GB∕T 40171-2021 磁珠法DNA提取純化試劑盒檢測(cè)通則

?ICS07.080

CCSA40

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T40171—2021

磁珠法DNA提取純化試劑盒檢測(cè)通則

GeneralrulesfordeterminationofmagneticbeadDNAextractionand

purificationkit

2021-05-21發(fā)布

2021-12-01實(shí)施

GB/T40171—2021

本文件按照GB/T1.1—2020((標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。

本文件由全國(guó)生化檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC387)提出并歸口。

本文件起草單位：中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院生物研究所、蘇州白堊紀(jì)生物科技有限公司、成都海關(guān)技術(shù)中心、深圳華大智造科技股份有限公司、深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院、圣湘生物科技股份有限公司、邁克生物股份有限公司、四川大學(xué)、北京市理化分析測(cè)試中心、湖南圣維基因科技有限公司、蘇州新波生物技術(shù)有限公司。

本文件主要起草人：周李華、馬麗俠、林華、李懷平、蔣子敬、林霖、王逸叢、葉德萍、鄧中平、龍騰鑲、姜展樾、謝禮、曲峰、蔣慧、楊國(guó)武、龔華斐、安微、郭剛、張婧、戴立忠、杜美紅。

磁珠法DNA提取純化試劑盒檢測(cè)通則

1范圍

本文件規(guī)定了磁珠法DNA提取純化試劑盒檢測(cè)通則，描述了檢測(cè)原理、檢測(cè)前準(zhǔn)備，以及對(duì)磁珠法DNA提取純化試劑盒磁力學(xué)性質(zhì)、DNA提取純化、DNA濃度和純度、DNA得量、DNA完整性、磁珠吸附率、提取回收率、精密度的檢測(cè)方法以及檢測(cè)報(bào)告。

本文件適用于植物組織，動(dòng)物組織，血液、血斑、血凝塊、血漿等，唾液、精液、尿液、糞便等分泌物，細(xì)菌、病毒、真菌等生物樣本中的磁珠法DNA提取試劑盒的測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB5009.268食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測(cè)定

GB/T19077粒度分析激光衍射法

GB/T21649.1粒度分析圖像分析法第1部分:靜態(tài)圖像分析法

GB/T29022粒度分析動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)

GB/T34794瓊脂糖凝膠回收試劑盒測(cè)定通則

GB/T34796水溶液中核酸的濃度和純度檢測(cè)紫外分光光度法

SN/T2775商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

GB/T34794和GB/T34796界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

磁珠magneticbeads

一種表面經(jīng)過(guò)了功能化修飾，包被有生物活性基團(tuán)的功能化載體，在磁場(chǎng)中能夠迅速聚集，離開(kāi)磁場(chǎng)后又能快速分散，實(shí)現(xiàn)在不同條件下與核酸分子特異性高效結(jié)合和解離的具有超順磁性的一種磁性納米級(jí)或者微米級(jí)球狀或無(wú)定形顆粒物。

注1：其表面修飾有豐富的活性基團(tuán)，可以與核酸分子在一定的緩沖條件下進(jìn)行可逆地結(jié)合。 注2:與傳統(tǒng)的分離方法相比，磁珠用于生化樣品復(fù)雜組分的分離，能夠?qū)崿F(xiàn)分離和富集同時(shí)進(jìn)行.有效地提高了分離速度和富集效率，同時(shí)也使分析檢測(cè)的靈敏度大大提升。

注3:本文件中磁珠指生物分離磁珠。這類(lèi)磁珠具有超順磁性，可分散于基液中形成磁性液體材料，生物活性基團(tuán)可以與多種生物活性物質(zhì)發(fā)生偶聯(lián)，兼具有液體的流動(dòng)性和固體磁性顆粒材料的雙重特點(diǎn)，具有確定的粒徑范圍，有確定的表面特性，包括比表面積、表面修飾等。

3.2

磁珠吸附率adsorptionrateofmagneticbeads

一定條件下，磁珠吸附到的核酸占總核酸量的比例。

庫(kù)七七標(biāo)準(zhǔn)下載

GB/T40171—2021

3.3

磁響應(yīng)時(shí)間magneticresponsetime

DNA提取磁珠放置于磁力架或用磁棒磁吸附后，完全磁分離的時(shí)間。

3.4

樣本提取回收率recoveryrateforsampleextraction

樣本提取DNA的量與樣品中實(shí)際DNA量的比值。

3.5

得量yield

從單位質(zhì)量樣本中提取所得的DNA的量。

4縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

cfDNA：循環(huán)游離DNA(circulatingcell-freeDNA)

ctDNA:循環(huán)腫瘤DNACcirculatingtumorDNA)

DNA:脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)

OD:光密度(opticaldensity)

PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)

5原理

運(yùn)用納米技術(shù)對(duì)超順磁性納米顆粒的表面用氧化硅、羧基基團(tuán)、羥基基團(tuán)、多聚胸腺嘧啶重復(fù)寡核苷酸［Oligo(dT)］等修飾后.制備成為功能性超順磁性納米磁珠。利用納米磁珠的超順磁性，在離液鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場(chǎng)的作用下，從生物樣本中有效結(jié)合DNA，在低鹽或者水溶液狀態(tài)下與磁珠結(jié)合的DNA被可逆地洗脫下來(lái)，實(shí)現(xiàn)核酸的提取純化的目的。

6檢測(cè)前準(zhǔn)備

6.1樣品數(shù)量

采用至少3個(gè)不同批次的試劑盒，每一批次的試劑盒分別對(duì)20份待測(cè)樣品、20份加標(biāo)樣品進(jìn)行提取純化。加標(biāo)樣品的加標(biāo)濃度在試劑盒提供的濃度范圍。同時(shí)采用參考方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表示按照SN/T2775的規(guī)定執(zhí)行。

6.2提取樣品的選擇

用于試劑盒提取回收率檢測(cè)的生物樣品建議選擇參考樣品。加標(biāo)測(cè)試可選用在售的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考樣品，亦可采用已知提取效率的等效樣品。檢測(cè)時(shí)，根據(jù)不同試劑盒適用的樣本類(lèi)型采用不同的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或參考樣品進(jìn)行檢測(cè)。

注：本文件涉及的參考樣品指經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的研制流程，具有確定的一個(gè)或多個(gè)足夠均勻的特性值的材料，如動(dòng)物組織凍干粉，植物葉片、種子的凍干粉，參考血樣，假病毒等樣本。

6.3試劑盒外觀

試劑盒外包裝應(yīng)無(wú)破損，標(biāo)識(shí)清晰。試劑盒應(yīng)附說(shuō)明書(shū)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)檢查，內(nèi)容物應(yīng)齊全;磁珠懸浮液為黑色、棕色或者棕黃色懸濁液，其他組分應(yīng)符合說(shuō)明書(shū)描述。

6.4試劑盒裝量

試劑的裝量應(yīng)不少于試劑盒說(shuō)明書(shū)要求的量。

7檢測(cè)方法

7.1試樣預(yù)處理

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求執(zhí)行。

7.2磁力學(xué)性質(zhì)

試劑盒說(shuō)明書(shū)給出了磁珠磁力學(xué)性質(zhì)指標(biāo)的，按照附錄A進(jìn)行測(cè)定。

7.3磁珠法DNA提取純化

根據(jù)磁珠法DNA提取純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

7.4DNA濃度和純度檢測(cè)

7.4.1紫外吸收法（大量DNA檢測(cè)）

針對(duì)從動(dòng)物組織、植物組織、血液、血斑、血凝塊、唾液、口腔拭子、尿液、細(xì)菌等生物樣本中提取的DNA的濃度和純度檢測(cè)方法，按照GB/T34796的規(guī)定執(zhí)行。

檢測(cè)時(shí)建議調(diào)整OD26。吸收值在對(duì)應(yīng)的儀器要求范圍內(nèi),OD260/OD280比值會(huì)受pH影響較大，建議使用對(duì)應(yīng)的DNA洗脫液作為檢測(cè)溶劑，并設(shè)置空白對(duì)照。

7.4.2熒光法（微量DNA檢測(cè)）

見(jiàn)《中華人民共和國(guó)藥典》（四部,2020年版）。

7.4.3瓊脂糖電泳測(cè)量法

將待測(cè)DNA與已知濃度的DNA同時(shí)進(jìn)行電泳，根據(jù)結(jié)合的溴化乙錠熒光強(qiáng)度，估計(jì)其含量。根據(jù)電泳圖譜判斷DNA純度。

7.4.4實(shí)時(shí)熒光PCR法

根據(jù)待測(cè)DNA樣本選擇相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和引物探針序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)起始模板DNA濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)DNA的濃度。

7.4.5數(shù)字PCR法

采用數(shù)字PC.R方法對(duì)待測(cè)DNA樣本進(jìn)行定值，設(shè)置2個(gè)?3個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)置至少3個(gè)重復(fù)，根據(jù)數(shù)字PC.R結(jié)果，計(jì)算待測(cè)DNA濃度。

7.5DNA得量檢測(cè)

7.5.1基本原則

根據(jù)說(shuō)明書(shū)給出的提取樣本用量選取至少3個(gè)樣本用量梯度，需涵蓋最少用量和最多用量（如人新鮮血液試劑盒推薦用量為100mL~250pcL，選取梯度可為100/iL,200yL，250yL三個(gè)用量梯度），按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取，按照GB/T34796的規(guī)定計(jì)算得量，得出對(duì)應(yīng)樣本用量的得量范

圍。常用試劑盒樣本提取用量和得量見(jiàn)附錄B的表B.1。

7.5.2基因組DNA

針對(duì)從血液、血斑、血凝塊、血漿、唾液、口腔拭子、尿液、動(dòng)植物組織等生物樣本中提取的基因組DNA，使用微量紫外分光光度計(jì)，通過(guò)測(cè)量OD值進(jìn)行核酸得量檢測(cè)，具體要求和步驟按照GB/T34796的規(guī)定執(zhí)行。

7.5.3微量cfDNA或ctDNA

針對(duì)從血漿或血清樣本中提取的微量cfDNA或ctDNA,建議使用實(shí)時(shí)熒光計(jì)或生物芯片分析系統(tǒng)、微流控毛細(xì)管電泳系統(tǒng)，進(jìn)行核酸得量檢測(cè)。

7.5.4微量病毒DNA

針對(duì)從血漿、血清等生物樣本中提取的微量病毒DNA，采用實(shí)時(shí)熒光PCR法，通過(guò)檢測(cè)特定基因的Ct進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)，方法按照7.4.4進(jìn)行?；虿捎脭?shù)字PCR方法檢測(cè)樣本中DNA濃度，根據(jù)定值結(jié)果計(jì)算其DNA濃度，方法按照7.4.5。

7.6DNA完整性檢測(cè)

7.6.1檢測(cè)方法

DNA完整性檢測(cè)一般采用瓊脂糖凝膠電泳法、微流控芯片法或毛細(xì)管電泳分離法，也可參考其他方法進(jìn)行DNA完整性檢測(cè)。

病毒DNA、c￡DNA和ctDNA不建議進(jìn)行DNA完整性檢測(cè)。

7.6.2凝膠電泳法

取2?5提取后的基因組DNA樣品溶液與適量6X上樣緩沖液混合，在1%瓊脂糖凝膠中以3V/cm~5V/cm恒壓條件下電泳40mm.用凝膠成像系統(tǒng)觀察DNA條帶，要求所得DNA條帶單一、清晰、片段大小合適、無(wú)拖帶及明顯降解情況。

注：根據(jù)具體樣本調(diào)整電泳條件。

7.6.3微流控芯片或毛細(xì)管的電泳分離法

取10ngDNA樣本置于微流控芯片或毛細(xì)管的電泳中，根據(jù)儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因組DNA分析，查看DNA樣品中DNA片段的分布情況，對(duì)彌散的DNA進(jìn)行分析。

7.7磁珠吸附率

按照附錄A進(jìn)行測(cè)定。

7.8提取回收率測(cè)試

在適用的前提下，根據(jù)說(shuō)明書(shū)給出的得量，在相應(yīng)基質(zhì)中添加3個(gè)濃度水平的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（所添加的濃度范圍應(yīng)涵蓋高、中、低三個(gè)水平），按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取，每個(gè)添加水平重復(fù)提取7次，按照GB/T34796的規(guī)定計(jì)算得量，按式（1）計(jì)算提取回收率（Ph）。

從血漿和血清等樣本中提取的病毒DNA、c￡DNA和ctDNA等微量DNA產(chǎn)物，采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)Ct值。

Pb=—X100% （1）

mbl

式中：

Pb——回收率；

加入標(biāo)準(zhǔn)DNA的量，單位為微克（fxg）；

mb2—每個(gè)濃度水平提取得到的DNA量的平均值，單位為微克（yg）。

7.9精密度測(cè)定

7.9.1批內(nèi)精密度

在適用的前提下，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)使用同一批次3個(gè)試劑盒對(duì)參考樣品重復(fù)提取7次，根據(jù)式（2）計(jì)算批內(nèi)提取DNA得量的變異系數(shù)。

從血漿和血清等樣本中提取的病毒DNA.cfDNA和ctDNA等微量DNA產(chǎn)物，進(jìn)行批內(nèi)精密度測(cè)定時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)Ct，以Ct計(jì)算變異系數(shù)（CV）。

SD

CV=—X100% （2）

A

式中：

CV—提取DNA得量的變異系數(shù)；

SD7次提取DNA量的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

X——7次提取DNA量的平均值。

7.9.2批間精密度

在適用的前提下，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)使用3個(gè)不同批次試劑對(duì)參考品分別重復(fù)提取7次，根據(jù)式（2）計(jì)算批間提取DNA得量的變異系數(shù)。

從血漿和血清等樣本中提取的病毒DNA.cfDNA和ctDNA等微量DNA產(chǎn)物，進(jìn)行批間精度測(cè)定，采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)Ct,以Ct計(jì)算變異系數(shù)。

7.10參考結(jié)果

提取純化的DNA得量、純度、完整性和提取回收率等試劑盒提取產(chǎn)物檢測(cè)參考結(jié)果見(jiàn)附錄B。一般情況下，磁珠吸附率檢測(cè)以磁珠吸附率的變異系數(shù)表征，在使用有效期內(nèi)，參考結(jié)果見(jiàn)附錄C。采用添加一定濃度范圍的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)至樣品中進(jìn)行提取回收率測(cè)試，樣本提取回收率應(yīng)符合試劑盒生產(chǎn)商的規(guī)定，參考結(jié)果見(jiàn)附錄C。

8檢測(cè)報(bào)告

試劑盒出廠或經(jīng)測(cè)定后應(yīng)附檢測(cè)報(bào)告，或質(zhì)檢報(bào)告，或等同的指導(dǎo)性文件，文件格式見(jiàn)附錄D，文件內(nèi)容在適用的前提下，應(yīng)至少包括以下部分：

a） 試劑盒的應(yīng)用范圍：包括適用樣本及樣本的特殊說(shuō)明；

b） 得量；

c） 純度；

d） 完整性；

e） 提取回收率；

f） 批內(nèi)、批間精密度。

附錄A

（規(guī)范性）

試劑盒的磁力學(xué)性質(zhì)指標(biāo)測(cè)試

A.1粒徑大小及分布

A.1.1顯微圖像法

按GB/T21649.1的規(guī)定執(zhí)行.得到顯微圖像，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得出磁珠的平均粒徑（6/mean）和標(biāo)準(zhǔn)差（s）。

A.1.2激光粒度分析法

將磁珠分散在緩沖液中，超聲5min，振蕩混勻，粒徑大于1的磁珠按GB/T19077的規(guī)定執(zhí)行，粒徑小于1Mm的磁珠按GB/T29022的規(guī)定執(zhí)行，檢測(cè)得出磁珠的平均粒徑及分散指數(shù)

（PI）。

A.2磁響應(yīng)時(shí)間

將磁珠磁性分離進(jìn)行計(jì)時(shí)，記錄磁響應(yīng)時(shí)間。

A.3重分散性

將磁珠分散在緩沖液中，超聲（頻率40kHz,功率180W）5min，振蕩混勻，將此磁珠分散液于離心機(jī)上采用3000r/min速度離心3mm,加速沉淀，隨后渦旋振蕩30s，在已確定的吸收波長(zhǎng)下測(cè)試分散液的吸光度值（A、），重分散率（J\d）數(shù)值以％表示，按式（A.1）計(jì)算：

-Prd=-X100% （A.1）

^?0

式中：

Pri——重分散率；

Aj——離心后磁珠重懸液的吸光度；

Ao 磁珠分散液的吸光度。

A.4磁穩(wěn)定性

將磁珠分散在緩沖液（不含有鐵離子）中，超聲（頻率40kHz,功率180W）5mm,并在37°C下以200r/min振蕩5h，磁分離后取上清分散液，按GB5009.268中第二法規(guī)定檢測(cè)游離鐵離子濃度。磁珠不應(yīng)有鐵離子溶出。

A.5磁珠吸附率

在適用的前提下，使用磁珠對(duì)適量DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行吸附，重復(fù)7次，計(jì)算磁珠吸附DNA標(biāo)準(zhǔn)品后的量與吸附前的DNA標(biāo)準(zhǔn)品的量的百分比。

附錄B

（資料性）

磁珠法DNA提取試劑盒提取性能驗(yàn)證

磁珠法DNA提取試劑盒樣本的提取量、得量及純度參考結(jié)果見(jiàn)表B.1。

表B.1樣本提取量、得量及純度一覽表

樣本類(lèi)型

提取DNA類(lèi)型

樣本量

OD260/OD280

OD260/OD230

DNA得量

Mg

全血

基因組DNA

200卜L

1.6?2.1

1.5?2.5

2?6

基因組DNA

1mL

1.6?2.1

1.5?2.5

10?20

血斑

基因組DNA

3mmX3mm,1片?3片

1.6?2.1

0.8?2.0

0.5?3

血凝塊

基因組DNA

1mL

1.6?2.1

1.5?2.5

10?20

唾液

基因組DNA

200p.L

1.6?2.1

1.0?2.5

1?5

口腔拭子

基因組DNA

一支

1.6?2.1

1.0?2.5

1?5

尿液

基因組DNA

10mL?15mL原尿

1.6?2.1

1.0?2.5

0?10

組織（動(dòng)物/人）

基因組DNA

30mg?50mg

1.6?2.1

1.0?2.5

2?15

新鮮植物葉片

基因組DNA

50mg?80mg

1.7?2.1

1.5?2.5

8?40

血漿/血清

cfDNA、ctDNA

2mL

N/A

N/A

8