實(shí)驗(yàn)九和十微生物的生理生化反應(yīng)

1、實(shí)驗(yàn)九、十實(shí)驗(yàn)九、十 微生物的生理生化反應(yīng)微生物的生理生化反應(yīng) 糖發(fā)酵試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn) 吲哚試驗(yàn)吲哚試驗(yàn) 產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)vp試驗(yàn)試驗(yàn) 甲基紅試驗(yàn)甲基紅試驗(yàn) 淀粉水解試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)一、目的要求一、目的要求 1.了解細(xì)菌的一般生化反應(yīng)；了解細(xì)菌的一般生化反應(yīng)； 2.了解細(xì)菌的生化鑒定方法其原理。了解細(xì)菌的生化鑒定方法其原理。 二、基本原理二、基本原理 n 由于各種微生物的新陳代謝類型不同，因此，由于各種微生物的新陳代謝類型不同，因此，對(duì)各種物質(zhì)利用后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，我對(duì)各種物質(zhì)利用后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，我們可以用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，這們可以用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的

2、代謝產(chǎn)物，這種反應(yīng)稱為生化反應(yīng)。生化反應(yīng)常用來鑒別在形種反應(yīng)稱為生化反應(yīng)。生化反應(yīng)常用來鑒別在形態(tài)或其它方面不易區(qū)別的微生物，例如：腸道細(xì)態(tài)或其它方面不易區(qū)別的微生物，例如：腸道細(xì)菌中，大腸桿菌和傷寒桿菌，二者在形態(tài)上不易菌中，大腸桿菌和傷寒桿菌，二者在形態(tài)上不易區(qū)分，但前者能發(fā)酵乳糖，后者不能。因此可以區(qū)分，但前者能發(fā)酵乳糖，后者不能。因此可以從它們能否發(fā)酵乳糖來區(qū)別它們，所以微生物的從它們能否發(fā)酵乳糖來區(qū)別它們，所以微生物的生化反應(yīng)是微生物分類鑒定的重要依據(jù)之一。生化反應(yīng)是微生物分類鑒定的重要依據(jù)之一。 三、材料三、材料 n菌種：大腸桿菌；枯草桿菌；變形桿菌；菌種：大腸桿菌；枯草桿菌；變形

3、桿菌；自己分離的大腸桿菌自己分離的大腸桿菌。 n培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖）；培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖）；h2s試驗(yàn)用培養(yǎng)基；蛋白胨水培養(yǎng)基；葡萄糖試驗(yàn)用培養(yǎng)基；蛋白胨水培養(yǎng)基；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；淀粉培養(yǎng)基。蛋白胨水培養(yǎng)基；淀粉培養(yǎng)基。n試劑：吲哚試劑；碘液；甲基紅試劑；試劑：吲哚試劑；碘液；甲基紅試劑；vp試劑。試劑。 1.糖發(fā)酵試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)n糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌的鑒糖發(fā)酵試驗(yàn)是常用的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為重要，絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為定上尤為重要，絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為能源及碳源，但是細(xì)菌的分解糖類的能力上有相能源及碳源，但是細(xì)菌的分解糖類

4、的能力上有相當(dāng)大的差異，某些菌能使某些單糖或雙糖分解，當(dāng)大的差異，某些菌能使某些單糖或雙糖分解，并產(chǎn)酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（甲烷、并產(chǎn)酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（甲烷、氫、二氧化碳），或者只產(chǎn)酸而不產(chǎn)生氣體。酸氫、二氧化碳），或者只產(chǎn)酸而不產(chǎn)生氣體。酸和氣體的產(chǎn)生與否，可以由培養(yǎng)后試管指示劑的和氣體的產(chǎn)生與否，可以由培養(yǎng)后試管指示劑的顏色變化和小套管內(nèi)氣泡的有無來判定。當(dāng)發(fā)酵顏色變化和小套管內(nèi)氣泡的有無來判定。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，指示劑溴甲酚紫由紫色（產(chǎn)酸時(shí)，指示劑溴甲酚紫由紫色（ph6.8）變）變?yōu)辄S色（為黃色（ph5.2）。其步驟如下：）。其步驟如下： （1）取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的

5、試管四支）取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管四支（內(nèi)裝有小套管），一支接種大腸桿菌，（內(nèi)裝有小套管），一支接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接種，作空白對(duì)照?？莶輻U菌，第四支不接種，作空白對(duì)照。在各試管上標(biāo)明菌名和組別，置在各試管上標(biāo)明菌名和組別，置37培養(yǎng)培養(yǎng)24小時(shí)。小時(shí)。（2）觀察結(jié)果：經(jīng)培養(yǎng)后，指示劑呈黃色）觀察結(jié)果：經(jīng)培養(yǎng)后，指示劑呈黃色者表示為酸性，同時(shí)觀察小套管中有無氣者表示為酸性，同時(shí)觀察小套管中有無氣泡產(chǎn)生。泡產(chǎn)生。 2 2吲哚試驗(yàn)吲哚試驗(yàn)n某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成

6、吲哚。吲哚與對(duì)二甲基氨苯甲醛結(jié)合，形吲哚。吲哚與對(duì)二甲基氨苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，此為紅色化合物，其反應(yīng)變成玫瑰吲哚，此為紅色化合物，其反應(yīng)變化如下：化如下：（1 1）取蛋白胨水培養(yǎng)基試管四支，分別接種大腸）取蛋白胨水培養(yǎng)基試管四支，分別接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對(duì)照，并在試管上注明菌名和組別，置作空白對(duì)照，并在試管上注明菌名和組別，置3737培養(yǎng)培養(yǎng)4848小時(shí)。小時(shí)。 （2 2）培養(yǎng)后取出，在培養(yǎng)液中先加入乙醚約）培養(yǎng)后取出，在培養(yǎng)液中先加入乙醚約1 1毫升毫升（使呈明顯的乙醚層），充分振蕩，使吲哚溶于（使呈明顯的乙

7、醚層），充分振蕩，使吲哚溶于乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上面，乙醚中，靜置片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上面，這時(shí)再沿管壁慢慢加入吲哚試劑這時(shí)再沿管壁慢慢加入吲哚試劑510510滴，觀察有滴，觀察有無紅色出現(xiàn)。有紅色環(huán)出現(xiàn)者為陽性，黃色者為無紅色出現(xiàn)。有紅色環(huán)出現(xiàn)者為陽性，黃色者為陰性。陰性。 （注意：加入試劑后不可再搖動(dòng)，否則被混合，紅（注意：加入試劑后不可再搖動(dòng)，否則被混合，紅色不明顯。）色不明顯。） 3 3產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)n某些菌能分解含硫的有機(jī)物或無機(jī)物產(chǎn)生硫化氫某些菌能分解含硫的有機(jī)物或無機(jī)物產(chǎn)生硫化氫（h h2 2s s），），h h2 2s s遇金屬鹽類，如鉛鹽、鐵

8、鹽等，則遇金屬鹽類，如鉛鹽、鐵鹽等，則形成黑色的硫化鉛或硫化鐵的沉淀物。從而可斷形成黑色的硫化鉛或硫化鐵的沉淀物。從而可斷定定h h2 2s s的產(chǎn)生與否。其測定方法有兩種，一種是的產(chǎn)生與否。其測定方法有兩種，一種是用含有檸檬酸鐵銨的培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，看是否有用含有檸檬酸鐵銨的培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，看是否有黑色沉淀（本實(shí)驗(yàn)采用）；另一種是在盛有液體黑色沉淀（本實(shí)驗(yàn)采用）；另一種是在盛有液體培養(yǎng)基的試管中接種菌以后，在試管的棉塞下吊培養(yǎng)基的試管中接種菌以后，在試管的棉塞下吊一片醋酸鉛試紙，經(jīng)培養(yǎng)后看醋酸鉛試紙是否變一片醋酸鉛試紙，經(jīng)培養(yǎng)后看醋酸鉛試紙是否變黑。其步驟如下：黑。其步驟如下： （1 1）取）

9、取h h2 2s s試驗(yàn)用培養(yǎng)基四支（內(nèi)含有檸檬酸試驗(yàn)用培養(yǎng)基四支（內(nèi)含有檸檬酸鐵銨），分別用穿刺法接種大腸桿菌，自鐵銨），分別用穿刺法接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌和變形桿菌，留一支空己分離的大腸桿菌和變形桿菌，留一支空白，試管上注明菌名和組別，置白，試管上注明菌名和組別，置3737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時(shí)。小時(shí)。 （2 2）培養(yǎng)后取出觀察，看有無黑色沉淀產(chǎn)生。）培養(yǎng)后取出觀察，看有無黑色沉淀產(chǎn)生。4 4伏一普（伏一普（voges-proskauervoges-proskauer）二氏反應(yīng)，即二氏反應(yīng)，即v vp p反應(yīng)反應(yīng)n某些菌生長于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能某些菌生長于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基

10、中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，而丙酮酸又可縮分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，而丙酮酸又可縮合、脫羧而轉(zhuǎn)化成乙酰甲基甲醇，如加入合、脫羧而轉(zhuǎn)化成乙酰甲基甲醇，如加入強(qiáng)堿液，即與空氣中的氧起作用產(chǎn)生二乙強(qiáng)堿液，即與空氣中的氧起作用產(chǎn)生二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的含胍基成分作用酰，二乙酰與蛋白胨中的含胍基成分作用生成紅色化合物，稱陽性反應(yīng)，沒有紅色生成紅色化合物，稱陽性反應(yīng)，沒有紅色化合物產(chǎn)生則稱陰性反應(yīng)?；衔锂a(chǎn)生則稱陰性反應(yīng)。（1 1）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，分別）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，分別接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯接種大腸桿菌，自己分離的大腸桿菌，枯草桿菌，留一支作空白對(duì)照，并在試管上草桿

11、菌，留一支作空白對(duì)照，并在試管上注明菌名和組別。置注明菌名和組別。置3737培養(yǎng)培養(yǎng)2424小時(shí)。小時(shí)。 （2 2）培養(yǎng)后取出，按書）培養(yǎng)后取出，按書119119頁上的要求加試頁上的要求加試劑后，放置劑后，放置3737溫室溫室3030分鐘，呈紅色者為分鐘，呈紅色者為陽性，不呈紅色者為陰性。陽性，不呈紅色者為陰性。 5 5甲基紅試驗(yàn)（甲基紅試驗(yàn)（m mr r試驗(yàn)）試驗(yàn)）n某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能產(chǎn)某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能產(chǎn)生大量的酸，使生大量的酸，使phph降低至降低至4 45 5，它先產(chǎn)生，它先產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、乳酸

12、等。酸的產(chǎn)生可由加入甲基紅指示劑乳酸等。酸的產(chǎn)生可由加入甲基紅指示劑的變色而指示（有效的變色而指示（有效phph范圍為范圍為4.24.26.36.3）。）。細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，則培養(yǎng)液由原來的細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，則培養(yǎng)液由原來的桔黃色，變?yōu)榧t色，即為甲基紅反應(yīng)。桔黃色，變?yōu)榧t色，即為甲基紅反應(yīng)。（1 1）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，）取葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基四支，一支一支接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸接種大腸桿菌，第二支接自己分離的大腸桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接種，桿菌，第三支接枯草桿菌，第四支不接種，作空白對(duì)照。在各試管上標(biāo)明菌名和組別，作空白對(duì)照。在各試管上標(biāo)明菌名和組別，置置

13、37培養(yǎng)培養(yǎng)48小時(shí)。小時(shí)。（2 2）培養(yǎng)后取出，沿管壁加入甲基紅指示）培養(yǎng)后取出，沿管壁加入甲基紅指示劑劑3 34 4滴上層呈紅色者為陽性。滴上層呈紅色者為陽性。6 6淀粉水解試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)n某些細(xì)菌可以產(chǎn)生能水解培養(yǎng)基中淀粉某些細(xì)菌可以產(chǎn)生能水解培養(yǎng)基中淀粉的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解為麥的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，再被細(xì)菌吸收利用。淀芽糖和葡萄糖，再被細(xì)菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。 （1 1）淀粉培養(yǎng)基在水浴中融化后，冷至）淀粉培養(yǎng)基在水浴中融化后，冷至 5050，以無菌操作制成平板。用接種環(huán)取，以無菌操作制成平板。用接種環(huán)取

14、 少量枯草桿菌在平板的一邊劃少量枯草桿菌在平板的一邊劃“+”+”字形字形接接 種（或點(diǎn)種），另取少量大腸桿菌菌在平種（或點(diǎn)種），另取少量大腸桿菌菌在平 板的另一邊接種，板的另一邊接種，在各培養(yǎng)皿底部標(biāo)明菌在各培養(yǎng)皿底部標(biāo)明菌 名和組別名和組別。置。置3737溫箱中培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)16162020小時(shí)。小時(shí)。（2 2）觀察結(jié)果：打開皿蓋，滴加少量碘液）觀察結(jié)果：打開皿蓋，滴加少量碘液于培養(yǎng)基上，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使碘液均于培養(yǎng)基上，輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，使碘液均勻鋪滿整個(gè)平板。如果在菌周圍出現(xiàn)無色勻鋪滿整個(gè)平板。如果在菌周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉被水解。透明圈大小說透明圈，說明淀粉被水解。透明圈大小說明該菌水解淀粉能力的大小。明該菌水