血清蛋白電泳

1、血清蛋白電泳血清蛋白電泳 (Serum Protein Electrophoresis) 血清和血漿血清和血漿 血清:是指離體的血液經(jīng)過自然凝固自然凝固而析出 的液體部分. 血漿:是指離體并經(jīng)過抗凝抗凝的血液經(jīng)過離心 沉淀后的上清部分. 血清中無纖維蛋白原血清中無纖維蛋白原 簡簡 介介 l人類血液中有人類血液中有125125種種以上蛋白質成分。以上蛋白質成分。 l白蛋白、脂蛋白、抗體、補體、凝血酶原白蛋白、脂蛋白、抗體、補體、凝血酶原 和凝血因子、抗凝血因子、和凝血因子、抗凝血因子、1-1-抗胰蛋白、抗胰蛋白、 1-1-糖蛋白、糖蛋白、2-2-巨球蛋白、轉鐵蛋白和巨球蛋白、轉鐵蛋白和 其他微量

2、蛋白等成分。其他微量蛋白等成分。 歷歷 史史 v1809年，年，Pehce(俄國物理學家俄國物理學家)首先發(fā)現(xiàn)首先發(fā)現(xiàn) 電泳現(xiàn)象電泳現(xiàn)象 v1937年，年，Tiselius(瑞典瑞典)制成界面電泳儀，制成界面電泳儀， 應用于蛋白質研究應用于蛋白質研究 v1948年，年，Wieland和和Fischer建立了濾紙建立了濾紙 電泳法，奠定了區(qū)帶電泳技術的基礎電泳法，奠定了區(qū)帶電泳技術的基礎 v1959年，年，Raymond和和Weintraub創(chuàng)建聚創(chuàng)建聚 丙烯酰胺凝膠電泳丙烯酰胺凝膠電泳 電泳和電泳技術電泳和電泳技術 u電泳電泳是指帶電粒子在電場的作用下，向是指帶電粒子在電場的作用下，向 著與其

3、電性相反的電極移動的現(xiàn)象。著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象。 u電泳技術電泳技術指利用電泳現(xiàn)象對混合物進行指利用電泳現(xiàn)象對混合物進行 分離分析的技術。分離分析的技術。 應用應用 電泳技術除了用于小分子物質的分離分析 外,最主要用于蛋白質,核酸等生物分子的研 究.由于電泳法設備簡單,操作方便,具有高分 辨率及選擇性特點,已成為醫(yī)學檢驗中常用 的技術. COO- COO- COOH + H+ + H+ Pr Pr Pr + OH- + OH- NH2 NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI 電泳用于分離物質的原理電泳用于分離物質的原理 電泳分類電泳分類 v按分離的原理不同：區(qū)帶電泳、自由

4、界面電按分離的原理不同：區(qū)帶電泳、自由界面電 泳、等速電泳、等電聚焦電泳泳、等速電泳、等電聚焦電泳 v按支持介質的不同：紙電泳、醋酸纖維薄膜按支持介質的不同：紙電泳、醋酸纖維薄膜 電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電電泳、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電 泳泳 v按支持介質形狀不同：薄層電泳、板電泳和按支持介質形狀不同：薄層電泳、板電泳和 柱電泳柱電泳 v按用途不同：分析電泳、制備電泳、定量免按用途不同：分析電泳、制備電泳、定量免 疫電泳和連續(xù)制備電泳。疫電泳和連續(xù)制備電泳。 影響電泳的因素影響電泳的因素 在電泳中在電泳中,電場電場,帶電粒子和促使帶電粒子移帶電粒子和促使帶電粒子移 動的介質

5、是產(chǎn)生電泳的三大要素動的介質是產(chǎn)生電泳的三大要素.因而因而,影影 響電泳的主要因素有：響電泳的主要因素有： 電場強度的影響電場強度的影響 溶液的溶液的pH值值 溶液的離子強度溶液的離子強度 電滲電滲 溫度、分子大小、吸附作用等溫度、分子大小、吸附作用等 電電 滲滲 液體對固體支持物的相對移動，由液體對固體支持物的相對移動，由 緩沖液的水分子和支持介質的表面之間緩沖液的水分子和支持介質的表面之間 產(chǎn)生的一種相關電荷所引起。如果電滲產(chǎn)生的一種相關電荷所引起。如果電滲 與電泳方向相同，與電泳方向相同，V變大；反之變小。變大；反之變小。 血清蛋白醋酸血清蛋白醋酸 纖維素薄膜電泳纖維素薄膜電泳 原原 理

6、理 l在在 pH8.6堿性環(huán)境，血清蛋白均帶負電荷，堿性環(huán)境，血清蛋白均帶負電荷， 在電場中向正極移動在電場中向正極移動 l各種蛋白質各種蛋白質pI不同，帶電荷量有差異不同，帶電荷量有差異 l蛋白質的分子大小與分子形狀不相同蛋白質的分子大小與分子形狀不相同 l帶電荷多、分子量小者，泳動較快；反之帶電荷多、分子量小者，泳動較快；反之 則較慢則較慢 蛋白質的等電點、分子量及遷移率蛋白質的等電點、分子量及遷移率 蛋白質名稱蛋白質名稱等電點等電點相對分子量相對分子量電泳遷移率電泳遷移率 白蛋白白蛋白4.844.846.96.9萬萬5.95.9* *1010-5 -5 1-1-球蛋白球蛋白5.065.0

7、62020萬萬5.15.1* *1010-5 -5 2-2-球蛋白球蛋白5.065.063030萬萬4.14.1* *1010-5 -5 -球蛋白球蛋白5.125.129 9萬萬1515萬萬2.82.8* *1010-5 -5 -球蛋白球蛋白6.866.867.307.30 15.615.6萬萬3030萬萬1.01.0* *1010-5 -5 電泳結果示意圖電泳結果示意圖 2 1清蛋白清蛋白 染色時染料與蛋白質特異結合而不與醋纖膜結染色時染料與蛋白質特異結合而不與醋纖膜結 合，染色深淺與蛋白質的量成正比合，染色深淺與蛋白質的量成正比 染色一段時間后脫色，將各蛋白區(qū)帶剪下，經(jīng)染色一段時間后脫色，

8、將各蛋白區(qū)帶剪下，經(jīng) 脫色、比色即可計算出各蛋白質組分的相對百脫色、比色即可計算出各蛋白質組分的相對百 分數(shù)。分數(shù)。 如同時測定出總蛋白濃度，還可計算出各蛋白如同時測定出總蛋白濃度，還可計算出各蛋白 組分的絕對濃度組分的絕對濃度 正常血清電泳掃描圖譜正常血清電泳掃描圖譜 試試 劑劑 l緩沖液：巴比妥緩沖液（緩沖液：巴比妥緩沖液（pH8.6 ） l染色液：麗春紅染色液：麗春紅S染色液染色液 l漂洗液：漂洗液：3%（V/V）醋酸溶液）醋酸溶液 l洗脫液：洗脫液：0.1mol/LNaOH溶液溶液 操操 作作 u準備準備 電泳槽準備電泳槽準備 CAM的準備的準備 u點樣點樣 吸吸3-5l血清均勻點于血

9、清均勻點于CAM無光澤面無光澤面 u電泳電泳 無光澤面朝下，點樣側置于負極端，通電無光澤面朝下，點樣側置于負極端，通電 u染色染色 將薄膜條浸入麗春紅將薄膜條浸入麗春紅S染色液，染染色液，染5-10min u漂洗漂洗 醋纖膜規(guī)格及點樣示意圖醋纖膜規(guī)格及點樣示意圖 定定 量量 l取試管取試管6支，在白蛋白管內加入支，在白蛋白管內加入0.1mol/L NaOH 液液6ml，其余各管加入，其余各管加入3ml，將各蛋白區(qū)帶剪下，將各蛋白區(qū)帶剪下 分別置于各試管中，另從空白背景剪一塊平均分別置于各試管中，另從空白背景剪一塊平均 大小的膜條置于空白管中，大小的膜條置于空白管中，3710-20min l向白

10、蛋白管中加入向白蛋白管中加入40%醋酸醋酸0.6ml,其余各管加其余各管加 0.3ml,以中和部分以中和部分NaOH l用用520nm比色，以空白管調零，讀各管吸光度比色，以空白管調零，讀各管吸光度 計計 算算 設各部吸光度分別為設各部吸光度分別為AA、Aa1、Aa2、 A、A。吸光度總和（。吸光度總和（AT）為：）為： AT= AA+Aa1+Aa2+A+A v 白蛋白（白蛋白（%）（AA *2 AT）*100% v a1-球蛋白（球蛋白（%） = （Aa1 AT）*100% v 注意事項注意事項 n通電時，不得接觸槽內緩沖液或通電時，不得接觸槽內緩沖液或CAM， 以防觸電以防觸電 n緩沖液液

11、面要保證一定高度緩沖液液面要保證一定高度 n標本：血清應新鮮，不得溶血標本：血清應新鮮，不得溶血 n染料：對蛋白質的各組分親和力相同，染料：對蛋白質的各組分親和力相同， 水溶性好，穩(wěn)定，吸光度敏感，形成的水溶性好，穩(wěn)定，吸光度敏感，形成的 染料蛋白質復合物穩(wěn)定且易洗脫比色染料蛋白質復合物穩(wěn)定且易洗脫比色 注意事項注意事項 n電泳后區(qū)帶拖尾、各區(qū)帶分開不明顯電泳后區(qū)帶拖尾、各區(qū)帶分開不明顯原因原因： u點樣過多點樣過多 u點樣不均勻、不整齊點樣不均勻、不整齊 u樣品觸及薄膜邊緣；薄膜過濕，樣品擴散；樣品觸及薄膜邊緣；薄膜過濕，樣品擴散； u薄膜未完全浸透或溫度過高導致干燥或水分薄膜未完全浸透或溫

12、度過高導致干燥或水分 蒸發(fā)薄膜與濾紙橋接觸不良蒸發(fā)薄膜與濾紙橋接觸不良 u薄膜位置歪斜、彎曲，與電流方向不平行薄膜位置歪斜、彎曲，與電流方向不平行 u緩沖液變質；樣品不新鮮緩沖液變質；樣品不新鮮 uCAM質量不高等質量不高等 u電滲現(xiàn)象電滲現(xiàn)象 評評 價價 v優(yōu)點：優(yōu)點：CAM電泳具有靈敏度高，標本用量少，電泳具有靈敏度高，標本用量少， 分辨率高，區(qū)帶清晰，電泳時間短，操作簡便分辨率高，區(qū)帶清晰，電泳時間短，操作簡便 快捷；快捷；CAM對染料不吸附，蛋白區(qū)帶均勻，背對染料不吸附，蛋白區(qū)帶均勻，背 景清晰，既易比色定量，又易透明后進行光密景清晰，既易比色定量，又易透明后進行光密 度掃描。度掃描。

13、 v缺點：缺點：有輕微有輕微電滲電滲現(xiàn)象，薄膜吸水性差，電阻現(xiàn)象，薄膜吸水性差，電阻 容易增大，當電流較大時，薄膜中水分極易蒸容易增大，當電流較大時，薄膜中水分極易蒸 發(fā)，造成蛋白質分子變性破壞。發(fā)，造成蛋白質分子變性破壞。 臨床意義臨床意義 麗春紅麗春紅S染色參考范圍染色參考范圍 蛋白質組分蛋白質組分g/L占總蛋白的百分數(shù)占總蛋白的百分數(shù)(%) 白蛋白白蛋白35525768 1-球蛋白球蛋白1.04.0 1.0 5.7 2-球蛋白球蛋白4.08.0 4.9 11.2 -球蛋白球蛋白5.010.0 7.0 13.0 -球蛋白球蛋白6.013.0 9.8 18.2 各組分構成各組分構成 l Al

14、b：白蛋白：白蛋白 l1：1酸性糖蛋白；酸性糖蛋白；1抗胰蛋白抗胰蛋白 酶；甲胎蛋白；高密度脂蛋白酶；甲胎蛋白；高密度脂蛋白 l2：觸珠蛋白；銅蘭蛋白；：觸珠蛋白；銅蘭蛋白；2巨球蛋白；巨球蛋白； 脂蛋白脂蛋白 l：轉鐵蛋白；補體系統(tǒng)；：轉鐵蛋白；補體系統(tǒng)；脂蛋白脂蛋白 l：IgG；IgM；IgA；IgD；IgE； CRP 臨床意義臨床意義 肝病型：肝病型： Alb降低降低 和和-球蛋白增高球蛋白增高 出現(xiàn)出現(xiàn)和和難以分離，出現(xiàn)難以分離，出現(xiàn) “-橋橋”，此，此 現(xiàn)象往往是由于現(xiàn)象往往是由于IgA增高所致，增高所致， IgA與肝與肝 纖維化有關。見于急慢性肝炎和肝硬化。纖維化有關。見于急慢性肝

15、炎和肝硬化。 臨床意義臨床意義 M蛋白血癥型蛋白血癥型 Alb輕度降低輕度降低 單克隆單克隆球蛋白（球蛋白（M蛋白）增高蛋白）增高 在在與與-球蛋白區(qū)或球蛋白區(qū)或-球蛋白區(qū)出現(xiàn)一條致密球蛋白區(qū)出現(xiàn)一條致密 濃集的濃集的M蛋白帶蛋白帶 見于見于MM、巨球蛋白血癥等、巨球蛋白血癥等 臨床意義臨床意義 v腎病型：表現(xiàn)為白蛋白及腎病型：表現(xiàn)為白蛋白及-球蛋白降低，球蛋白降低， 2 和和- 球蛋白升高。見于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎球蛋白升高。見于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎 功能衰竭等。功能衰竭等。 v炎癥型：表現(xiàn)為炎癥型：表現(xiàn)為1、2 和和三種球蛋白均增高，三種球蛋白均增高， 見于各種急、慢性炎癥和應

16、激反應。見于各種急、慢性炎癥和應激反應。 v蛋白缺乏癥：主要包括蛋白缺乏癥：主要包括1抗胰蛋白酶缺乏癥、抗胰蛋白酶缺乏癥、 - 球蛋白缺乏癥等（較少見）球蛋白缺乏癥等（較少見） 雙白蛋白血癥型雙白蛋白血癥型 l主要特征：在白蛋白部位有兩個區(qū)主要特征：在白蛋白部位有兩個區(qū) 帶，掃描出現(xiàn)雙峰，呈剪刀狀。帶，掃描出現(xiàn)雙峰，呈剪刀狀。 l產(chǎn)生原因：產(chǎn)生原因： 持久型主要是一種持久型主要是一種家族性血清蛋白家族性血清蛋白 異常異常的疾病，極少見，為常染色體的疾病，極少見，為常染色體 不完全顯性遺傳；不完全顯性遺傳； 暫時型主要是指暫時型主要是指腎功能不全腎功能不全的患者的患者 在治療期間使用大劑量的在治療期間使用大劑量的-內酰胺內酰胺 類抗生素，可形成快泳動性的白蛋類抗生素，可形成快泳動性的白蛋 白成分，治療中斷即逐漸消失。白成分，治療中斷即逐漸消失。 先天性白蛋白缺陷型先天性白蛋白缺陷型 主要特征：由于血清白蛋白主要特征：由于血清白蛋白 的顯著降低，血清總蛋白也的顯著降低，血清總蛋白也 隨之降低，隨之降低，1、2球蛋白球蛋白