實(shí)驗(yàn)三：藥敏

1、實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 藥敏藥敏實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容l一、紙片擴(kuò)散法（k-b法）l二、稀釋法 (mic)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膌一、掌握紙片擴(kuò)散法的原理、操作方法、結(jié)果的判斷及其臨床意義。l二、掌握紙片擴(kuò)散法的質(zhì)量控制(采用標(biāo)準(zhǔn)菌株控制可變因素)。l三、掌握肉湯稀釋法抗生素敏感性試驗(yàn)的原理、操作方法、結(jié)果判斷及臨床意義。l四、了解稀釋法的質(zhì)量控制(采用標(biāo)準(zhǔn)菌株控制可變因素)。紙片擴(kuò)散法（紙片擴(kuò)散法（k-b法）法）l器材與試劑 菌種菌種： 金黃色葡萄球菌atcc25923和金黃色葡萄球菌臨床種的6小時(shí)肉湯培養(yǎng)物，調(diào)整濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽ㄏ喈?dāng)于1.5108cfu/ml)；或挑新鮮培養(yǎng)的單個(gè)菌落，在無菌生理鹽水中研

2、磨，校正其濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷峁堋?培養(yǎng)基培養(yǎng)基：水解酪蛋白培養(yǎng)基（mh瓊脂）。 其他其他：無菌棉簽、抗菌紙片、鑷子、直尺等。l原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解，不斷向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減的梯度濃度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的細(xì)菌生長被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度。l方法方法:（4人一組，人一組，2人做金葡菌標(biāo)準(zhǔn)種，人做金葡菌標(biāo)準(zhǔn)種，2人做人做臨床種，每種菌選臨床種，每種菌選4個(gè)不同的藥物紙片）個(gè)不同的藥物紙片） 1、制備mh瓊脂平板：將加熱融化的瓊脂冷卻至60左右時(shí)傾注于直徑為9cm的無菌

3、平板中，使瓊脂厚度為4mm，待瓊脂凝固后使用，如有冷凝水產(chǎn)生，可放置37 溫箱中15-30分鐘后使用。 2、無菌棉簽蘸取菌液，在試管內(nèi)壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液后在平板表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60，最后沿平板內(nèi)緣涂布1周。 3、平板在室溫下干燥5分鐘，用無菌鑷子將抗菌藥物紙片貼于瓊脂表面，各紙片中心相距大于24mm，距平板內(nèi)緣大于15mm， 37 溫箱中孵育16-18小時(shí)，量取抑菌圈直徑。l結(jié)果觀察中的注意事項(xiàng)： 1、準(zhǔn)確量取抑菌圈直徑，若抑菌圈為橢圓形，量其最長徑和最短徑，取其平均值。 2、若出現(xiàn)雙層抑菌圈，一般藥物測(cè)量內(nèi)圈，而磺胺類藥物則量其外圈。 3、若抑菌圈內(nèi)有散在菌落出現(xiàn)，排除污染

4、菌的存在和其他影響因素，若無污染菌等，需重做。l結(jié)果觀察結(jié)果觀察：1、結(jié)果解釋結(jié)果解釋：用毫米尺量取抑菌圈直徑，參照書上的標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。按敏感（s）、中介（i）、耐藥（r）報(bào)告。 例如：抗菌藥物丁胺卡那霉素（amk），每張紙片含藥量30微克，抑菌圈14mm為耐藥，15-16mm為中介，17mm為敏感。2、質(zhì)量控制質(zhì)量控制：標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈應(yīng)落在書上的預(yù)期范圍內(nèi)，如果超出該范圍，應(yīng)為失控，而不發(fā)報(bào)告，應(yīng)及時(shí)查找原因，予以糾正。 例如：抗菌藥物丁胺卡那霉素（amk），每張紙片含藥量30微克，金黃色葡萄球菌atcc標(biāo)準(zhǔn)株的抑菌圈應(yīng)在20-26mm之間。l思考題： 影響因素？ 1、培養(yǎng)基的質(zhì)量：雙層抑

5、菌圈的出現(xiàn)？ 2、紙片質(zhì)量 3、接種細(xì)菌的菌量 4、孵育的溫度和時(shí)間 5、操作因素稀釋法稀釋法l微量稀釋法l常量稀釋法（試管稀釋法）常量稀釋法（試管稀釋法）常量稀釋法（試管稀釋法）1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?用于測(cè)量某種藥物對(duì)測(cè)試菌的最小抑菌濃度（mic）2、實(shí)驗(yàn)原理： 將抗菌藥物混合于肉湯中作一系列的稀釋，再加入定量的測(cè)試菌，經(jīng)一定時(shí)間和溫度培養(yǎng)后，無細(xì)菌生長的最低藥物濃度即為該藥對(duì)此菌的mic。定量的測(cè)試菌的制備定量的測(cè)試菌的制備l1、將金黃色葡萄球菌atcc25923和金黃色葡萄球菌臨床種的6小時(shí)肉湯培養(yǎng)物，調(diào)整濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽ㄏ喈?dāng)于1.5108cfu/ml)；或挑新鮮培養(yǎng)的單個(gè)菌落，在無菌

6、生理鹽水中研磨，校正其濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷峁?。l2、將調(diào)好濁度的菌液用無菌肉湯稀釋10倍，即可使用。步驟和方法步驟和方法l將抗菌藥物用肉湯稀釋成不同濃度，加入定量測(cè)試菌。l編號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9（對(duì)照） 無菌肉湯管 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1 （ml） 青霉素 0.2 1 1 1 1 1 1 1 棄去 (80單位） 稀釋的金葡菌0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 （ml) 37培養(yǎng)16-18小時(shí) l結(jié)果觀察:l完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度即為該抗菌藥對(duì)此菌的mic。l此次實(shí)驗(yàn)即為青霉素對(duì)金黃色葡萄球菌atcc株和臨床株的mic。l結(jié)果舉例：l編號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 無菌肉湯管 1.8 1 1 1 1 1 1 1 1 （ml） 青霉素 0.2 1 1 1 1 1 1 1 棄去 (80單位） 金葡菌 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1結(jié)果 細(xì)菌生長