抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定ppt課件

1、l抗流感病毒單克隆抗體的制備與鑒定l l 1.文獻(xiàn)綜述2.單抗的制備與鑒定 目的意義 資料方法 結(jié)果與分析3.討論1.文獻(xiàn)綜述 1.1 流感的病原學(xué) 流感病毒在病毒分類學(xué)上屬正粘病毒科A型、B型流感病毒屬和C型流感病毒屬A型流感病毒亞型HA: 16NA: 10高致病性禽流感 (HPAI) -H5 and H7 1.2 流感病毒檢測技術(shù) 1.2.1 病毒的分別鑒定 1.2.2 血清學(xué)診斷技術(shù) 血凝HA和血凝抑制HI實(shí)驗(yàn) 瓊脂凝膠分散實(shí)驗(yàn)AGID 神經(jīng)氨酸酶抑制實(shí)驗(yàn)NIT 病毒中和實(shí)驗(yàn)NT 免疫熒光技術(shù)IFT 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) ELISA1.2.3 分子生物學(xué)診斷技術(shù) PCR 診斷技術(shù) 實(shí)時熒光定

2、量PCR NASBA法 核酸探針技術(shù) M 檢測法 基因芯片技術(shù) 2 單抗的制備與鑒定2.1 研討目的與意義 流感是第一個實(shí)行全球監(jiān)控的傳染性疾病。對人及禽、畜的危害非常宏大。除禽流感外，常見的還有人流感、馬流感和豬流感等。 動物流感尤其是禽流感與人類流感和人類安康非常親密，禽流感被以為是人流感病毒的保管和發(fā)生變異的新基因的來源，這種聯(lián)絡(luò)是經(jīng)過中間宿主來實(shí)現(xiàn)的。豬是人源、禽源和豬源流感病毒的獨(dú)一共同易感宿主，它能將流感病毒傳播給人。 2.1 研討目的與意義 流感的監(jiān)控任務(wù)是預(yù)防與控制該病的一個重要環(huán)節(jié)。國內(nèi)對流感病毒的臨床診斷主要是對抗體的檢測。 病毒抗原檢測方面，雖然病毒的分別鑒定是診斷禽流感

3、的一種可靠方法，但病毒的分別鑒定、動物接種實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，周期長，難以滿足對高致病性禽流感快速診斷的需求。聚合酶鏈?zhǔn)椒错慞CR、核酸探針等方法那么需求較好的實(shí)驗(yàn)條件和較高的人員素質(zhì)，目前還難以廣泛推行 。 流感病毒的HA蛋白具有亞型特異性，但NP蛋白卻相對保守。 利用NP蛋白和HA蛋白分別有望建立一種一切亞型禽流感病毒的檢測方法和診斷流感病毒亞型的方法。而單克隆抗體由于由于特異性以及高度親和力，用于病毒學(xué)診斷時相較于多抗有許多優(yōu)點(diǎn)。 本研討利用雜交瘤技術(shù)獲得了抗禽流感病毒NP蛋白和H3亞型禽流感病毒HA蛋白的單抗，為對禽流感病毒的進(jìn)一步研討和建立針對一切亞型禽流感病毒和H3亞型的檢測方法奠定根底

4、。 2.1 研討目的與意義2.2 資料方法2.2.1 細(xì)胞、病毒與動物 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保管。 流感病毒H9N2、H1N1由本實(shí)驗(yàn)室分別鑒定，保管。H3N8由哈爾濱 獸醫(yī)研討所提供。新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)、傳染性法氏囊病毒(IBDV)、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒EDS-76、禽腺病毒1型APMV-1購自北京梅里亞維通公司。 SPF雞胚購自北京梅里亞維通公司。 BALB/C小鼠購自湖北省疾病控制中心實(shí)驗(yàn)動物中心。2.2.2 培育基及主要試劑lRPMI-1640、HAT、HT、弗氏完全與不完全佐劑：GIBCOL公司。l新生小牛血清

5、超級：四季青生物工程公司。l精制小牛血清：Hyclone公司。l交融劑50PEGP7181、羊抗鼠IgG-HRP、l 8氮鳥嘌呤：SIGMA公司。l羊抗鼠IgG1、G2aHRP ：SBA公司。l青、鏈霉素：華北制藥廠。 2.3.3 方法l 病毒粒子的大量制備與純化 l 免疫原的制備l 動物免疫l SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的活化與制備l 免疫脾細(xì)胞的制備 l 細(xì)胞交融 l雜交瘤細(xì)胞上清檢測 l雜交瘤細(xì)胞的克隆化有限稀釋法l雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測 l單克隆抗體的消費(fèi)、純化和效價測定 l單克隆抗體亞類鑒定l單抗特異性鑒定l間接免疫熒光法檢測單克隆抗體 2.3.3 方法2.3 結(jié)果與分析 2.3.1 抗

6、NP蛋白雜交瘤細(xì)胞的挑選 用間接ELISA方法進(jìn)展挑選。運(yùn)用A法免疫制備了1株抗NP蛋白的單抗1D10，運(yùn)用B法獲得了4株單抗4F4、1C3、1G11、1C2，運(yùn)用C法獲得了1株單抗(2E7)。 各株單抗用間接ELISA方法的檢測結(jié)果如表21所示，其中1D10和1G11效價最高，用于以下的實(shí)驗(yàn)。抗抗NP雜交瘤細(xì)胞上清雜交瘤細(xì)胞上清ELISA檢測結(jié)果檢測結(jié)果(OD630)lAntigens 1D104F41C31G111C22E7H1N10.8310.4080.2760.5980.1980.211H3N81.0860.5670.4011.1590.5130.456H9N20.9750.4190.

7、3620.6870.3670.386陰性尿囊液0.1320.0400.0520.0530.095NNP1.1821.0370.4641.0110.5210.811BL21NNNNN0.057注：N表示沒有檢測； 所建立的ELISA臨界值均為0.2。 2.3.2 抗HA 蛋白雜交瘤細(xì)胞的挑選 經(jīng)過血凝抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)展挑選。 經(jīng)2 次檢測、3 次克隆后獲得3株穩(wěn)定分泌抗HA蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，延續(xù)培育數(shù)月，細(xì)胞生長良好，反復(fù)凍存復(fù)蘇后，仍堅(jiān)持穩(wěn)定的抗體分泌才干，分別命名為2B7、1C11、4G7。l2.3.3 雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測 l 雜交瘤細(xì)胞染色體計數(shù)結(jié)果見表22。l2.3.4 單克隆

8、抗體亞類鑒定 l 以羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP 為二抗用間接ELISA 鑒定了單克隆抗體的亞類。 l 結(jié)果見表22。表表22 單克隆抗體亞型及相應(yīng)雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體亞型及相應(yīng)雜交瘤細(xì)胞染色體計數(shù)染色體計數(shù)AntigenCells Antibody isotypes The number of chromosomes Splenocyte 40 SP2/0 70 Hybridoma NP 1D101G11G2aG1 94(8997)83(8186) HA2B71C114G7 G2aG1G2a 90(8294)98(92103)87(7987) l2.3.5 單克隆抗體的消費(fèi)和效價測定表

9、表23 抗抗NP蛋白雜交瘤上清和腹水的蛋白雜交瘤上清和腹水的ELISA效價測定結(jié)果效價測定結(jié)果(OD630) 1D10supernatant Ascite fluids 1G11supernatant Ascite fluidsH1N1200213100200212100H3N8400212100400211100H9N2400214100400213100NP200212100200210100表表24 抗抗H3 HA蛋白雜交瘤上清和腹蛋白雜交瘤上清和腹水的效價測定結(jié)果水的效價測定結(jié)果2B71C114G7ELISAsupernatant3208080Ascite fluids21110028

10、10027100HIsupernatant242121Ascite fluids21228272.3.6 單抗特異性鑒定單抗特異性鑒定 將抗NP單抗1D10、1G11分別用雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒包被的酶標(biāo)板作間接ELISA檢測，檢測結(jié)果全部為陰性，闡明所制備的單抗與這些病毒均無交叉反響。 抗H3 HA單抗2B7、1C11、4G7分別用H1、H3、H5、H9亞型禽流感病毒及雞新城疫病毒作血凝抑制實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果三種單抗只對H3亞型流感病毒有血凝抑制效價，闡明闡明所制備的單抗與這些病毒均無交叉反響。 2.3.7 間接免疫熒光 分別以一定濃度H1、H3

11、、H9亞型流感病毒感染MDCK細(xì)胞，固定細(xì)胞后進(jìn)展熒光染色檢測腹水?？箍筃P單抗與單抗與H3N8感染感染MDCK的的IFA檢測檢測 F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlA 1G11B 1D10抗抗H3 HA單抗與單抗與H3N8感染感染MDCK的的IFA檢測檢測 F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlE 4G7D 1C11C 2B7抗抗NP單抗與單抗與AIV H9亞型感染亞型感染MDCK的的IFA檢測檢測 A 1G11B 1D10F Positive controlG SP2/0H MDCK

12、 cells control抗抗H3 HA單抗與單抗與AIV H9亞型感染亞型感染MDCK的的IFA檢測檢測 F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlC 2B7D 1C11E 4G7F Positive controlG SP2/0H MDCK cells controlA 1G11B 1D10抗抗NP單抗與單抗與 H1N1亞型感染亞型感染MDCK的的IFA檢測檢測G SP2/0F Positive controlH MDCK cells controlC 2B7D 1C11E 4G7抗抗H3HA單抗與單抗與H1N1亞型感染亞型感染MDCK的的

13、IFA檢測檢測3 討論討論3.1 單抗制備中需留意的問題動物的免疫 細(xì)胞交融 雜交瘤細(xì)胞的挑選 雜交瘤細(xì)胞的克隆 雜交瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 污染的預(yù)防和排除 3.2 關(guān)于抗NP蛋白單抗 由于禽流感病毒NP蛋白相對保守，因此可以運(yùn)用抗NP蛋白的抗體來檢測一切亞型的禽流感病毒。 NP蛋白并非完全保守，因此要保證所制備的單抗是針對其保守性抗原位點(diǎn)的。 3.2 關(guān)于抗NP蛋白單抗 為了證明所產(chǎn)生的單克隆抗體確實(shí)是針對病毒NP蛋白保守性位點(diǎn)的，采用了多株禽流感病毒和表達(dá)的NP蛋白正挑選、陰性尿囊液及破碎的菌體負(fù)挑選的方法，挑選到了6株針對禽流感病毒NP蛋白保守性位點(diǎn)的單抗，其中2株是高效價的單抗。 本實(shí)驗(yàn)

14、所制備的2株高效價的抗NP蛋白的單抗用雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒、傳染性喉氣管炎病毒檢測，均無交叉反響，具有很好的特異性。 3.2 關(guān)于抗NP蛋白單抗 本研討所獲得的針對禽流感病毒NP蛋白的單克隆抗體為禽流感的診斷，甚至是A型流感病毒的診斷提供了高質(zhì)量的試劑。 本實(shí)驗(yàn)室已在此根底上進(jìn)展了雙夾心ELISA方法檢測不同亞型的禽流感病毒的研討，并曾經(jīng)研制出了相關(guān)試劑盒運(yùn)用于臨床檢測，為實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室診斷的規(guī)范化、開展流行病學(xué)調(diào)查研討奠定了很好的根底 。 3.2 關(guān)于抗NP蛋白單抗3.3 關(guān)于抗關(guān)于抗H3N8 HA蛋白單抗蛋白單抗 本研討所制備的3株高效價的抗HA蛋白的單抗用H1、H3、H5、H9亞型禽流感病毒及雞新城疫病毒作血凝抑制實(shí)驗(yàn)，檢測結(jié)果三種單抗只對H3亞型禽流感病毒有血凝抑制效價 闡明所制備的單抗與這些病毒均無交叉反響，具有很好的特異性。 HA是流感病毒的主要外表抗原，普通情況下，新分別的毒株鑒定，普通要做HA的亞型鑒定，故研討針對