儀器分析 第17章-HPLC

1、1第第1717章章 高效液相色譜法高效液相色譜法(HPLC)(HPLC)2HPLC High Performance Liquid Chromatography17.1 概概 述述17.2 高效液相色譜儀高效液相色譜儀17.3 高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相17.4 高效液相色譜法的主要類(lèi)型高效液相色譜法的主要類(lèi)型17.1 17.1 概述概述17.1.1 17.1.1 色譜法的提出色譜法的提出1906 Michael Tswett 研究植物色素分離研究植物色素分離1907 提出色譜法的概念提出色譜法的概念A(yù)+BA+BBAABtScolorchromatographyc

2、hromagraphein希臘語(yǔ)希臘語(yǔ)to write417.1.1 HPLC HPLC的發(fā)展歷史的發(fā)展歷史1941 Martin和和Synge提出液提出液-液色譜理論；液色譜理論；1952 James和和Martin發(fā)展了氣相色譜；發(fā)展了氣相色譜；1956 Van Deemter提出速率理論；提出速率理論；1967 Kirkland等研制高效液相色譜法；等研制高效液相色譜法；吸附柱色譜吸附柱色譜1906GC1950年代年代GC-MS1950年代末年代末HPLC1960年代年代毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電動(dòng)色譜等一系列新的色譜法毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電動(dòng)色譜等一系列新的色譜法1980年代中期年代中期HP1

3、100型高效液相色譜儀617.1.2 HPLC 17.1.2 HPLC 與與GCGC、經(jīng)典、經(jīng)典LCLC的比較的比較 氣相色譜（氣相色譜（GC）只適合分析在操作溫度）只適合分析在操作溫度下能氣化而不分解的有機(jī)化合物，僅占下能氣化而不分解的有機(jī)化合物，僅占15%，衍生后也只有不到，衍生后也只有不到20%。 GC不適用于高沸點(diǎn)、難揮發(fā)及熱不穩(wěn)定不適用于高沸點(diǎn)、難揮發(fā)及熱不穩(wěn)定化合物、離子性化合物、高聚物等?；衔?、離子性化合物、高聚物等。717.1.2 HPLC 17.1.2 HPLC 與與GCGC、經(jīng)典、經(jīng)典LCLC的比較的比較8HPLC：高效色譜柱、高壓泵、高靈敏檢測(cè)器高效色譜柱、高壓泵、高靈

4、敏檢測(cè)器17.1.2 HPLC 17.1.2 HPLC 與與GCGC、經(jīng)典、經(jīng)典LCLC的比較的比較經(jīng)典經(jīng)典LC：粒徑：粒徑150-200m m，流速，流速0.x ml/minml/min，分離時(shí)間數(shù)小時(shí)（依重力流動(dòng)），分離時(shí)間數(shù)小時(shí)（依重力流動(dòng)）917.1.3 17.1.3 現(xiàn)代高效液相色譜法的特點(diǎn)現(xiàn)代高效液相色譜法的特點(diǎn)：(1)(1)高效：高效：(2)(2)高壓：高壓：HPLCHPLC工作壓力高達(dá)工作壓力高達(dá)20MPa-30MPa20MPa-30MPa。(3)(3)高速：高速：分離一個(gè)樣品只需幾分鐘至幾十分鐘。分離一個(gè)樣品只需幾分鐘至幾十分鐘。(4)(4)高靈敏度：高靈敏度： 紫外檢測(cè)器的

5、檢測(cè)限可達(dá)紫外檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)10109 9g g， 熒光檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)熒光檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)10101111g g 。 一般一般GC的填充色譜柱是的填充色譜柱是數(shù)千塔板米，數(shù)千塔板米， 高效液相色譜法的塔板高效液相色譜法的塔板數(shù)可達(dá)約數(shù)可達(dá)約8萬(wàn)塔板萬(wàn)塔板/米，使分米，使分離效率大大提高。離效率大大提高。10 用用高壓輸液泵高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合同比例的混合溶劑溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的定相的色譜柱色譜柱，經(jīng)，經(jīng)進(jìn)樣閥進(jìn)樣閥注入待測(cè)注入待測(cè)樣品樣品，由流動(dòng)，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被相帶入

6、柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離分離后，依次進(jìn)入后，依次進(jìn)入檢測(cè)器檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析分析的方法的方法稱(chēng)為高效液相色譜法稱(chēng)為高效液相色譜法 （high performance liquid chromatography, HPLC)。17.1.3 HPLC 17.1.3 HPLC 定義定義11高效液相色譜法高效液相色譜法的的優(yōu)點(diǎn)是優(yōu)點(diǎn)是： 其其缺點(diǎn)是缺點(diǎn)是：價(jià)格昂貴，要用各種填料柱，容量：價(jià)格昂貴，要用各種填料柱，容量小，流動(dòng)相消耗大且有毒性的居多。小，流動(dòng)相消耗大且有毒性的居多。17.1.3 17.1.3 高效液相色譜法的優(yōu)、缺點(diǎn)高效液相色譜法的優(yōu)、缺點(diǎn) 檢

7、測(cè)的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重檢測(cè)的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣。復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣。 適用于分析適用于分析高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、具有生高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、具有生物活性、熱穩(wěn)定性差物活性、熱穩(wěn)定性差的化合物。的化合物。1217.1.4 17.1.4 高效液相色譜法理論基礎(chǔ)高效液相色譜法理論基礎(chǔ) 液相色譜所用基本概念：保留值、液相色譜所用基本概念：保留值、塔板數(shù)、塔板高度、分離度、選擇性塔板數(shù)、塔板高度、分離度、選擇性等與氣相色譜一致。液相色譜所用基等與氣相色譜一致。液相色譜所用基本理論：塔板理論與速率方程也與氣本理論：塔板理論與速率方程

8、也與氣相色譜基本一致。相色譜基本一致。13 n 為色譜柱的理論塔為色譜柱的理論塔板數(shù)。板數(shù)。 因?yàn)橐驗(yàn)閠R是熱力學(xué)是熱力學(xué)常數(shù)，當(dāng)色譜柱的長(zhǎng)度常數(shù)，當(dāng)色譜柱的長(zhǎng)度一定，理論板數(shù)目一定，理論板數(shù)目n越大，越大，色譜峰越窄。色譜峰越窄。17.1.4 液相色譜的塔板理論液相色譜的塔板理論2212254516)(.)()(/WtWttnRbRR=2212254516)(.)()(/WtWttnRbRReff=14式中式中 u 流動(dòng)相流動(dòng)的線速度流動(dòng)相流動(dòng)的線速度液相色譜的速率方程：液相色譜的速率方程：17.1.4 液相色譜的速率理論液相色譜的速率理論 u Cu BAH+=15液相色譜的速率方程為：液相

9、色譜的速率方程為：D 為擴(kuò)散系數(shù)，為擴(kuò)散系數(shù)，Cd、 C為有關(guān)項(xiàng)的板高系數(shù)，為有關(guān)項(xiàng)的板高系數(shù)，dp 和和 df 為填充粒子直徑和固定液膜的厚度為填充粒子直徑和固定液膜的厚度17.1.4 液相色譜的速率理論液相色譜的速率理論1617.1.4 液相色譜的速率理論液相色譜的速率理論Hd 2p 當(dāng)粒度從當(dāng)粒度從45m m降至降至6m m時(shí)時(shí),板高板高要降低要降低10倍。倍。17二二、液相色譜的速率理論、液相色譜的速率理論Hd 2p 當(dāng)粒度從當(dāng)粒度從45m降至降至6m時(shí)時(shí),板板高要降低高要降低10倍。倍。18提高柱效提高柱效的方法的方法(降低板高降低板高)： 固定相填料要均一，顆粒細(xì)，裝填均勻。固定相

10、填料要均一，顆粒細(xì)，裝填均勻。 流動(dòng)相粘度低。流動(dòng)相粘度低。 低流速。低流速。 適當(dāng)升高柱溫。適當(dāng)升高柱溫。17.1.4 液相色譜的速率理論液相色譜的速率理論液相色譜速率方程，指出了提高柱效率的途徑。液相色譜速率方程，指出了提高柱效率的途徑。1917.1.5 色譜分離的過(guò)程色譜分離的過(guò)程2017.1.6 樣品分子在色譜柱中的分離過(guò)程樣品分子在色譜柱中的分離過(guò)程2117.1.6 17.1.6 色譜分離的實(shí)質(zhì)色譜分離的實(shí)質(zhì)2217.1.7 17.1.7 高效液相色譜法的分離機(jī)理及分類(lèi)高效液相色譜法的分離機(jī)理及分類(lèi)吸附色譜吸附色譜分配色譜分配色譜尺寸排斥色譜尺寸排斥色譜離子交換色譜離子交換色譜吸附能

11、，氫鍵吸附能，氫鍵疏水分配作用疏水分配作用溶質(zhì)分子大小溶質(zhì)分子大小庫(kù)侖力庫(kù)侖力 類(lèi)類(lèi) 型型 主要分離機(jī)理主要分離機(jī)理 所用固定相所用固定相化學(xué)鍵和固定相化學(xué)鍵和固定相 多孔凝膠多孔凝膠 離子交換劑離子交換劑吸附劑（氧化鋁）吸附劑（氧化鋁）2317.1.7 17.1.7 高效液相色譜法的分離機(jī)理及分類(lèi)高效液相色譜法的分離機(jī)理及分類(lèi) 液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學(xué)液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹(shù)脂或多孔性凝膠；流動(dòng)相膜）、離子交換樹(shù)脂或多孔性凝膠；流動(dòng)相是各種溶劑。被分離混合物由流動(dòng)相液體推是各種溶劑

12、。被分離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色譜柱。根據(jù)動(dòng)進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分各組分在在固定相固定相及及流動(dòng)流動(dòng)相相中的中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或或分子尺寸大小分子尺寸大小的的差異進(jìn)行分離差異進(jìn)行分離。 2417.1.7 離子交換色譜離子交換色譜 (Ion-exchange chromatography) 的分離原理的分離原理25高效液相色譜的應(yīng)用：高效液相色譜的應(yīng)用： 醫(yī)藥衛(wèi)生、醫(yī)藥衛(wèi)生、 食品食品、 人體化學(xué)成分、人體化學(xué)成分、各類(lèi)合成藥物成分、各類(lèi)合成藥物成分、各種天然植物和動(dòng)物各種天然植物和動(dòng)物藥物化學(xué)成分。藥物化學(xué)成分。17.1.8 17.1.8

13、高效液相色譜法的應(yīng)用高效液相色譜法的應(yīng)用26高效液相色譜的應(yīng)用：高效液相色譜的應(yīng)用： 醫(yī)藥衛(wèi)生、醫(yī)藥衛(wèi)生、 食品、食品、 環(huán)保環(huán)保 等各個(gè)領(lǐng)域最為重要的分離分析技術(shù)。等各個(gè)領(lǐng)域最為重要的分離分析技術(shù)。17.1.8 17.1.8 高效液相色譜法的應(yīng)用高效液相色譜法的應(yīng)用 有機(jī)酸、氨基酸、糖、維有機(jī)酸、氨基酸、糖、維生素、脂肪酸、香料、甜味生素、脂肪酸、香料、甜味劑、防腐劑、人工色素、病劑、防腐劑、人工色素、病原微生物、霉菌毒素等。原微生物、霉菌毒素等。2717.1.6 17.1.6 高效液相色譜法的應(yīng)用高效液相色譜法的應(yīng)用2817.1.6 17.1.6 高效液相色譜法的應(yīng)用高效液相色譜法的應(yīng)用2

14、9色譜圖色譜圖2: 2: 高良姜色譜圖高良姜色譜圖 1 diarylheptanoid A diarylheptanoid A 2 2 高良姜素高良姜素 3 diarylheptanoid B3 diarylheptanoid B31小結(jié)小結(jié) 用用高壓輸液泵高壓輸液泵將具有不同極性的單一將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相流動(dòng)相泵入裝有固定相的泵入裝有固定相的色譜柱色譜柱，經(jīng)進(jìn)，經(jīng)進(jìn)樣閥注入樣閥注入待測(cè)樣品待測(cè)樣品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)在柱內(nèi)各成分被分離各成分被分離后，依次進(jìn)入后，依次進(jìn)入檢測(cè)檢測(cè)器器進(jìn)行檢測(cè)，從而

15、實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析的進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析的方法稱(chēng)為方法稱(chēng)為高效液相色譜法高效液相色譜法。3217.2 高效液相色譜儀高效液相色譜儀33tSHPLC：高效色譜柱、高壓泵、高靈敏檢測(cè)器：高效色譜柱、高壓泵、高靈敏檢測(cè)器HPLC: High Performance Liquid Chromatography3417.2 17.2 高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)進(jìn)樣器進(jìn)樣器貯貯液液器器高壓泵高壓泵梯度梯度洗脫裝置洗脫裝置色譜柱色譜柱餾分餾分收集器收集器檢測(cè)器檢測(cè)器記錄儀記錄儀高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖353617.2 17.2 高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)進(jìn)

16、樣器進(jìn)樣器貯貯液液器器高壓泵高壓泵梯度梯度洗脫裝置洗脫裝置色譜柱色譜柱餾分餾分收集器收集器檢測(cè)器檢測(cè)器記錄儀記錄儀高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)3717.2 高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)17.2.1 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)17.2.2 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)17.2.3 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)17.2.4 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)3817.2 17.2 高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)17.2.1 輸液系統(tǒng)輸液系統(tǒng)高壓輸液泵高壓輸液泵在線脫氣裝置在線脫氣裝置梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置3917.2.1 高壓輸液泵高壓輸液泵 作用：

17、將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸作用：將流動(dòng)相以穩(wěn)定的流速或壓力輸 送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系送到色譜系統(tǒng)。輸液泵的穩(wěn)定性直接關(guān)系到分析結(jié)果的到分析結(jié)果的重復(fù)性重復(fù)性和和準(zhǔn)確性準(zhǔn)確性。40在線脫氣、超聲脫氣、真空脫氣等在線脫氣、超聲脫氣、真空脫氣等作用：脫去流動(dòng)相中的溶解氣體。流動(dòng)相先作用：脫去流動(dòng)相中的溶解氣體。流動(dòng)相先 經(jīng)過(guò)脫氣裝置再輸送到色譜柱。經(jīng)過(guò)脫氣裝置再輸送到色譜柱。 脫氣不好時(shí)有氣泡，導(dǎo)致流動(dòng)相流速脫氣不好時(shí)有氣泡，導(dǎo)致流動(dòng)相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加。不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加。 O2, N2, CO217.2.1 在線脫氣裝置在線脫氣裝置17.2.1 梯度洗

18、脫裝置梯度洗脫裝置Isocratic elution 恒定組成的單一溶劑體系恒定組成的單一溶劑體系Gradient elution 以一定速度改變多種溶劑的以一定速度改變多種溶劑的配比淋洗，目的是分離多組配比淋洗，目的是分離多組容量因子相差較大的組分。容量因子相差較大的組分。High-Pressure Mixing4217.2.2 17.2.2 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)1 1 自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)4317.2.2 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng) 2 2 高壓定量進(jìn)樣閥高壓定量進(jìn)樣閥( (六通閥六通閥) )優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣量的可變范圍大，耐高壓，優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣量的可變范圍大，耐高壓， 易于自動(dòng)化易于自動(dòng)化缺點(diǎn)：容易造成色譜

19、峰擴(kuò)張缺點(diǎn)：容易造成色譜峰擴(kuò)張4417.2.2 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)4517.2.2 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)六通閥六通閥4617.2.3 分離系統(tǒng)分離系統(tǒng)： 色譜柱色譜柱常用內(nèi)壁拋光過(guò)的不銹鋼制成常用內(nèi)壁拋光過(guò)的不銹鋼制成顆粒直徑早期大（顆粒直徑早期大（2075m），柱管徑），柱管徑一般為一般為2mm，柱長(zhǎng)為，柱長(zhǎng)為50100cm.近年來(lái)，用高效微型填料（近年來(lái)，用高效微型填料（310m）管）管徑為徑為45mm，長(zhǎng)為，長(zhǎng)為10cm50cm的直形的直形不銹鋼柱。不銹鋼柱。 每米柱效可達(dá)每米柱效可達(dá)8萬(wàn)塔板數(shù)萬(wàn)塔板數(shù)47色譜柱色譜柱17.2.3 分離系統(tǒng)：分離系統(tǒng)： 色譜柱色譜柱48色譜柱色譜柱 色譜柱是實(shí)

20、現(xiàn)分離的核心部件。要求柱效色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件。要求柱效高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、高、柱容量大和性能穩(wěn)定。柱性能與柱結(jié)構(gòu)、填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。填料特性、填充質(zhì)量和使用條件有關(guān)。 17.2.3 分離系統(tǒng)：分離系統(tǒng)： 色譜柱色譜柱49spherical and irregular silica particles Macroporous spherical silica particle. K.K.Unger, Porous silica, Elsevier, 1979 基質(zhì)：載體或擔(dān)體。數(shù)基質(zhì)：載體或擔(dān)體。數(shù) m m數(shù)十?dāng)?shù)十 m m，球形。，球形。 硅膠或有機(jī)高

21、分子聚合物硅膠或有機(jī)高分子聚合物17.2.3 分離系統(tǒng)：分離系統(tǒng)： 色譜柱填料色譜柱填料5017.2.4 檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)溶質(zhì)性檢測(cè)器有：紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)溶質(zhì)性檢測(cè)器有：紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等器等總體檢測(cè)器有：示差折光、介電常數(shù)檢測(cè)器總體檢測(cè)器有：示差折光、介電常數(shù)檢測(cè)器等等 靈敏度高、噪音低、線性靈敏度高、噪音低、線性范圍寬、響應(yīng)快，死體積小、范圍寬、響應(yīng)快，死體積小、定量準(zhǔn)確、適應(yīng)范圍廣等特定量準(zhǔn)確、適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)，同時(shí)還應(yīng)該對(duì)溫度和載點(diǎn)，同時(shí)還應(yīng)該對(duì)溫度和載液流速的變化不敏感。液流速的變化不敏感。檢測(cè)器應(yīng)具有：檢測(cè)器應(yīng)具有：5117.2.4 紫外紫外- -可見(jiàn)檢測(cè)器可見(jiàn)檢測(cè)器

22、光源光源檢測(cè)室檢測(cè)室光柵光柵二極管陣列二極管陣列檢測(cè)檢測(cè)UV detector cell內(nèi)容積：內(nèi)容積：1-10 l光路長(zhǎng)：光路長(zhǎng)：2-10mm5217.2.4 熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器特點(diǎn)：特點(diǎn)： 有非常高的靈敏度和良好的選擇性，有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測(cè)法高靈敏度要比紫外檢測(cè)法高23個(gè)數(shù)量級(jí)，個(gè)數(shù)量級(jí)，特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析。特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析。17.2.4 熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器5417.2.4 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 計(jì)算機(jī)進(jìn)行峰面積的積分、分析結(jié)果計(jì)算機(jī)進(jìn)行峰面積的積分、分析結(jié)果的計(jì)算、誤差的分析或色譜圖的輸出，的計(jì)算、誤差的分析或色譜圖的輸出

23、，記錄的信號(hào)進(jìn)行程序化、自動(dòng)化處理。記錄的信號(hào)進(jìn)行程序化、自動(dòng)化處理。17.2 Main stages of HPLC analysisPrepare Sampleinject into column elute with mobile phasedetect sample componentsidentify and quantify5617.2 17.2 高效液相色譜儀的工作流程高效液相色譜儀的工作流程進(jìn)樣器進(jìn)樣器貯貯液液器器高壓泵高壓泵梯度梯度洗脫裝置洗脫裝置色譜柱色譜柱餾分餾分收集器收集器檢測(cè)器檢測(cè)器記錄儀記錄儀高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖5717.2 17.2 高

24、效液相色譜儀的工作流程高效液相色譜儀的工作流程進(jìn)樣器進(jìn)樣器貯貯液液器器高壓泵高壓泵梯度梯度洗脫裝置洗脫裝置色譜柱色譜柱餾分餾分收集器收集器檢測(cè)器檢測(cè)器記錄儀記錄儀高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖5817.2 17.2 高效液相色譜儀的工作流程高效液相色譜儀的工作流程進(jìn)樣器進(jìn)樣器貯貯液液器器高壓泵高壓泵梯度梯度洗脫裝置洗脫裝置色譜柱色譜柱餾分餾分收集器收集器檢測(cè)器檢測(cè)器記錄儀記錄儀高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖17.2 17.2 高效液相色譜儀的工作流程高效液相色譜儀的工作流程進(jìn)樣器進(jìn)樣器貯貯液液器器高壓泵高壓泵梯度梯度洗脫裝置洗脫裝置色譜柱色譜柱餾分餾分收集器

25、收集器檢測(cè)器檢測(cè)器記錄儀記錄儀高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)示意圖tS60南京市兒童醫(yī)院，徐進(jìn)，兒科藥學(xué)雜，南京市兒童醫(yī)院，徐進(jìn)，兒科藥學(xué)雜，1999年第年第5卷第卷第2期色譜條件期色譜條件色譜條件色譜條件 :島津島津LC10A D高效液相色譜儀；高效液相色譜儀；RF一一l0AxL熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器，熒光激發(fā)波長(zhǎng)，熒光激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)430nm; LD一一I0A泵，泵，分析柱為分析柱為Spherisorb ODS 5m, 200 x 4. 6mm,預(yù)柱為預(yù)柱為Waters ODS柱，柱，室溫室溫;流動(dòng)相流動(dòng)相為為0. 05mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液(p

26、H=4. 0 ):乙乙腈腈(78:22 v/v)，內(nèi)含，內(nèi)含0. 05mol/L戊磺酸鈉，戊磺酸鈉，流速流速為為1 ml/min17.2 HPLC17.2 HPLC法測(cè)定人血漿中氨芐青霉素濃度法測(cè)定人血漿中氨芐青霉素濃度61樣品分離良好，保留樣品分離良好，保留時(shí)間為時(shí)間為7. 3分鐘分鐘 62取含有氨芐青霉素的血漿取含有氨芐青霉素的血漿0. 2m1.加人加人10%三氯醋三氯醋酸酸0. 2m1，渦旋振蕩混勻，渦旋振蕩混勻，12000r/min離心離心10min，取上清液，取上清液0. 2m1于安瓿中，再加人于安瓿中，再加人0. 5mol/L鹽酸鹽酸0. 2m1，密封安瓿后置，密封安瓿后置100水

27、浴水浴90min，冷卻后再加人蒸餾水，冷卻后再加人蒸餾水0. 2m1,渦旋振蕩渦旋振蕩混勻后，進(jìn)樣混勻后，進(jìn)樣20微升測(cè)定。以外標(biāo)法峰面積定微升測(cè)定。以外標(biāo)法峰面積定量。量。 血樣處理方法血樣處理方法6317.417.4 高效液相色譜法的主要類(lèi)型高效液相色譜法的主要類(lèi)型17.4.1 17.4.1 分配色譜分配色譜17.4.217.4.2 液固（吸附）色譜液固（吸附）色譜17.4.317.4.3 離子交換色譜離子交換色譜17.4.4 17.4.4 尺寸排阻色譜尺寸排阻色譜6417.4.1 分配色譜分配色譜partition chromatography 樣品分子樣品分子在在流動(dòng)相流動(dòng)相和和固定相

28、固定相間的間的溶解度不同溶解度不同（分配作用）而實(shí)現(xiàn)分離的液相色譜分離模式（分配作用）而實(shí)現(xiàn)分離的液相色譜分離模式液液-液分配色譜：固定液易流失（物理吸附）液分配色譜：固定液易流失（物理吸附） liquid-liquid鍵合相色譜：化學(xué)鍵鍵合相色譜：化學(xué)鍵 bonded phase6517.4.1 分配色譜分配色譜partition chromatography K=CS/CM66分配色譜的分離原理分配色譜的分離原理 分配色譜是利用樣品中的分配色譜是利用樣品中的溶質(zhì)溶質(zhì)在在固定相固定相和和流動(dòng)相流動(dòng)相之間之間分配系數(shù)分配系數(shù)的不同，的不同，進(jìn)行連續(xù)的無(wú)數(shù)次的交換和分配而達(dá)到進(jìn)行連續(xù)的無(wú)數(shù)次的交

29、換和分配而達(dá)到分離的過(guò)程。分離的過(guò)程。 67OHOHOHOOO+ C18H37SiCl3SiC18H3717.4.1 分配色譜分配色譜一、化學(xué)鍵合固定相一、化學(xué)鍵合固定相68非極性鍵合固定相非極性鍵合固定相： 鍵合在載體表面的鍵合在載體表面的功功能分子能分子是烷基（是烷基（C8和和C18） 、苯基等非極、苯基等非極性有機(jī)分子。（極性很小）性有機(jī)分子。（極性很?。O性鍵合固定相極性鍵合固定相： 鍵合在載體表面的鍵合在載體表面的功能功能分子分子是具有丙氨基、二醇基、氰乙基、氨是具有丙氨基、二醇基、氰乙基、氨基等極性基團(tuán)的有機(jī)分子?；葮O性基團(tuán)的有機(jī)分子。17.4.1 分配色譜分配色譜一、化學(xué)鍵合固

30、定相一、化學(xué)鍵合固定相如最常用的如最常用的ODS（Octa-decyltrichloro Silane）柱）柱或或C18柱就是最典型的代柱就是最典型的代表，其極性很小。表，其極性很小。69二、固定相和流動(dòng)相的選擇二、固定相和流動(dòng)相的選擇1. 各種分析物質(zhì)各種分析物質(zhì)功能基功能基的極性按下列順序的極性按下列順序增加：增加：烷烴烷烴醚酯酮醛酰胺胺醇，醚酯酮醛酰胺胺醇，水的極性最大。水的極性最大。液相色譜中常用流動(dòng)相的性質(zhì)（表液相色譜中常用流動(dòng)相的性質(zhì)（表17-2）17.4.1 分配色譜分配色譜70二、固定相和流動(dòng)相的選擇二、固定相和流動(dòng)相的選擇17.4.1 分配色譜分配色譜2. 反相反相HPLC（

31、reversed phase HPLC）：）： 非極性固定相：非極性固定相： 如如ODS柱或柱或C18柱等柱等極性流動(dòng)相：極性流動(dòng)相： 如水、甲醇、乙腈等如水、甲醇、乙腈等3. 正相正相HPLC（normal phase HPLC）：）： 極性固定相：極性固定相：如氰乙基、氨基等如氰乙基、氨基等非極性（或弱極性）流動(dòng)相非極性（或弱極性）流動(dòng)相 ：如正己烷等如正己烷等714. 選擇色譜柱類(lèi)型的方式：選擇色譜柱類(lèi)型的方式：第一，固定相的極性與分析物質(zhì)的極性第一，固定相的極性與分析物質(zhì)的極性粗略粗略匹配匹配，用極性，用極性明顯不同明顯不同的流動(dòng)相洗脫；的流動(dòng)相洗脫；第二，流動(dòng)相的極性與分析物質(zhì)的極性

32、相匹第二，流動(dòng)相的極性與分析物質(zhì)的極性相匹配，用極性明顯不同的固定相；配，用極性明顯不同的固定相；第三，固定相與分析物質(zhì)的極性極為相似第三，固定相與分析物質(zhì)的極性極為相似 ，僅由流動(dòng)相極性差異使分析物質(zhì)沿柱移動(dòng)。僅由流動(dòng)相極性差異使分析物質(zhì)沿柱移動(dòng)。17.4.1 分配色譜分配色譜二、固定相和流動(dòng)相的選擇二、固定相和流動(dòng)相的選擇72二、固定相和流動(dòng)相的選擇二、固定相和流動(dòng)相的選擇5. 改善分辨率有三個(gè)途徑：即改變改善分辨率有三個(gè)途徑：即改變17.4.1 分配色譜分配色譜7317.4.1 分配色譜分配色譜a =tR2tR1a =tR2tR1tRtM? =二、固定相和流動(dòng)相的選擇二、固定相和流動(dòng)相的

33、選擇7441%CH3CN59%H2OK=5反相反相HPLC分離甾族化合物分離甾族化合物C8柱柱UV254nm檢測(cè)器檢測(cè)器P1=41%5.8 + 59%10.2 = 8.396P2=30%5.8 + 70%10.2 = 8.8817.4.1 分配色譜分配色譜75反相反相HPLC分離甾族化合物分離甾族化合物41%CH3CN59%H2OK=530%CH3CN70%H2OK=10 固定一個(gè)合適的固定一個(gè)合適的 值，增加兩組分的值，增加兩組分的選擇因子選擇因子 ，即改變流動(dòng)相的化學(xué)性質(zhì)。，即改變流動(dòng)相的化學(xué)性質(zhì)。17.4.1 分配色譜分配色譜7641%CH3OH59%H2OK=1021%THF79%H2

34、OK=1011%CH3CN12%THF77%H2OK=10C8柱柱UV檢測(cè)器檢測(cè)器17.4.1 分配色譜分配色譜反相反相HPLC分離甾族化合物分離甾族化合物771. Retention mechanism 反相鍵合相色譜的保留機(jī)制：反相鍵合相色譜的保留機(jī)制：疏溶劑作用理論疏溶劑作用理論 （1）樣品分子在固定相上保留；）樣品分子在固定相上保留； （2） 被分離物離開(kāi)固定相，減小保留。被分離物離開(kāi)固定相，減小保留。 兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。留行為。 在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，在反相鍵合相色譜中，極性大的組分先流出，極性小的后

35、流出。正相色譜則相反。極性小的后流出。正相色譜則相反。17.4.1 分配色譜分配色譜三、三、反相鍵合相色譜的保留機(jī)制反相鍵合相色譜的保留機(jī)制 樣品分子（如苯甲酸）樣品分子（如苯甲酸）中的中的非極性部分非極性部分與固定相與固定相表面上的表面上的疏水烷基疏水烷基之間產(chǎn)之間產(chǎn)生締合作用，使它在固定生締合作用，使它在固定相上保留；相上保留； 被分離物的被分離物的極性部分極性部分受到受到極性流動(dòng)相極性流動(dòng)相的的作用，使它離作用，使它離開(kāi)固定相，減開(kāi)固定相，減小保留。小保留。78min05101520253035mAU050100150200250300 DAD1 D, Sig=360,16 Ref=of

36、f (D:CHEM322DATAZJH00025.D)min05101520253035mAU050100150200250300350 DAD1 D, Sig=360,16 Ref=off (D:CHEM322DATAZJH00029.D)123456789101112131417.4.1 17.4.1 反相高效液相色譜法的應(yīng)用反相高效液相色譜法的應(yīng)用7917.4.1 17.4.1 反相高效液相色譜法的應(yīng)用反相高效液相色譜法的應(yīng)用min05101520253035mAU050100150200250300 DAD1 D, Sig=360,16 Ref=off (D:CHEM322DATAZJ

37、H00025.D)min05101520253035mAU050100150200250300350 DAD1 D, Sig=360,16 Ref=off (D:CHEM322DATAZJH00029.D)1234567891011121314nm220240260280300320340360380mAU50100150200250*DAD1, 18.819 (252 mAU, - ) Ref=17.459 & 19.925 屬于 00023.Dnm220240260280300320340360380mAU200300400500600*DAD1, 34.759 (486 mAU, - )

38、 Ref=34.279 & 39.492 屬于 00023.D8017.4.1 17.4.1 反相高效液相色譜法的應(yīng)用反相高效液相色譜法的應(yīng)用nm220240260280300320340360380mAU50100150200250*DAD1, 18.819 (252 mAU, - ) Ref=17.459 & 19.925 屬于 00023.Dnm220240260280300320340360380mAU200300400500600*DAD1, 34.759 (486 mAU, - ) Ref=34.279 & 39.492 屬于 00023.D81小結(jié)小結(jié)1.高效液相色譜儀的工作流程

39、？高效液相色譜儀的工作流程？2.分配色譜固定相和流動(dòng)相選擇的原則？分配色譜固定相和流動(dòng)相選擇的原則？8217.417.4 高效液相色譜法的主要類(lèi)高效液相色譜法的主要類(lèi)型型17.4.2 液固（吸附）色譜液固（吸附）色譜17.4.3 離子交換色譜離子交換色譜17.4.4 尺寸排阻色譜尺寸排阻色譜17.4.5 分離方法的選擇分離方法的選擇8317.4.2 液固（吸附）色譜液固（吸附）色譜基于基于被測(cè)組分被測(cè)組分在在固定相表面具有固定相表面具有吸附作用吸附作用，且各，且各組分的吸附能力組分的吸附能力不同，使組分在不同，使組分在固定相中產(chǎn)生保固定相中產(chǎn)生保留和實(shí)現(xiàn)分離。留和實(shí)現(xiàn)分離。84一、固定相一、固

40、定相 固定相是固定相是固體吸附劑固體吸附劑，吸附劑：一些多孔，吸附劑：一些多孔的固體顆粒物質(zhì)，其表面常存在的的固體顆粒物質(zhì)，其表面常存在的吸附點(diǎn)吸附點(diǎn)。 在液固高效液相色譜中，常用的固定相是在液固高效液相色譜中，常用的固定相是硅膠硅膠和和氧化鋁氧化鋁。如表。如表21-5所示所示。它們對(duì)試樣的保留時(shí)間順序大致如下：它們對(duì)試樣的保留時(shí)間順序大致如下：酯醛酯醛酮醇酮醇胺砜亞砜酰胺羧酸胺砜亞砜酰胺羧酸17.4.2 液固（吸附）色譜液固（吸附）色譜8517.4.2 液固（吸附）色譜液固（吸附）色譜86二、保留機(jī)制二、保留機(jī)制 流動(dòng)相中的流動(dòng)相中的溶質(zhì)分子溶質(zhì)分子X(jué)(液相液相)被流動(dòng)相被流動(dòng)相M帶帶入色譜

41、柱后，在隨載液流動(dòng)的過(guò)程中，發(fā)生如入色譜柱后，在隨載液流動(dòng)的過(guò)程中，發(fā)生如下交換吸附反應(yīng)：下交換吸附反應(yīng)：X(液相液相)+nM(吸附吸附)X(吸附吸附)+nM(液相液相) 其作用機(jī)制是其作用機(jī)制是溶質(zhì)分子溶質(zhì)分子X(jué)(液相液相)和和溶劑分子溶劑分子M(液相液相)對(duì)吸附劑活性表面的對(duì)吸附劑活性表面的競(jìng)爭(zhēng)吸附競(jìng)爭(zhēng)吸附。17.4.2 液固（吸附）色譜液固（吸附）色譜87 K值較小：值較?。喝軇┓肿游搅軓?qiáng)，溶劑分子吸附力很強(qiáng)，被吸被吸附的溶質(zhì)分子很少附的溶質(zhì)分子很少，先流出色譜柱。，先流出色譜柱。 K值較大：值較大：表示該組分分子的吸附能力表示該組分分子的吸附能力較強(qiáng)，后流出色譜柱。較強(qiáng)，后流出色譜

42、柱。發(fā)生在吸附劑表面上的發(fā)生在吸附劑表面上的吸附吸附-解吸平衡解吸平衡，就是液就是液-固色譜分離的基礎(chǔ)。固色譜分離的基礎(chǔ)。17.4.2 液固（吸附）色譜液固（吸附）色譜88 一般規(guī)律：對(duì)于固定相而言，一般規(guī)律：對(duì)于固定相而言，非極性分非極性分子子與極性吸附劑與極性吸附劑(如硅膠、氧化鋁如硅膠、氧化鋁)之間的之間的作用力很作用力很弱弱，分配比，分配比k較小較小，保留時(shí)間，保留時(shí)間較短較短； 但極性分子與極性吸附劑之間的作用力很但極性分子與極性吸附劑之間的作用力很強(qiáng)，分配比強(qiáng)，分配比k大大，保留時(shí)間，保留時(shí)間長(zhǎng)長(zhǎng)。(如果樣品分子吸附的很牢固，對(duì)極性吸附如果樣品分子吸附的很牢固，對(duì)極性吸附劑來(lái)說(shuō)，是

43、要增加還是減少流動(dòng)相的極劑來(lái)說(shuō)，是要增加還是減少流動(dòng)相的極性？）性？）17.4.2 液固（吸附）色譜液固（吸附）色譜89三、流動(dòng)相三、流動(dòng)相對(duì)流動(dòng)相的基本要求：對(duì)流動(dòng)相的基本要求：試樣要能夠溶于流動(dòng)相中；試樣要能夠溶于流動(dòng)相中；流動(dòng)相粘度較??；流動(dòng)相粘度較小；流動(dòng)相不能影響試樣的檢測(cè)。流動(dòng)相不能影響試樣的檢測(cè)。弱極性有機(jī)溶劑或非極性溶劑與極性溶劑弱極性有機(jī)溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構(gòu)烷烴（己烷、戊烷、庚的混合物，如正構(gòu)烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷烷等）、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。乙腈等。17.4.2 液固（吸附）色譜液固（吸附）色譜9017.4.2

44、液固（吸附）色譜液固（吸附）色譜91四、應(yīng)用四、應(yīng)用 常用于分離極性不同的化合物、含有不常用于分離極性不同的化合物、含有不同類(lèi)型或不同數(shù)量官能團(tuán)的有機(jī)化合物，同類(lèi)型或不同數(shù)量官能團(tuán)的有機(jī)化合物，特別適合于有機(jī)化合物的不同的特別適合于有機(jī)化合物的不同的異構(gòu)體異構(gòu)體； 但液但液-固色譜法不宜用于分離同系物，因固色譜法不宜用于分離同系物，因?yàn)橐簽橐?固色譜對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量的同系固色譜對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量的同系物選擇性不高。物選擇性不高。P（398）17.4.2 液固（吸附）色譜液固（吸附）色譜9217.4.3 離子交換色譜離子交換色譜固定相：表面有固定相：表面有離子交換基團(tuán)離子交換基團(tuán)的離子交換劑的

45、離子交換劑陽(yáng)離子的分離：帶負(fù)電荷的交換基團(tuán)陽(yáng)離子的分離：帶負(fù)電荷的交換基團(tuán) （如磺酸基和羧酸基）（如磺酸基和羧酸基） (陽(yáng)離子交換劑）陽(yáng)離子交換劑）陰離子的分離：帶正電荷的交換基團(tuán)陰離子的分離：帶正電荷的交換基團(tuán) （如季銨鹽）（如季銨鹽） (陰離子交換劑）陰離子交換劑）93 不同不同離子離子與與交換基交換基的作用力大小不同，的作用力大小不同，在樹(shù)脂中的保留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而被相互在樹(shù)脂中的保留時(shí)間長(zhǎng)短不同，從而被相互分離。分離。SO3H + M+ SO3M + H+ 17.4.3 離子交換色譜離子交換色譜9417.4.3 離子交換色譜離子交換色譜95一、離子交換色譜法的作用機(jī)制一、離子交換色譜

46、法的作用機(jī)制 為了保持離子交換樹(shù)脂的電中性，為了保持離子交換樹(shù)脂的電中性，活活性基團(tuán)性基團(tuán)上帶有電荷數(shù)相同但正、負(fù)號(hào)相反上帶有電荷數(shù)相同但正、負(fù)號(hào)相反的離子的離子X(jué)，稱(chēng)為，稱(chēng)為反離子反離子。 在離子交換過(guò)程中，流動(dòng)相中存在在離子交換過(guò)程中，流動(dòng)相中存在被分析離子被分析離子與與反離子反離子之間發(fā)生之間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附競(jìng)爭(zhēng)吸附。17.4.3 離子交換色譜離子交換色譜96RSO3X+M+RSO3M+X離子交換色譜的分配過(guò)程是交換與洗脫過(guò)程。離子交換色譜的分配過(guò)程是交換與洗脫過(guò)程。交換達(dá)到平衡時(shí)：交換達(dá)到平衡時(shí)：K K值越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)值越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)17.4.3 離子交換色譜離子交換色譜97二、固

47、定相二、固定相 一般常用的離子交換劑的基質(zhì)有三大類(lèi)：一般常用的離子交換劑的基質(zhì)有三大類(lèi)： 合成樹(shù)脂（聚苯乙烯）合成樹(shù)脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。、纖維素和硅膠。 離子交換劑有陰離子及陽(yáng)離子之分，有離子交換劑有陰離子及陽(yáng)離子之分，有強(qiáng)弱之分（表強(qiáng)弱之分（表21-8）。）。 用交換容量表示樹(shù)脂交換離子的能力，用交換容量表示樹(shù)脂交換離子的能力，理論交換容量理論交換容量是指每克干樹(shù)脂含離子交換基是指每克干樹(shù)脂含離子交換基團(tuán)的量。團(tuán)的量。17.4.3 離子交換色譜離子交換色譜9817.4.3 離子交換色譜離子交換色譜99 離子交換樹(shù)脂兩種類(lèi)型：離子交換樹(shù)脂兩種類(lèi)型：多孔性樹(shù)脂：多孔性樹(shù)脂：極小的球型離

48、子交換樹(shù)脂，極小的球型離子交換樹(shù)脂，能分離復(fù)雜樣品，進(jìn)樣量較大；缺點(diǎn)是機(jī)能分離復(fù)雜樣品，進(jìn)樣量較大；缺點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度不高，不能耐受壓力。械強(qiáng)度不高，不能耐受壓力。薄殼型離子交換樹(shù)脂：薄殼型離子交換樹(shù)脂：在玻璃微球上涂以在玻璃微球上涂以薄層的離子交換樹(shù)脂，這種樹(shù)脂柱效高，薄層的離子交換樹(shù)脂，這種樹(shù)脂柱效高，當(dāng)流動(dòng)相成分發(fā)生變化時(shí)，不會(huì)膨脹或壓當(dāng)流動(dòng)相成分發(fā)生變化時(shí)，不會(huì)膨脹或壓縮；缺點(diǎn)是但柱子容量小，進(jìn)樣量不宜太縮；缺點(diǎn)是但柱子容量小，進(jìn)樣量不宜太多。多。17.4.3 離子交換色譜離子交換色譜100三、流動(dòng)相三、流動(dòng)相 通常在水介質(zhì)中進(jìn)行，也可采用水通常在水介質(zhì)中進(jìn)行，也可采用水/乙醇乙醇混合溶劑

49、，或全部用有機(jī)溶劑?；旌先軇?，或全部用有機(jī)溶劑。17.4.3 離子交換色譜離子交換色譜101四、應(yīng)用四、應(yīng)用主要用來(lái)分離離子或可離解的化合物，凡是主要用來(lái)分離離子或可離解的化合物，凡是在流動(dòng)相中能夠電離的物質(zhì)都可以用離子交在流動(dòng)相中能夠電離的物質(zhì)都可以用離子交換色譜法進(jìn)行分離。換色譜法進(jìn)行分離。 廣泛地應(yīng)用于：無(wú)機(jī)離子、有機(jī)化合物和生廣泛地應(yīng)用于：無(wú)機(jī)離子、有機(jī)化合物和生物物質(zhì)物物質(zhì)(如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)、藥物及它如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)、藥物及它們的代謝物、維生素的混合物、食品防腐劑、們的代謝物、維生素的混合物、食品防腐劑、血清等血清等)的分離。的分離。17.4.3 離子交換色譜離子交換色譜

50、10217.4.3 離子交換色譜離子交換色譜10317.4.3 離子交換色譜離子交換色譜10417.4.4 尺寸排斥色譜尺寸排斥色譜Size exclusion chromatography, 又稱(chēng)又稱(chēng)凝膠色譜和分子篩色譜凝膠色譜和分子篩色譜一、原理一、原理 以多孔性物質(zhì)作固定相，樣品分子受以多孔性物質(zhì)作固定相，樣品分子受固定相孔徑大小的影響而達(dá)到分離的一種固定相孔徑大小的影響而達(dá)到分離的一種液相色譜分離模式。液相色譜分離模式。10517.4.4 尺寸排斥色譜尺寸排斥色譜10617.4.4 尺寸排斥色譜尺寸排斥色譜107凝膠色譜法是一種按分子尺寸大小的順序進(jìn)行凝膠色譜法是一種按分子尺寸大小的順序進(jìn)行分離的一種色譜分析方法。分離的一種色譜分析方法。體積體積大于凝膠孔隙大于凝膠孔隙的分子，由于不能進(jìn)入孔隙的分子，由于不能進(jìn)入孔隙而被排阻，直接從表面流過(guò)，先流出色譜柱；而被排阻，直接從表面流過(guò)，先流出色譜柱；小分子可以小分子可以滲入大大小小的凝膠孔隙滲入大大小小的凝膠孔隙中而完全中而完全不受排阻，然后又從孔隙中出來(lái)隨載液流動(dòng)，不受排阻，然后又從孔隙中出來(lái)隨