)行電擊將細(xì)胞懸

24、液轉(zhuǎn)入10ml培養(yǎng)基的15ml離心管中吹打混勻后鋪至1個(gè)含mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的100mm平皿其他步驟與電轉(zhuǎn)細(xì)胞步驟相同。 電轉(zhuǎn)前的干細(xì)胞需至少傳代兩次后方可進(jìn)行電轉(zhuǎn)。最后一次傳代以6x105/皿準(zhǔn)備6個(gè)100mm平皿于兩天后進(jìn)行電轉(zhuǎn)。 挑克隆 21 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備 1取出g418培養(yǎng)基、pbs、dpbs常溫備用0.05胰酶冰浴備用 2提前一天準(zhǔn)備鋪有mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板觀察有無(wú)污染 1. 在圓底96孔板中加入40ul/孔的0.05胰酶置冰上備用。 2. 吸走平皿內(nèi)的g418培養(yǎng)基。 3. 每皿沿壁加入5ml pbs輕輕搖晃后吸出清洗兩遍后每皿加入6ml含

25、鈣鎂離子的dpbs備用。 4. 解剖顯微鏡1.5倍物鏡下用200ul無(wú)菌槍頭從100mm平皿中挑出未分化的單個(gè)克隆將單克隆轉(zhuǎn)至含有0.05胰酶的冰浴圓底96孔板中注意選擇20ul單道槍、量程調(diào)至15ul需嚴(yán)格控制時(shí)間在30min內(nèi)挑完一個(gè)96孔板每挑選一個(gè)單克隆后都需更換槍頭每個(gè)課題需挑4個(gè)96孔板。 5. 將含單克隆的圓底96孔板置37孵育箱消化3min。 6. 每板加入100ul/孔 g418培養(yǎng)基終止消化用排槍吹打混勻后轉(zhuǎn)至含50ul/孔 g418培養(yǎng)基、鋪有mmc飼養(yǎng)細(xì)胞的平底96孔板中。注意每次吹打混勻細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入新96孔板后都需更換槍頭排槍吹打時(shí)量程不要超過(guò)150ul 7. 標(biāo)記后37c、5 co2孵育箱培養(yǎng)。 22 2012北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司 關(guān)于挑克隆后的后續(xù)實(shí)驗(yàn) 1.2-3天后96孔板一分三80匯合度標(biāo)記分化的孔標(biāo)記為1-11-21-dna。 2.觀察細(xì)胞情況2天后80匯合度將1-11-2凍存