實驗九和十微生物的生理生化反應

1、實驗九、十實驗九、十 微生物的生理生化反應微生物的生理生化反應 糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗 吲哚試驗吲哚試驗 產(chǎn)硫化氫試驗產(chǎn)硫化氫試驗vp試驗試驗 甲基紅試驗甲基紅試驗 淀粉水解試驗淀粉水解試驗一、目的要求一、目的要求 1.了解細菌的一般生化反應；了解細菌的一般生化反應； 2.了解細菌的生化鑒定方法其原理。了解細菌的生化鑒定方法其原理。 二、基本原理二、基本原理 n 由于各種微生物的新陳代謝類型不同，因此，由于各種微生物的新陳代謝類型不同，因此，對各種物質利用后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，我對各種物質利用后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，我們可以用化學反應來測定微生物的代謝產(chǎn)物，這們可以用化學反應來測定微生物的

2、代謝產(chǎn)物，這種反應稱為生化反應。生化反應常用來鑒別在形種反應稱為生化反應。生化反應常用來鑒別在形態(tài)或其它方面不易區(qū)別的微生物，例如：腸道細態(tài)或其它方面不易區(qū)別的微生物，例如：腸道細菌中，大腸桿菌和傷寒桿菌，二者在形態(tài)上不易菌中，大腸桿菌和傷寒桿菌，二者在形態(tài)上不易區(qū)分，但前者能發(fā)酵乳糖，后者不能。因此可以區(qū)分，但前者能發(fā)酵乳糖，后者不能。因此可以從它們能否發(fā)酵乳糖來區(qū)別它們，所以微生物的從它們能否發(fā)酵乳糖來區(qū)別它們，所以微生物的生化反應是微生物分類鑒定的重要依據(jù)之一。生化反應是微生物分類鑒定的重要依據(jù)之一。 三、材料三、材料 n菌種：大腸桿菌；枯草桿菌；變形桿菌；菌種：大腸桿菌；枯草桿菌；變形

3、桿菌；自己分離的大腸桿菌自己分離的大腸桿菌。 n培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖）；培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖）；h2s試驗用培養(yǎng)基；蛋白胨水培養(yǎng)基；葡萄糖試驗用培養(yǎng)基；蛋白胨水培養(yǎng)基；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；淀粉培養(yǎng)基。蛋白胨水培養(yǎng)基；淀粉培養(yǎng)基。n試劑：吲哚試劑；碘液；甲基紅試劑；試劑：吲哚試劑；碘液；甲基紅試劑；vp試劑。試劑。 1.糖發(fā)酵試驗糖發(fā)酵試驗n糖發(fā)酵試驗是常用的生化反應，在腸道細菌的鑒糖發(fā)酵試驗是常用的生化反應，在腸道細菌的鑒定上尤為重要，絕大多數(shù)細菌都能利用糖類作為定上尤為重要，絕大多數(shù)細菌都能利用糖類作為能源及碳源，但是細菌的分解糖類的能力上有相能源及碳源，但是細菌的分解糖類

4、的能力上有相當大的差異，某些菌能使某些單糖或雙糖分解，當大的差異，某些菌能使某些單糖或雙糖分解，并產(chǎn)酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（甲烷、并產(chǎn)酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（甲烷、氫、二氧化碳），或者只產(chǎn)酸而不產(chǎn)生氣體。酸氫、二氧化碳），或者只產(chǎn)酸而不產(chǎn)生氣體。酸和氣體的產(chǎn)生與否，可以由培養(yǎng)后試管指示劑的和氣體的產(chǎn)生與否，可以由培養(yǎng)后試管指示劑的顏色變化和小套管內氣泡的有無來判定。當發(fā)酵顏色變化和小套管內氣泡的有無來判定。當發(fā)酵產(chǎn)酸時，指示劑溴甲酚紫由紫色（產(chǎn)酸時，指示劑溴甲酚紫由紫色（ph6.8）變）變?yōu)辄S色（為黃色（ph5.2）。其步驟如下：）。其步驟如下： （1）取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的

5、試管四支）取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管四支（內裝有小套管），一支接種大腸桿菌，（內裝有小套管），一支接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接種，作空白對照?？莶輻U菌，第四支不接種，作空白對照。在各試管上標明菌名和組別，置在各試管上標明菌名和組別，置37培養(yǎng)培養(yǎng)24小時。小時。（2）觀察結果：經(jīng)培養(yǎng)后，指示劑呈黃色）觀察結果：經(jīng)培養(yǎng)后，指示劑呈黃色者表示為酸性，同時觀察小套管中有無氣者表示為酸性，同時觀察小套管中有無氣泡產(chǎn)生。泡產(chǎn)生。 2 2吲哚試驗吲哚試驗n某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成

6、吲哚。吲哚與對二甲基氨苯甲醛結合，形吲哚。吲哚與對二甲基氨苯甲醛結合，形成玫瑰吲哚，此為紅色化合物，其反應變成玫瑰吲哚，此為紅色化合物，其反應變化如下：化如下：（1 1）取蛋白胨水培養(yǎng)基試管四支，分別接種大腸）取蛋白胨水培養(yǎng)基試管四支，分別接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對照，并在試管上注明菌名和組別，置作空白對照，并在試管上注明菌名和組別，置3737培養(yǎng)培養(yǎng)4848小時。小時。 （2 2）培養(yǎng)后取出，在培養(yǎng)液中先加入乙醚約）培養(yǎng)后取出，在培養(yǎng)液中先加入乙醚約1 1毫升毫升（使呈明顯的乙醚層），充分振蕩，使吲哚溶于（使呈明顯的乙

7、醚層），充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上面，乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上面，這時再沿管壁慢慢加入吲哚試劑這時再沿管壁慢慢加入吲哚試劑510510滴，觀察有滴，觀察有無紅色出現(xiàn)。有紅色環(huán)出現(xiàn)者為陽性，黃色者為無紅色出現(xiàn)。有紅色環(huán)出現(xiàn)者為陽性，黃色者為陰性。陰性。 （注意：加入試劑后不可再搖動，否則被混合，紅（注意：加入試劑后不可再搖動，否則被混合，紅色不明顯。）色不明顯。） 3 3產(chǎn)硫化氫試驗產(chǎn)硫化氫試驗n某些菌能分解含硫的有機物或無機物產(chǎn)生硫化氫某些菌能分解含硫的有機物或無機物產(chǎn)生硫化氫（h h2 2s s），），h h2 2s s遇金屬鹽類，如鉛鹽、鐵

8、鹽等，則遇金屬鹽類，如鉛鹽、鐵鹽等，則形成黑色的硫化鉛或硫化鐵的沉淀物。從而可斷形成黑色的硫化鉛或硫化鐵的沉淀物。從而可斷定定h h2 2s s的產(chǎn)生與否。其測定方法有兩種，一種是的產(chǎn)生與否。其測定方法有兩種，一種是用含有檸檬酸鐵銨的培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，看是否有用含有檸檬酸鐵銨的培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，看是否有黑色沉淀（本實驗采用）；另一種是在盛有液體黑色沉淀（本實驗采用）；另一種是在盛有液體培養(yǎng)基的試管中接種菌以后，在試管的棉塞下吊培養(yǎng)基的試管中接種菌以后，在試管的棉塞下吊一片醋酸鉛試紙，經(jīng)培養(yǎng)后看醋酸鉛試紙是否變一片醋酸鉛試紙，經(jīng)培養(yǎng)后看醋酸鉛試紙是否變黑。其步驟如下：黑。其步驟如下： （1 1）取）

9、取h h2 2s s試驗用培養(yǎng)基四支（內含有檸檬酸試驗用培養(yǎng)基四支（內含有檸檬酸鐵銨），分別用穿刺法接種大腸桿菌，自鐵銨），分別用穿刺法接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌和變形桿菌，留一支空己分離的大腸桿菌和變形桿菌，留一支空白，試管上注明菌名和組別，置白，試管上注明菌名和組別，置3737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時。小時。 （2 2）培養(yǎng)后取出觀察，看有無黑色沉淀產(chǎn)生。）培養(yǎng)后取出觀察，看有無黑色沉淀產(chǎn)生。4 4伏一普（伏一普（voges-proskauervoges-proskauer）二氏反應，即二氏反應，即v vp p反應反應n某些菌生長于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能某些菌生長于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基

10、中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，而丙酮酸又可縮分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，而丙酮酸又可縮合、脫羧而轉化成乙酰甲基甲醇，如加入合、脫羧而轉化成乙酰甲基甲醇，如加入強堿液，即與空氣中的氧起作用產(chǎn)生二乙強堿液，即與空氣中的氧起作用產(chǎn)生二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的含胍基成分作用酰，二乙酰與蛋白胨中的含胍基成分作用生成紅色化合物，稱陽性反應，沒有紅色生成紅色化合物，稱陽性反應，沒有紅色化合物產(chǎn)生則稱陰性反應?；衔锂a(chǎn)生則稱陰性反應。（1 1）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，分別）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，分別接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對照，并在試管上草桿

11、菌，留一支作空白對照，并在試管上注明菌名和組別。置注明菌名和組別。置3737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時。小時。 （2 2）培養(yǎng)后取出，按書）培養(yǎng)后取出，按書119119頁上的要求加試頁上的要求加試劑后，放置劑后，放置3737溫室溫室3030分鐘，呈紅色者為分鐘，呈紅色者為陽性，不呈紅色者為陰性。陽性，不呈紅色者為陰性。 5 5甲基紅試驗（甲基紅試驗（m mr r試驗）試驗）n某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能產(chǎn)某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能產(chǎn)生大量的酸，使生大量的酸，使phph降低至降低至4 45 5，它先產(chǎn)生，它先產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、乳酸

12、等。酸的產(chǎn)生可由加入甲基紅指示劑乳酸等。酸的產(chǎn)生可由加入甲基紅指示劑的變色而指示（有效的變色而指示（有效phph范圍為范圍為4.24.26.36.3）。）。細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，則培養(yǎng)液由原來的細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，則培養(yǎng)液由原來的桔黃色，變?yōu)榧t色，即為甲基紅反應。桔黃色，變?yōu)榧t色，即為甲基紅反應。（1 1）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，一支一支接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接種，桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接種，作空白對照。在各試管上標明菌名和組別，作空白對照。在各試管上標明菌名和組別，置置

13、37培養(yǎng)培養(yǎng)48小時。小時。（2 2）培養(yǎng)后取出，沿管壁加入甲基紅指示）培養(yǎng)后取出，沿管壁加入甲基紅指示劑劑3 34 4滴上層呈紅色者為陽性。滴上層呈紅色者為陽性。6 6淀粉水解試驗淀粉水解試驗n某些細菌可以產(chǎn)生能水解培養(yǎng)基中淀粉某些細菌可以產(chǎn)生能水解培養(yǎng)基中淀粉的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解為麥的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細菌吸收利用。淀芽糖和葡萄糖，再被細菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再變藍色。粉水解后，遇碘不再變藍色。 （1 1）淀粉培養(yǎng)基在水浴中融化后，冷至）淀粉培養(yǎng)基在水浴中融化后，冷至 5050，以無菌操作制成平板。用接種環(huán)取，以無菌操作制成平板。用接種環(huán)取

14、 少量枯草桿菌在平板的一邊劃少量枯草桿菌在平板的一邊劃“+”+”字形字形接接 種（或點種），另取少量大腸桿菌菌在平種（或點種），另取少量大腸桿菌菌在平 板的另一邊接種，板的另一邊接種，在各培養(yǎng)皿底部標明菌在各培養(yǎng)皿底部標明菌 名和組別名和組別。置。置3737溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)16162020小時。小時。（2 2）觀察結果：打開皿蓋，滴加少量碘液）觀察結果：打開皿蓋，滴加少量碘液于培養(yǎng)基上，輕輕旋轉培養(yǎng)皿，使碘液均于培養(yǎng)基上，輕輕旋轉培養(yǎng)皿，使碘液均勻鋪滿整個平板。如果在菌周圍出現(xiàn)無色勻鋪滿整個平板。如果在菌周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉被水解。透明圈大小說透明圈，說明淀粉被水解。透明圈大小說明該菌水解淀粉能力的大小。明該菌水