人類基因組DNA提取

1、人類類基因組組DNA提取、限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶切割的原理、方法、瓊瓊脂糖凝膠電膠電泳結(jié)結(jié)果分析及其應(yīng)應(yīng)用藥學(xué)藥學(xué)第二討論討論小組組人類基因組人類基因組DNADNA的提取的提取提取方法提取方法: :1從全血中提取2從口腔上皮脫落細(xì)胞，發(fā)根細(xì)胞中提取( (全血）原理：全血）原理：v細(xì)胞裂解液 ：裂解細(xì)胞膜，收集細(xì)胞核vSDS：破裂核膜v蛋白酶K：使核蛋白降解成小片段并從DNA上解離 下來(lái)v苯酚氯仿：抽提去除蛋白質(zhì)v無(wú)水乙醇：沉淀DNAv75%乙醇：洗滌DNA沉淀真空干燥后，溶解于TE中即得到高分量的DNA（全血）操作方法：（全血）操作方法：細(xì)胞裂解與細(xì)胞裂解與RNaseRNase/ /蛋白酶蛋白酶K

2、 K 消化消化1. 取100 l抗凝全血置于1.5ml Eppendorf離心管中，再加入100 l裂解液和20 l RNaseA/蛋白酶K液，用移液器來(lái)回吹打混勻，室于55溫浴35分鐘，其間來(lái)回顛倒離心管幾次，直至溶液呈水溶狀。2. 加入10l 3M的NaAc(pH 4.8)，隨后加入1250 l結(jié)合緩沖液，充分振蕩混勻，12，000 rpm離心30秒。DNADNA與吸附柱結(jié)合與吸附柱結(jié)合3用移液器Tip轉(zhuǎn)移上清并加入到離心吸附柱（套好收集管）中，放置1分鐘，12，000 rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。注意：待轉(zhuǎn)移上清約1300l，離心吸附柱容量約650 l，故需每次轉(zhuǎn)移上清650

3、l到離心吸附柱中，離心，倒掉收集管中的廢液，重復(fù)實(shí)驗(yàn)操作步驟3。DNADNA的純化的純化: : 4. 再加入600 l洗滌緩沖液（washing buffer）到離心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 離心30秒。5重復(fù)步驟4一次，12，000 rpm 離心3分鐘以充分除去洗滌緩沖液。 6小心取出離心吸附柱，棄收集管，將離心吸附柱套入一個(gè)干凈的1.5ml Eppendorf 離心管，并加入50 l洗脫緩沖液(elution buffer) 到離心吸附柱中(洗脫緩沖液一定要加在離心吸附柱的正中)，放置1分鐘，于12，000 rpm 離心30秒。7取出Eppendorf 離心管，其中便是

4、所提取基因組NA。口腔上皮脫落細(xì)胞）原理口腔上皮脫落細(xì)胞）原理 哺乳動(dòng)物的一切有核細(xì)胞都可以用來(lái)制備DNA,除特殊要求外，白細(xì)胞，肝或脾組織是最常用的的材料。原始材料較少或較難獲得時(shí)（如羊水細(xì)胞），還必須經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)獲得足夠量的細(xì)胞，有時(shí)為了簡(jiǎn)易，還可以無(wú)創(chuàng)傷的采集材料，如用口腔上皮脫落細(xì)胞，發(fā)根細(xì)胞。產(chǎn)前診斷所用的材料則為胎兒的羊水細(xì)胞或絨毛膜細(xì)胞； （口腔上皮脫落細(xì)胞）操作方法：（口腔上皮脫落細(xì)胞）操作方法：1、用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙刮頰部，嘬咀，用分泌出的唾液反復(fù)漱口；將唾液吐到杯中。用生理鹽水洗滌，2000rpm離心10分鐘，倒掉上清液；重復(fù)1次。2、沉淀中加1ml 1細(xì)胞核裂解液

5、(STE)，打散細(xì)胞團(tuán)、混勻，再加酶解混合液（含350l STE、150l 10% SDS和10l 20mg/ml蛋白酶K），搖勻，至出現(xiàn)粘稠透明狀。37溫箱過(guò)夜或5034小時(shí)。3、加等體積飽和酚（或1/3體積的飽和NaCl），輕搖混勻10分鐘，室溫2000rpm離心10分鐘，去除蛋白和SDS的沉淀。4、小心移上清至另一離心管（盡量避免吸取中間層），加等體積氯仿混勻5分鐘，室溫2000rpm離心5分鐘。5、重復(fù)步驟4一次。6、將上清移入另一離心管中，沿離心管壁向DNA溶液中加入2.5倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕搖動(dòng)離心管混和至體系完全均一，見(jiàn)白色絮狀DNA。用移液器吸頭挑出DNA沉淀，在新配制的70

6、%乙醇洗二次，室溫干燥5分鐘，再將DNA溶于20-100l TE中。7、TE溶解的DNA，在4下可保存一年，如要求長(zhǎng)期保存，則需加2倍體積無(wú)水乙醇置-70保存。 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶一、概概念核酸酶內(nèi)切酶外切酶限制性核酸內(nèi)切酶：限制性核酸內(nèi)切酶：能識(shí)別雙鏈能識(shí)別雙鏈DNA分子內(nèi)部分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)并裂解的特異位點(diǎn)并裂解磷酸二磷酸二酯鍵酯鍵二、分類類v 分類依據(jù)：酶的基因、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、依賴的輔助因子及與DNA結(jié)合和裂解的特異性特性I類II類III類內(nèi)內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)單單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞亞基的雙雙功能酶限制和修飾飾活性3種種不同的亞亞基單一成分2種種不同的亞亞

7、基所需輔輔助因子ATM,Mg2+,SAMMg2+ATM,Mg2+,SAM寄主特異異性位點(diǎn)識(shí)識(shí)別別序列EcoB:TGA(N)8TGCTEcoK:AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG 切割位點(diǎn)在距離識(shí)別位點(diǎn)至少1000pb處隨機(jī)切開一條單鏈位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近距寄主特異性位點(diǎn)3端24-26pb處酶催轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異異性位點(diǎn)寄主特異性位點(diǎn)寄主特異異性位點(diǎn)識(shí)別為識(shí)別為甲基化的序列進(jìn)進(jìn)行切割能能能序列特異異的切割不是是是基因工程中的用途無(wú)用十分有用作用不大三、作用機(jī)制 以環(huán)狀或線性的雙鏈DNA

8、為底物，在合適的反應(yīng)條件下，識(shí)別特定的核苷酸序列，使兩條核苷酸糖鏈上特定位置的磷酸二酯鍵斷裂，兩裂口之間的堿基對(duì)的氫鍵也隨之?dāng)嚅_，產(chǎn)生具有3-羥基和5-磷酸基的DNA片段。四、切割方法識(shí)別和切割位點(diǎn) 4-6個(gè)堿基對(duì)且具有回文序列的DNA片段 大多數(shù)酶是錯(cuò)位切割產(chǎn)生5或者3黏性末端例如：EcoR I 切割后產(chǎn)生5黏性末端5-GAATTC-3 5-G AATTC-33-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5黏性末端黏性末端平末端平末端有一些酶沿對(duì)稱軸切斷DNA，產(chǎn)生的末端稱為平端或鈍端例如:SmaI同工異源酶同工異源酶 來(lái)源不同的酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn) 如BamH I 和Bst I(GGAT

9、CC)同尾酶同尾酶 有些限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列不同，但是產(chǎn)生相 同的黏性末端。 如BamH I（GGATCC）和 Sau3A I(NGATCN)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠:天然瓊脂是一種多聚糖，主要由瓊脂糖及瓊脂膠組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些集團(tuán)帶有點(diǎn)荷，在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象。 什么是瓊脂糖凝膠電泳？ 瓊脂糖凝膠電泳主要是應(yīng)用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法，借助瓊脂凝膠分子篩作用，核算片段因其分子量或者分

10、子形狀不同，電泳速度有差異而分離。這種技術(shù)是基因操作的一種方法。瓊瓊脂糖凝膠電膠電泳原理v瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力,同時(shí)也由此造成了經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的泳動(dòng)后按大小形成的一條“條帶”。其中線狀的DNA可以通過(guò)。瓊瓊脂糖凝膠電膠電泳原理: 核酸分子是兩性解離分子，在高于其等電點(diǎn)的電泳緩沖液中，其堿基不解離，而磷酸基團(tuán)全部解離，核酸分子因而帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極遷移使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì)，發(fā)揮分子篩功能，使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子的

11、遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達(dá)到分離的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。 瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離結(jié)果與核酸的分子量、分子構(gòu)型和凝膠濃度核酸的分子量、分子構(gòu)型和凝膠濃度密切相關(guān)。密切相關(guān)。 實(shí)驗(yàn)證明，DNA片段遷移距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比。通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)物與未知片段的移動(dòng)距離便可測(cè)出未知片段的大小。 但當(dāng)DNA分子超過(guò)20kb時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難講它們分開。1 1) )核酸的分子量核酸的分子量質(zhì)粒DNA有三種形式v1、共價(jià)閉環(huán)DNA:常以超螺旋形式存在v 2、開環(huán)DNA:質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，

12、因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力,形成松弛的環(huán)狀分子 v 3、線性DNA:因質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成.2 2）核酸構(gòu)型）核酸構(gòu)型 不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。在分子量相當(dāng)?shù)那闆r下，不同構(gòu)型的質(zhì)粒DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗矁r(jià)閉環(huán)DNA直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。這三種構(gòu)型的相對(duì)遷移速率主要取決于凝膠濃度，同時(shí)也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。 超螺旋DNA： 盡管質(zhì)粒通常以開環(huán)的形式進(jìn)行描述，然而在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)DNA鏈即是盤繞在組蛋白周圍形成一種致密的結(jié)構(gòu)。這就是所謂超螺旋結(jié)構(gòu)，由于其結(jié)構(gòu)致密，它在凝膠中的泳動(dòng)速度最快。 線性DNA： 當(dāng)DNA損傷在DNA雙

13、鏈相對(duì)應(yīng)的兩條鏈上同時(shí)產(chǎn)生切口時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)線性質(zhì)粒DNA，這種DNA的泳動(dòng)速率介于超螺旋與切口質(zhì)粒DNA之間。開環(huán)DNA： 在質(zhì)粒DNA復(fù)制過(guò)程中，拓?fù)洚悩?gòu)酶I會(huì)在DNA雙螺旋中的一條鏈中引入一個(gè)切口，解開質(zhì)粒的超螺旋。在質(zhì)粒分離過(guò)程中由于物理剪切和酶的切割作用同樣也會(huì)在超螺旋質(zhì)粒中引入切口從而產(chǎn)生松散的開環(huán)結(jié)構(gòu)。這種形式的質(zhì)粒遷移速率最慢，其“松散”的分子形式阻礙了它在瓊脂糖凝膠中的運(yùn)動(dòng)。 一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率不同。要有效地分離大小不同的DNA片段，需選用適當(dāng)?shù)沫傊悄z濃度。3 3）瓊脂糖的濃度）瓊脂糖的濃度瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用。瓊脂糖凝膠電泳的應(yīng)用。v

14、蛋白質(zhì)和核酸，由于pH的不同帶有不同電荷，且在電場(chǎng)中受力大小不同，導(dǎo)致發(fā)生泳動(dòng)的速度不同，最終可將其分離開來(lái)。v電泳緩沖液的pH在69之間，離子強(qiáng)度0.020.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)107bp的DNA片段。v電泳的緩沖液中充滿了離子，因此可以導(dǎo)電。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以

15、同樣的速率向正極方向移動(dòng)瓊瓊脂糖凝膠電膠電泳注意點(diǎn)選擇合適的電泳方法v瓊脂糖凝膠電泳：一般的核酸檢測(cè)v聚丙烯酰胺凝膠電泳：高分辨率v脈沖凝膠電泳：DNA鏈巨大凝膠濃度 濃度通常在0.52%之間，低濃度的用于大片段核酸的電泳，高濃度的用于小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。注意：高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。 緩沖液: 常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。 注意：電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的D

16、NA帶遷移的現(xiàn)象。 電壓和溫度: 電泳時(shí)電壓不應(yīng)該超過(guò)20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30，對(duì)于巨大的DNA電泳，溫度應(yīng)該低于15。 注意：如果電泳時(shí)電壓和溫度過(guò)高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象 DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對(duì)照DNA來(lái)估計(jì)DNA片段大小。Marker應(yīng)該選擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的，這樣對(duì)目標(biāo)片段大小的估計(jì)比較準(zhǔn)確。需要注意的是Marker的電泳同樣要符合DNA電泳的操作標(biāo)準(zhǔn)。核酸染色劑劑 實(shí)驗(yàn)室常用的核酸染色劑是溴化乙錠（EB） 溴化乙錠（EB）：是一種吖啶類染料，它在

17、紫外燈照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍，電泳后就可直接紫外燈照射檢測(cè)瓊脂糖中的DNAv優(yōu)點(diǎn)：染色效果好，操作方便v缺點(diǎn)：穩(wěn)定性差，具有毒性。v注意：觀察凝膠時(shí)應(yīng)根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長(zhǎng)，如果激發(fā)波長(zhǎng)不對(duì)，條帶則不易觀察，會(huì)出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。DNA樣樣品的純純度和狀態(tài)狀態(tài)v樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。 乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。v變性的DNA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。 用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性DNADNA的上樣的上樣 正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。 注意太多的DNA上樣量可能導(dǎo)致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號(hào)弱甚至缺失。瓊脂糖凝膠電泳操