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文檔簡介
1、大腸菌群的定義大腸菌群的定義大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上的分類命名,而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的要求,提出的與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌,即作為食品、水體等是否受過人畜糞便污染的指示菌,這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進(jìn)一步的生化試驗(yàn),可將這群細(xì)菌再分為大腸艾希氏菌(俗稱大腸桿菌)、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。 大腸桿菌的定義大腸桿菌的定義大腸桿菌(也稱大腸埃希氏菌),分類于腸桿菌科,歸屬于埃希氏菌屬。大腸桿菌指革蘭氏陰性無芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗(yàn)(靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn))為+-或-
2、+-的細(xì)菌。與人類有關(guān)的大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌,包括五種:腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、致病性大腸桿菌(EPEC)、出血性大腸桿菌(EHEC)、侵襲性大腸桿菌(EIEC)、黏附性大腸桿菌(EAEC)。大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系衛(wèi)生學(xué)意義大腸菌群和大腸桿菌是評價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo),作為食品中的糞便污染指標(biāo)。食品中檢出大腸菌群,表明該食品有糞便污染,既可能有腸道致病菌存在,因而也就有可能通過污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低,表明了糞便污染的程度,也反映了對人體健康危害性的大小。大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道致病菌接近,它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的
3、存在,因此該菌是國際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測指示菌。近年來,有些國家在執(zhí)行HACCP管理中,將大腸桿菌檢測作為微生物污染狀況的監(jiān)測指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果的評估指標(biāo)。大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài): 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌,一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m,多單獨(dú)存在或成雙,但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛,但多數(shù)只有1-4根,一般不超過10根,故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛,有的有莢膜或微莢膜,不形成芽孢,對普通堿性染料著色良好,革蘭氏染色陰性。大腸桿菌的生物學(xué)特性培養(yǎng)特性:大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng),在含無機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37,在42-44 條件
4、下仍能生長,生長溫度范圍15-46 。l 在普通營養(yǎng)瓊脂上有3種菌落形態(tài): 1)光滑型:菌落邊緣整齊,表面有光澤、濕潤、 光滑、呈灰色,在生理鹽水中易分散; 2)粗糙型:菌落扁平、干澀、邊緣不整齊,易 在生理鹽水中自凝; 3)黏液型:常為含有莢膜的菌株。大腸菌群及大腸桿菌測定 MPN法檢驗(yàn)流程(FDA BAM) 檢樣50g+450ml稀釋液 適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液,每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯(每管9ml LST肉湯并加有導(dǎo)管),每管接種1mL 35 ,24 2h 48 2h 沒有產(chǎn)氣管 有產(chǎn)氣管 報(bào)告陰性 接種BGLB肉湯管 接種EC肉湯 35 ,48 2h 4
5、4.50.5 (水浴培養(yǎng)) 24 2h 48 2h 查MPN表報(bào)告結(jié)果 產(chǎn)氣管接種EMB平板(35、1824h) (大腸菌群) 從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜 面,進(jìn)行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接 種LST復(fù)檢產(chǎn)氣 查MPN表報(bào)告結(jié)果(大腸桿菌) 大腸菌群測定MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說明MPNMPN檢索表:檢索表: MPN 為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱。這種方法,對樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋,加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率,用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度,如改用不同的稀釋度,則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加1
6、0倍。初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn):初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn): 1)兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基不同,但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義,即“在37分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系,氯化鈉可維持滲透壓,月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長,這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵(Slow lactose fermentations)”來促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。 2)初發(fā)酵陽性管,不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌,經(jīng)過證實(shí)試驗(yàn)后,有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明,食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率,初發(fā)酵與證實(shí)
7、試驗(yàn)相差較大。因此,在實(shí)際檢測工作中,證實(shí)試驗(yàn)是必需的。產(chǎn)氣量與倒管:產(chǎn)氣量與倒管: 在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中,經(jīng)??梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡(有時(shí)比小米粒還?。?,有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明,大腸菌群的產(chǎn)氣量,多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體,少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時(shí),可以用手輕輕打動(dòng)試管,如有氣泡沿管壁上浮,即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生,而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。 大腸桿菌測定EMB選擇性分離鑒別EMB平板典型大腸桿菌菌落特征:中心黑色或紫紅色,有或無綠色金屬光澤大腸桿菌測定EMB選擇性分離鑒別EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基,一
8、些球菌也可在該培養(yǎng)基上生長;高壓滅菌可使得美藍(lán)還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)基可以恢復(fù)原有的正常紫色,傾注平板前應(yīng)先搖勻;大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤;該培養(yǎng)基受可見光易使其中的成分氧化,儲存及培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)都應(yīng)在避光條件。菌名菌落形態(tài)大腸埃希氏菌 紫黑色,有綠色金屬光澤肺炎克雷伯氏菌粉色,中心色深陰溝腸桿菌粉色,中心色深弗氏志賀氏菌無色鼠傷寒沙門氏菌 無色糞鏈球菌無色大腸桿菌測定革蘭氏染色基本原理: 革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細(xì)菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌兩大類。 革蘭氏染色的機(jī)理
9、主要是利用兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多的類脂質(zhì),而肽聚糖的含量較少。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時(shí),類脂質(zhì)被溶解,增加了細(xì)胞壁的通透性,使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出,結(jié)果細(xì)胞被脫色,經(jīng)復(fù)染后,又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大,類脂質(zhì)含量少,經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后,肽聚糖層的孔徑變小,通透性降低,因此細(xì)胞仍保留初染時(shí)的顏色。大腸桿菌測定革蘭氏染色基本步驟:將涂片在火焰上固定,滴加結(jié)晶紫染液,染1min,水洗;滴加革蘭氏碘液,作用1min,水洗;滴加95%乙醇脫色約1530s,直至染色液被洗掉,不要過分脫色,水洗;滴加番紅復(fù)染液,
10、復(fù)染1min,水洗、待干、鏡檢。結(jié)果:革蘭氏陽性菌呈,革蘭氏陰性菌呈。大腸桿菌測定生化鑒定Testpositivenegativebiotype1biotype2reagentIndole紅色環(huán)不變色+-KovacsMR紅色不變色+甲基紅V-P玫瑰紅色環(huán)不變色-V-P甲、乙液Citrate生長不生長-實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二大腸菌群的檢驗(yàn)大腸菌群的檢驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)食品中大腸菌群檢測程序、方法;、學(xué)習(xí)食品中大腸菌群檢測程序、方法;2、掌握食品中大腸菌群檢測結(jié)果的報(bào)告方式。、掌握食品中大腸菌群檢測結(jié)果的報(bào)告方式。二、實(shí)驗(yàn)材料二、實(shí)驗(yàn)材料1、設(shè)備和材料、設(shè)備和材料溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、
11、均質(zhì)器或乳缽、溫度計(jì)、溫箱、水浴鍋、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計(jì)、平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針2、培養(yǎng)基及試劑、培養(yǎng)基及試劑乳糖乳糖膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、膽鹽發(fā)酵管、乳糖發(fā)酵管、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑、麥康凱、伊紅美藍(lán)瓊脂(麥康凱、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、革蘭氏染色液)、革蘭氏染色液GB4789.3-2010 大腸菌群計(jì)數(shù)GB4789.3-2010 大腸菌群計(jì)數(shù)(一)最先準(zhǔn)備的器材(一)最先準(zhǔn)備的器材規(guī)格名稱 數(shù)量 用途1、500ml三角瓶 1個(gè) 稀釋樣品2、250ml三角瓶 1個(gè) 制EMB瓊脂3、18180mm試
12、管 9支 單料乳糖膽鹽發(fā)酵管4、18180mm試管 3支 稀釋樣品(9ml)5、1ml移液管 5 支6、10ml移液管 3 支7、直徑為90mm平皿 2套制EMB平板8、250ml量筒 1支9、玻璃珠:直徑約5mm(二)應(yīng)滅菌消毒的器材(二)應(yīng)滅菌消毒的器材剪刀1把不銹鋼藥匙1把 滴管膠頭5只稱量紙適量(三)應(yīng)制備的培養(yǎng)基(三)應(yīng)制備的培養(yǎng)基 培養(yǎng)基 總量 所用容器l蒸餾水 225ml 500ml三角瓶l蒸餾水 9ml/ 3支 27ml 18180mm試管(稀釋樣品)l乳糖膽鹽發(fā)酵管(單料): 10ml/ 9支 100ml18180mm試管(裝杜氏小管 )lEMB瓊脂: 1瓶 150ml 25
13、0ml三角瓶(每 組配一瓶)蛋白胨20g、膽鹽5g、乳糖10g、0.4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、蒸餾水1000ml(將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中,校正PH值至7.4,加入指示劑);或購買制好的乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、按說明配置。分裝試管,每管10ml,并放入一個(gè)到氣管(杜氏小管),高壓滅菌115、15分鐘。雙料乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基除蒸餾水外,其它成分加倍。乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基:乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基:P99A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯)肉湯A.1.1 成分成分胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g氯化鈉 5.0 g乳糖 5.0 g磷酸氫二鉀(K2HPO4) 2.75 g磷酸二
14、氫鉀(KH2PO4) 2.75 g月桂基硫酸鈉 0.1 g蒸餾水 1 000 mLpH 6.80.2A.1.2 制法制法將上述成分溶解于蒸餾水中,調(diào)節(jié) pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管10 mL。121 高壓滅菌15 min。A.2 A.2 煌綠乳糖膽鹽(煌綠乳糖膽鹽(BGLBBGLB)肉湯)肉湯A.2.1 A.2.1 成分成分蛋白胨 10.0 g乳糖 10.0 g牛膽粉(oxgall或oxbile)溶液 200 mL0.1%煌綠水溶液 13.3 mL蒸餾水 800 mLpH 7.20.1A.2.2 A.2.2 制法制法將蛋白胨、乳糖溶于約500 mL蒸餾水中,加入牛膽粉溶液200 mL
15、(將20.0 g脫水牛膽粉溶于200 mL蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH至7.07.5),用蒸餾水稀釋到975 mL,調(diào)節(jié)pH,再加入0.1%煌綠水溶液13.3 mL,用蒸餾水補(bǔ)足到1 000 mL,用棉花過濾后,分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管10 mL。121 高壓滅菌15 min。A.3 結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)A.3.1 成分蛋白胨 7.0 g酵母膏 3.0 g乳糖 10.0 g氯化鈉 5.0 g膽鹽或3號膽鹽 1.5 g中性紅 0.03 g結(jié)晶紫 0.002 g瓊脂 15 g18 g蒸餾水 1 000 mLpH 7.40.1A.3.2 制法將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分?jǐn)嚢?,調(diào)
16、節(jié)pH。煮沸2 min,將培養(yǎng)基冷卻至45 50 傾注平板。使用前臨時(shí)制備,不得超過3 h。 蛋白胨 10.0g 乳糖 10.0g 磷酸氫二鉀 2.0g 瓊脂 15.0g伊紅 0.4g美藍(lán)0.065g 或20ml 伊紅 (20g /L)和 10ml 美藍(lán)(6.5 g /L) 蒸餾水 1000.0mL最終pH7.10.2 (25) 先將蒸餾水中加入磷酸氫二鉀及蛋白胨、乳糖使之溶解,后加瓊脂加熱溶解,再調(diào)pH=7.2-7.4,再加入伊紅,美藍(lán)水溶液, 高壓滅菌115、15分鐘。 蛋白胨提供細(xì)菌生長發(fā)育所需的氮源、維生素和氨基酸,乳糖提供發(fā)酵所需的碳源,磷酸氫二鉀維持緩沖體系,伊紅Y和美藍(lán)抑制絕大部
17、分革蘭氏陽性菌的生長。瓊脂是凝固劑。 大腸桿菌在EMB上發(fā)酵乳糖,形成黑色菌落,大部分有金屬光澤。沙門氏菌形成無色菌落。金黃色葡萄球菌基本上不生長。 EMB(伊紅美藍(lán)瓊脂)(伊紅美藍(lán)瓊脂)質(zhì)控:質(zhì)控:此培養(yǎng)基呈紫色,可有細(xì)微沉淀。質(zhì)此培養(yǎng)基呈紫色,可有細(xì)微沉淀。質(zhì)控菌株接種后,控菌株接種后,3535培養(yǎng)培養(yǎng)18182424小時(shí),小時(shí),觀察結(jié)果應(yīng)如下表所示:觀察結(jié)果應(yīng)如下表所示:菌株 菌號 生長情況 菌落產(chǎn)氣腸桿菌 ATCC 13048 好 粉紅,無光澤大腸埃希氏菌 ATCC 25922 好,極好 有紫綠金屬光澤中心肺炎克雷伯氏菌 ATCC 13883 好 綠金屬光澤,有黑心奇異變形桿菌 ATC
18、C 25933 好,極好 無色鼠傷寒沙門氏菌 ATCC 14028 好,極好 無色金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 被抑制 說明:(1)伊紅又稱署紅或四溴熒光素,為酸性染料。美藍(lán)又稱亞甲藍(lán),為堿性染料。當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時(shí),細(xì)菌帶正電荷,染上紅色,再與美藍(lán)結(jié)合而形成紫黑色菌落,并有綠色金屬光澤。二者除了作為指示劑外,還有抑制格蘭氏陽性菌的作用。(2)在堿性環(huán)境中,不分解乳糖產(chǎn)酸的細(xì)菌不著色。伊紅、美藍(lán)不能結(jié)合,故沙門氏菌和志賀氏菌等為無色或琥珀色半透明菌落。(3)此培養(yǎng)基用于鑒別大腸桿菌及產(chǎn)氣桿菌,并可快速鑒定白色念珠菌及鑒定凝固酶陽性葡萄球菌。美國公共衛(wèi)生協(xié)會和美國細(xì)菌協(xié)會推薦,用于
19、增殖或鑒別大腸桿菌的檢查。但某些沙門氏菌、志賀氏菌可被抑制。培養(yǎng)基保存應(yīng)注意避光防止氧化。 樣品1.酸奶12.鮮奶3.水樣14.水樣25.水樣36.水樣47.水樣58.酸奶2A1組組 酸奶1 A2A2組組 水樣1 A3組組 水樣2 A4組組 水樣3 B1B1組組 鮮奶 B2B2組組 水樣4 B3B3組組 水樣5 B4組組 酸奶2 三、實(shí)驗(yàn)方法與三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟步驟1、采樣及稀釋、采樣及稀釋以無菌操作將檢樣以無菌操作將檢樣25g(或(或25ml)放于含有)放于含有225ml滅菌生理滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻
20、璃珠)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振搖或研磨做成珠)或滅菌乳缽內(nèi),經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無菌均質(zhì)器,以液。固體檢樣最好用無菌均質(zhì)器,以800r/min1000r/min的的速度處理速度處理1min,做成,做成1:10的稀釋液。的稀釋液。用用1ml滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1:10稀釋液稀釋液1ml,注入含有,注入含有9ml滅菌生滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖混勻,做成理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi),振搖混勻,做成1:100的稀釋的稀釋液,換用液,換用1支支1ml滅菌吸管,按上述操作依次作滅菌吸管,按上述操作依次作10倍遞增稀釋倍遞增稀釋液液2. 乳糖初發(fā)酵
21、試驗(yàn)乳糖初發(fā)酵試驗(yàn) 即通常所說的假定試驗(yàn)。其目的在于檢查樣品中有無發(fā)即通常所說的假定試驗(yàn)。其目的在于檢查樣品中有無發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細(xì)菌。酵乳糖產(chǎn)生氣體的細(xì)菌。 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi),接種量在將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi),接種量在1ml以上以上者,用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管;者,用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管;1ml及及1ml以下者,用單料乳糖以下者,用單料乳糖發(fā)酵管。每一個(gè)稀釋度接種發(fā)酵管。每一個(gè)稀釋度接種3管,置(管,置(361)0C溫箱內(nèi),培溫箱內(nèi),培養(yǎng)(養(yǎng)(242)h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣,則可報(bào)告,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣,則可報(bào)告為大腸菌群陰性,如有產(chǎn)生者,則按下列程續(xù)
22、進(jìn)行為大腸菌群陰性,如有產(chǎn)生者,則按下列程續(xù)進(jìn)行根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣品污染情況估計(jì),選擇三根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣品污染情況估計(jì),選擇三個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。管。也可直接用樣品接種。10, 100, 1000 倍稀釋(倍稀釋(-1,-2,-3)3.分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)(10倍稀釋倍稀釋) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂板或麥康凱瓊將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂板或麥康凱瓊脂平板上,置(脂平板上,置(361)0C溫箱內(nèi),培養(yǎng)溫箱內(nèi),培養(yǎng)18h24h,然后取出,然后取出,觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。4.乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 即通常所說的證實(shí)試驗(yàn),其目的在于證明從乳
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