基因工程工程菌構(gòu)建

1、1，3-丙二醇新型基因工程菌的構(gòu)建生物技術(shù)生物技術(shù)1101班班 李娟李娟 1，3丙二醇是目前國(guó)際上公認(rèn)的六大丙二醇是目前國(guó)際上公認(rèn)的六大石化新產(chǎn)品之一，其主要功能是作為合成石化新產(chǎn)品之一，其主要功能是作為合成聚酯、聚醚和聚亞氨酯的單體。聚酯、聚醚和聚亞氨酯的單體。1，3一丙一丙二醇的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法和微生物轉(zhuǎn)二醇的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法和微生物轉(zhuǎn)化法，但從自然界中篩選的微生物厭氧發(fā)化法，但從自然界中篩選的微生物厭氧發(fā)酵甘油生產(chǎn)酵甘油生產(chǎn)l，3一丙二醇還存在產(chǎn)物生產(chǎn)一丙二醇還存在產(chǎn)物生產(chǎn)周期長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化率低等問題，目前僅有化學(xué)周期長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化率低等問題，目前僅有化學(xué)合成法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。因此，利用基因

2、合成法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。因此，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)菌株備被認(rèn)為是今后的工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)菌株備被認(rèn)為是今后的發(fā)展方向。發(fā)展方向。1，3丙二醇簡(jiǎn)介丙二醇簡(jiǎn)介1，3-丙二醇性質(zhì) 物理性質(zhì)：1，3丙二醇(1，3-propanediol，l，3-PD)是一種無色無味透明的液體，易溶于水、乙醇、醚類和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相對(duì)密度為1053 gcm3，熔點(diǎn)27，沸點(diǎn)211，自燃溫度為400。 化學(xué)性質(zhì)：高溫下與羧酸縮合成酯，與異氰酸鹽及酸性氯化物生成聚氨酯。1。3一丙二醇最重要的性質(zhì)就是與二酸反應(yīng)生成聚酯和聚氨酯。1 1，3-3-丙二醇用途 可直接用于防凍劑，是多種增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑

3、的合成原料；也廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)14j。 1，3丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT的原料。PTT纖維克服了PET纖從而引起纖維材料界的矚目，可用于生產(chǎn)地毯、短絲及長(zhǎng)絲產(chǎn)品，產(chǎn)薄膜、非織造布和單絲，用作熱塑性工程塑料1，3-丙二醇基因工程菌構(gòu)建的預(yù)期目標(biāo) 本研究首先利用PCR方法從大腸桿菌中克隆116 kb的1，3丙二醇氧化還原酶同工酶的編碼基因yqhD280kb來源于克雷伯氏桿菌甘油脫水酶的編碼基因dhaB構(gòu)建了重組菌 i JM109(pEtacdhaBtac-yqhD) 構(gòu)建重組載體pUCtacdhaT，并在大腸桿菌JMl09共表達(dá)重組質(zhì)粒pEtacdhaBtac-yqh

4、D和pUCtac-dhaT，研究為提高1，3丙二醇產(chǎn)量提供了新途徑。 1，3-丙二醇基因工程菌構(gòu)建的路線(1)串聯(lián)表達(dá)來源于克雷伯氏菌(Klebsiella)編碼油脫水酶的基因dhaB以及來源于大腸桿菌(編碼1，3一丙二醇氧化還原酶同工酶的基因yqhD，構(gòu)建 重組菌E coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD);考察其轉(zhuǎn)化甘油的能力。(2)利用PCR擴(kuò)增來源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇氧化還原酶dhaT，構(gòu)建重組載體pUCtac一砌口T，并在大腸桿菌JMl09共表達(dá)重組質(zhì)粒pEtacdhaBtac-yqhD和pUCtac-dhaT。(3)在搖瓶水平，對(duì)已構(gòu)建的產(chǎn)1，3丙二醇重組菌

5、EcoliJMl09 發(fā)酵條件的初步研 1，3丙二醇生物合成途徑丙二醇生物合成途徑 l，3一丙二醇是一種典型的甘油發(fā)酵產(chǎn)物,并未發(fā)現(xiàn)其可由其他有機(jī)底物厭氧轉(zhuǎn)化而來。甘油作為唯一碳源和能源，它可以沿著氧化和還原途徑發(fā)生歧化反應(yīng)，氧化途徑中產(chǎn)物與糖類發(fā)酵產(chǎn)物一致，并產(chǎn)牛供細(xì)胞牛長(zhǎng)所必需的ATP，在某些產(chǎn)物形成的同時(shí)釋放還原力NADH；還原途徑則消耗氧化途徑中多余的還原力，生成1，3一丙二醇 。 一、大腸桿菌JMl09的構(gòu)建及其表達(dá) 1，菌株、質(zhì)粒及基因片斷： 大腸桿菌JMl09，質(zhì)粒pUCl9，pEtac由本實(shí)保藏；yqhD和dhaB基因分別從大腸 桿菌和克雷伯氏菌中克隆得到。 2，主要試劑： 質(zhì)

6、粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒化試劑盒 ；工具酶、抗生素 ；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、 材料（一）、質(zhì)粒（一）、質(zhì)粒DNA的提取的提取(1)接重組大腸桿菌一環(huán)于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜。(2)取15mL菌液于Eppendorf管中，6000rmin離心5 min。(3)棄去上清，加入溶液I 100“L重懸菌體。(4)加入溶液II 150“L，輕柔混勻。(5)加入溶液III 150此，倒轉(zhuǎn)混勻，8000 rmin，離心10min。(6)將420L結(jié)合緩沖液加入離心吸附柱中，然后將步驟5中的上清加入離心吸附柱中混勻，6000 rmin離心30s。倒掉廢液收集管中的廢液。（7)加入750此漂洗液于

7、離心吸附柱中，靜置1 min后，6000rmin離心30s。倒掉廢液收集管中的廢液。重復(fù)一次。倒掉廢液后。再次于6000 rmin離心2min，盡量除去漂洗緩沖液。 (8)小心取出離心吸附柱，將其套入一個(gè)干凈的15 mLEppendorf離心管中，加入適量洗脫緩沖液，常規(guī)50此，室溫放置25min后，6000 rmin離心2min。 (9)取5“L酶切后電泳鑒定。(二二)、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1)接種EcoliJM109于LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜。(2)取05mL培養(yǎng)液于50mLLB培養(yǎng)基中37振蕩培養(yǎng)至OD值O304。(3)菌液三角瓶放入冰水中，輕輕搖晃，使菌

8、液迅速冷卻約10分鐘。(4)分裝菌液到Eppendorf管(15mL)中，Eppendorf管迅速放入冰水中靜置15min。(5)8000rmin離心5min，然后靜置2min，冰水中迅速棄上清，加入預(yù)冷的CaCl2400uL， 輕輕吹吸懸浮菌體，冰水中放置30min。（6)重復(fù)步驟(5)兩次。 (7)8000rmin離心5min，然后靜置2min，冰水中迅速棄上清，加入預(yù)冷的CaCl280uL。也可加40 uL50的甘油保存代用。（三）、轉(zhuǎn)化大腸桿菌（三）、轉(zhuǎn)化大腸桿菌(1)取出感受態(tài)細(xì)胞，在冰水中融化。取出感受態(tài)細(xì)胞，在冰水中融化。(2)加入待轉(zhuǎn)化的加入待轉(zhuǎn)化的DNA，用吸頭輕柔混合，不可

9、，用吸頭輕柔混合，不可用漩渦混合儀。用漩渦混合儀。(3)冰水浴冰水浴40min。(4)42熱激熱激90s。(5)加入加入1mL LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，37震蕩培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)12 h。(6)涂布含有相應(yīng)抗生素的涂布含有相應(yīng)抗生素的LB平板平板。（四）、大腸桿菌（四）、大腸桿菌JMl09基因工程菌的構(gòu)建基因工程菌的構(gòu)建 首先將來源于大腸桿菌的基因片段首先將來源于大腸桿菌的基因片段yqhD連入載體連入載體pEtac上，得到重組質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒pEtac-yqhD，經(jīng)酶切，得到片段，經(jīng)酶切，得到片段tac-yqhD連入載體連入載體pUCl9，得到重組質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pUCtac-yqhD，將，將來源

10、于克雷伯氏菌的基因片段來源于克雷伯氏菌的基因片段dhaB連入載體連入載體pUCtac-yqhD，以得到的重組質(zhì)粒，以得到的重組質(zhì)粒pUCdhaBtac-yqhD。將重組表達(dá)載體酶。將重組表達(dá)載體酶切連接到切連接到pEtac上，得到雙啟動(dòng)子重組表達(dá)大上，得到雙啟動(dòng)子重組表達(dá)大腸桿菌腸桿菌JM 109(pEtacdhaB-tac-yqhD)。（五）、酶活力測(cè)定（五）、酶活力測(cè)定 1、甘油脫水酶活力的測(cè)定、甘油脫水酶活力的測(cè)定2、1，3一丙二醇氧化還原酶同工酶的酶一丙二醇氧化還原酶同工酶的酶 活力測(cè)定活力測(cè)定（六）、（六）、1，3丙二醇含量的測(cè)定丙二醇含量的測(cè)定 發(fā)酵液中l(wèi)，3：丙二醇及甘油的含量采

11、用氣相色譜測(cè)定 ，國(guó)產(chǎn)高分子微GDX401(110目)為固定相。柱溫：250，進(jìn)樣溫度：240，檢測(cè)溫度t 240，氮?dú)庾鳛檩d氣，使用氫火焰檢測(cè)器，進(jìn)樣5“L，1，3丙二醇的保留時(shí)間為27 min左右，用外標(biāo)法計(jì)算發(fā)酵液中1，3一丙二醇的含量。二、重組質(zhì)粒pUCtac-dhaT的構(gòu)建及其與pEtacdhaBtac-yqhD在大腸桿菌JMl09中共表達(dá)實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 菌種：E coliJMl09(pEtac-dhaBtac-yqhD)為本研究“第二章構(gòu)建保存的；質(zhì)粒pUCl9，pEtac由本實(shí)驗(yàn)室保藏：dhaT基因從克雷伯氏菌中 試劑和工具酶：質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒

12、工具酶、抗生素 公司、華美生物 ；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、 3PCR引物 根據(jù)克雷伯氏菌公布的序列， 。 引物引物： 3PCR引物 根據(jù)克雷伯氏菌公布的序列，設(shè)計(jì)片段pEtacdhaTPCR所需引物：Ps：5-ACCGCAATTGATGAGCTATCGTATGTTTG一3：P6：5-ACC CAGAATGCCTGGCG3。引物兩端均弓l,KmfeI、HindlII酶切位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)條件和方法 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)體系：在0 5 mL Eppendorf管中按順序加入以下試劑：10buffer 5 m，2 5mmolLdNTP4lLl，MgCl24IlI，上下游

13、引物各1 IIl，模板DNA2 pl，腳酶1 itl，ddH20 32m，總體積50 pl。 13一丙二醇氧化還原酶一丙二醇氧化還原酶dhaT的反應(yīng)條件：的反應(yīng)條件：94預(yù)變性5min：變性90 s，54退火l 5min，72延伸l 5rain，循環(huán)35次；72保溫10min。 （1）大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建將來源于克雷伯氏菌的基因片段dhaT連入載體pEtae，以得到的重組質(zhì)粒pEtac-dhaT。經(jīng)酶切得到片段tac-dhaT連接到pUCl9上，以得到的重組質(zhì)粒pUC-tac-dhaT。將基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtac-dhaB-tac-yqhD共轉(zhuǎn)化大腸桿菌Kco

14、liJMl09。 （2） 1，3丙二醇氧化還原酶的酶活力測(cè)定測(cè)定1，3-丙二醇氧化還原酶的酶活。酶活測(cè)定根據(jù)250C條件下NAD+還原成NADH的速率來定量。酶活單位定義為1國(guó)際單位(1u)等于每分種還原1lJmol底物NAD+或生成1“raol產(chǎn)物NADH的酶量。四、重組菌四、重組菌coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD，pUCtacdhaT)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 菌株：重組菌Ecoli JMl09(pEtacdhaB-tac-yqhD，pUCtacdhaT)為本論文三中構(gòu)建。 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 LB培養(yǎng)基(L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉lO，瓊脂15(固體培養(yǎng)基

15、)，固體和液體培養(yǎng)基在需要時(shí)加入氨芐青霉素至100tgmL、卡那霉素50pgmL。 種子培養(yǎng)基：采用LB培養(yǎng)基。 發(fā)酵培養(yǎng)基(gL)：甘油、酵母膏、KH2P04、MgS047H20和維生素B12 青霉素至100IxgmL、卡那霉素50rtgmL。材料材料 搖瓶發(fā)酵：從新鮮的LB培養(yǎng)基斜面上挑取一環(huán)菌株接入50 mL搖瓶(裝液量為10mL)中，于旋轉(zhuǎn)式搖床中37、150 rmin培養(yǎng)18 h得到種子液。接種于250 mL搖瓶中，在150 rmin旋轉(zhuǎn)式搖床中，先于37。C培養(yǎng)至OD600為O7，再于37誘導(dǎo)發(fā)酵一定時(shí)間。方法方法1、采用單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了不同濃度的甘油、酵母膏、KH2P04、V

16、Bl2及M孑+等因素對(duì)重組菌E coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD，pUCtacdhaT)發(fā)酵結(jié)果的影響，確定了其發(fā)酵培養(yǎng)基的基本組成為：甘油20gL、VBl2001gL、KH2P0475edL、M92+067gL和酵母膏5L，在此培養(yǎng)基中l(wèi)，3一丙二醇的產(chǎn)量達(dá)到225L。 小結(jié)2、通過正交實(shí)驗(yàn)分析法進(jìn)一步優(yōu)化了重組菌EcoliJMl09(pEtac-dhaBtac-yqhD，pUCtac-dhaT)的發(fā)酵培養(yǎng)基，其適宜組成為：甘油20 gL、VBl2 O01 gL、KH2P045 gL、M92+067 edL和酵母膏5L。最適發(fā)酵條件為：裝液量10、接種量10、轉(zhuǎn)速150rmin、接種后4d,時(shí)左右加入IPTG、IPTG終濃度為lmmolL。應(yīng)用此培養(yǎng)基l，3丙二醇的產(chǎn)量為24329L，3、在通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，重組菌EcoliJMl09(pEtaedhaBtac-yqhD)與E coliJMl09(pEtacdhaBta