項(xiàng)目2微生物發(fā)酵技術(shù)任務(wù)1微生物菌種篩選與保藏

1、 項(xiàng)目項(xiàng)目2：微生物發(fā)酵技術(shù)：微生物發(fā)酵技術(shù) 任務(wù)任務(wù)1：微生物菌種篩選與保藏：微生物菌種篩選與保藏教學(xué)安排：教學(xué)安排： 1. 員工培訓(xùn)員工培訓(xùn) 由老師講解理論基礎(chǔ)。由老師講解理論基礎(chǔ)。 分配實(shí)操任務(wù)分配實(shí)操任務(wù)(菌種篩選與保藏菌種篩選與保藏)。 2. 學(xué)生模擬組建運(yùn)營一個(gè)菌種保藏服學(xué)生模擬組建運(yùn)營一個(gè)菌種保藏服務(wù)機(jī)構(gòu)，撰寫計(jì)劃書務(wù)機(jī)構(gòu)，撰寫計(jì)劃書(在理論教學(xué)期間完在理論教學(xué)期間完成成)。 市場(chǎng)部：菌種保藏的適用范圍，市場(chǎng)市場(chǎng)部：菌種保藏的適用范圍，市場(chǎng)需求調(diào)查，服務(wù)推廣方案。需求調(diào)查，服務(wù)推廣方案。 技術(shù)部：保藏技術(shù)的選擇、制定相關(guān)技術(shù)部：保藏技術(shù)的選擇、制定相關(guān)技術(shù)的操作規(guī)程。技術(shù)的操作規(guī)

2、程。 品控部：制定菌種保藏質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)及品控部：制定菌種保藏質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)方法。檢測(cè)方法。 總經(jīng)理：協(xié)調(diào)監(jiān)督各部工作，最后拿總經(jīng)理：協(xié)調(diào)監(jiān)督各部工作，最后拿出完整的計(jì)劃書。出完整的計(jì)劃書。 3. 計(jì)劃書實(shí)施。計(jì)劃書實(shí)施。 計(jì)劃書要先經(jīng)過老師的審核，然后計(jì)劃書要先經(jīng)過老師的審核，然后實(shí)施。實(shí)施。 實(shí)施過程中考核操作技能。實(shí)施過程中考核操作技能。 實(shí)施后及時(shí)進(jìn)行實(shí)訓(xùn)報(bào)告的撰寫也實(shí)施后及時(shí)進(jìn)行實(shí)訓(xùn)報(bào)告的撰寫也總結(jié)?？偨Y(jié)。n決定發(fā)酵水平高低的三個(gè)因素：決定發(fā)酵水平高低的三個(gè)因素：生產(chǎn)菌種、生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝和后提取工藝。其中最重要的是發(fā)酵工藝和后提取工藝。其中最重要的是生生產(chǎn)菌種產(chǎn)菌種。n選育目的：選

3、育目的：n1 產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)；n2 改變產(chǎn)品組分，改進(jìn)質(zhì)量；n3 簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝條件，縮短生產(chǎn)周期；n4 適應(yīng)新的原材料；n5 提高產(chǎn)量。n選育方法：選育方法：n1 自然選育；自然選育；n2 誘變育種；誘變育種；n3 原生質(zhì)體技術(shù)；原生質(zhì)體技術(shù)；n4 雜交育種；雜交育種；n5 分子生物學(xué)方法。分子生物學(xué)方法。n第一節(jié)第一節(jié) 自然選育自然選育n自然選育是一種純種選育的方法，純化自然選育是一種純種選育的方法，純化復(fù)狀之功效，也可選育正突變株。復(fù)狀之功效，也可選育正突變株。n一一 菌種退化與變異的原因菌種退化與變異的原因n1 遺傳基因型的分離；遺傳基因型的分離；n2 自發(fā)突變的結(jié)果；自發(fā)突變的結(jié)

4、果；n（1）用沙土管長(zhǎng)期保藏；）用沙土管長(zhǎng)期保藏；n（2）菌種連續(xù)傳代；）菌種連續(xù)傳代；n（3）活細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝；）活細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝； n（4）dna中存在增變基因；中存在增變基因；n（5）dna的代謝失調(diào)。的代謝失調(diào)。n3 經(jīng)誘變劑處理后的退化變異經(jīng)誘變劑處理后的退化變異二二 自然選育的方法自然選育的方法1 單孢子懸浮液的制備；2 分離及單菌落培養(yǎng)；3 篩選；第二節(jié)第二節(jié) 誘變育種誘變育種一一 突變誘發(fā)過程突變誘發(fā)過程（一）誘變劑接觸（一）誘變劑接觸dna分子前；分子前；（二）（二）dna損傷的修復(fù)；損傷的修復(fù)；1 光復(fù)合修復(fù)；光復(fù)合修復(fù)；2 切補(bǔ)修復(fù)；切補(bǔ)修復(fù)；3 重組修復(fù)；重組修復(fù)；

5、4 sos修復(fù)系統(tǒng)；修復(fù)系統(tǒng)；5 dna多聚酶的校正作用。多聚酶的校正作用。（三）從前突變到突變（三）從前突變到突變 經(jīng)過修復(fù)系統(tǒng)后繼續(xù)保留的突變。經(jīng)過修復(fù)系統(tǒng)后繼續(xù)保留的突變。 增強(qiáng)誘變效果的方法：增強(qiáng)誘變效果的方法： 1 抑制修復(fù)的酶系統(tǒng)；抑制修復(fù)的酶系統(tǒng)； 2 使誘變的基因處于活性狀態(tài)。使誘變的基因處于活性狀態(tài)。（四）從突變到突變型（四）從突變到突變型 表型延遲：表型延遲： 表型的改變落后的基因型的表型的改變落后的基因型的改變。改變。 1 分離性延遲；分離性延遲； 2 生理性延遲。生理性延遲。 二二 誘變育種方案的設(shè)計(jì)誘變育種方案的設(shè)計(jì) （一）制定篩選目標(biāo)（一）制定篩選目標(biāo) 高產(chǎn)性狀再加

6、輔助目標(biāo)。高產(chǎn)性狀再加輔助目標(biāo)。（二）制定篩選方案（二）制定篩選方案1 誘變過程誘變過程（1）出發(fā)菌株斜面；）出發(fā)菌株斜面；（2）單孢子懸液制備；）單孢子懸液制備；（3）孢子計(jì)數(shù)；）孢子計(jì)數(shù)；（4）單菌落分離。）單菌落分離。2 篩選過程篩選過程（1）傳種斜面；）傳種斜面；（2）留種保藏；）留種保藏；（3）篩選高產(chǎn)菌株。）篩選高產(chǎn)菌株。三三 突變的誘發(fā)突變的誘發(fā) （一）出發(fā)菌株的選擇（一）出發(fā)菌株的選擇（1）選擇純種；）選擇純種；（2）選擇具有優(yōu)良性狀的出發(fā)菌株；）選擇具有優(yōu)良性狀的出發(fā)菌株；（3）對(duì)誘變劑敏感。）對(duì)誘變劑敏感。（二）誘變劑的選擇（二）誘變劑的選擇 （1）多種誘變劑輪換使用；）多

7、種誘變劑輪換使用； （2）最適劑量。）最適劑量。（三）影響誘變效果的因素（三）影響誘變效果的因素 （1）菌種的生理狀態(tài)；）菌種的生理狀態(tài)； （2）處理前后的培養(yǎng)條件。）處理前后的培養(yǎng)條件。四突變株的篩選四突變株的篩選(一一)隨機(jī)篩選隨機(jī)篩選n1搖瓶篩選法搖瓶篩選法n優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)條件與生產(chǎn)條件相接近；優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)條件與生產(chǎn)條件相接近；n缺點(diǎn)：工作量大，時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜。缺點(diǎn)：工作量大，時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜。n2瓊脂塊篩選法瓊脂塊篩選法n優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、速度快；優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、速度快；n缺點(diǎn)：固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)差距大，不缺點(diǎn)：固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)差距大，不能準(zhǔn)確反應(yīng)生產(chǎn)能力。能準(zhǔn)確反應(yīng)生產(chǎn)能力。 3篩選自動(dòng)

8、化與篩選微型化篩選自動(dòng)化與篩選微型化（二）理性化篩選（二）理性化篩選運(yùn)用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)運(yùn)用遺傳學(xué)、生物化學(xué)的原理，根據(jù)產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代產(chǎn)物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來進(jìn)行設(shè)計(jì)謝調(diào)控機(jī)制和產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)來進(jìn)行設(shè)計(jì)和采用一些篩選方法，以打破微生物原和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)有的代謝調(diào)控機(jī)制，獲得能大量形成產(chǎn)物的高產(chǎn)突變株。物的高產(chǎn)突變株。 n1 初級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選；初級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選；n（1）降低終產(chǎn)物濃度）降低終產(chǎn)物濃度n篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型；篩選終產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型；n篩選細(xì)胞膜透性

9、改變的突變株。篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株。n(2)篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株n篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株；篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株；n利用回復(fù)突變篩選抗反饋突變菌株。利用回復(fù)突變篩選抗反饋突變菌株。n2 次級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選次級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選n 次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的條件：次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的條件：n共同的前體與營養(yǎng)不平衡。共同的前體與營養(yǎng)不平衡。n(1)利用營養(yǎng)缺陷型篩選利用營養(yǎng)缺陷型篩選n 芳香族氨基酸與氯霉素有共同的凝膠體莽芳香族氨基酸與氯霉素有共同的凝膠體莽草酸，選育芳香族氨基酸缺陷型，有利于積草酸，選育芳香族氨基酸缺陷型，有利于積累氯霉素。累氯霉素。n 脂肪酸與制

10、霉菌素、四環(huán)素、灰黃霉素脂肪酸與制霉菌素、四環(huán)素、灰黃霉素有共同的前體丙二酰有共同的前體丙二酰coa。n 滲漏缺陷型：遺傳性障礙不完全的營養(yǎng)滲漏缺陷型：遺傳性障礙不完全的營養(yǎng)缺陷型。缺陷型。n(2)篩選負(fù)變株或零變株的回復(fù)突變株篩選負(fù)變株或零變株的回復(fù)突變株n(3)篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株n篩選能在磷酸鹽抑制濃度下，正常產(chǎn)生抗篩選能在磷酸鹽抑制濃度下，正常產(chǎn)生抗生素的突變株；生素的突變株；n篩選磷酸鹽結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株。篩選磷酸鹽結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株。n 低親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)低親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)i i；n 高親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)高親和力的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)iiii。

11、n(4)(4)篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株篩選去碳源分解代謝調(diào)節(jié)突變株n 解除葡萄糖效應(yīng)解除葡萄糖效應(yīng)( (去葡萄糖分解代謝調(diào)去葡萄糖分解代謝調(diào)節(jié)突變株毒性結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株節(jié)突變株毒性結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株) )。n 篩選淀粉酶活性高的突變株。篩選淀粉酶活性高的突變株。n(5)篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株n 許多抗生素和氨基酸有共同的前體或者許多抗生素和氨基酸有共同的前體或者有些氨基酸本身可以作為某些抗生素的前體。有些氨基酸本身可以作為某些抗生素的前體。n 例：半胱氨酸和纈氨酸是青霉素母核。例：半胱氨酸和纈氨酸是青霉素母核。n(6) 篩選二價(jià)金屬離子抗性突變株

12、篩選二價(jià)金屬離子抗性突變株n(7) 篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株n 前體或前體結(jié)構(gòu)類似物對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑前體或前體結(jié)構(gòu)類似物對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制作用。制作用。前體：自身不能合成；前體：自身不能合成； 自身能合成，但產(chǎn)量低；自身能合成，但產(chǎn)量低； 自身能合成，但有反饋調(diào)節(jié)作用。自身能合成，但有反饋調(diào)節(jié)作用。(8)篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株篩選自身所產(chǎn)的抗生素抗性突變株第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的保藏 n一、菌種保藏的目的與原理 n二、菌種的復(fù)壯 一、菌種保藏的目的與原理n(一) 原理n 人工創(chuàng)造條件使菌體的代謝活動(dòng)處于休眠狀態(tài)。 菌種保藏n菌種保藏有許多的方法，其共同

13、的目標(biāo)是把菌株的優(yōu)良性狀保存下來，防止退化、死亡或雜菌污染。保藏的一般程序是選取優(yōu)良的純菌種，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠體，在其休眠和停止生長(zhǎng)的條件下保藏。微生物生長(zhǎng)要求適宜的溫度、水分、空氣和營養(yǎng)物質(zhì)等，如將菌種處于低溫、干燥、無氧和缺乏營養(yǎng)的條件下，就可以使菌種暫時(shí)處于休眠狀態(tài)。菌種保藏 其中低溫是保藏菌種的重要因素，也是常用的一種簡(jiǎn)單易行的方法。在作低溫保藏時(shí)，注意盡量不損傷細(xì)胞。在緩慢冷凍時(shí)，胞外基質(zhì)一般較快結(jié)冰而形成冰晶使基質(zhì)濃度增高，造成細(xì)胞水分外滲而大量脫水，可能使細(xì)胞死亡。如快速降溫，胞內(nèi)也很快形成冰晶，胞內(nèi)外滲透壓基本平衡，同時(shí)胞內(nèi)冰晶較小，對(duì)細(xì)胞及原生質(zhì)膜的損傷也較小，

14、菌株不易死亡，影響也較小。與低溫相關(guān)的保藏方法，如冷凍干燥法、超低溫保藏法等，都是利用低溫條件下細(xì)胞與環(huán)境的特殊平衡原理而設(shè)計(jì)的。(二)、菌種保藏n(一)低溫保藏法 n(二)低溫定期移植法 n(三)液體石蠟封存保藏法 n(四)固體曲保藏法 n(五)甘油管保藏法 n(六)真空冷凍干燥法 n(七)液氮超低溫保存 現(xiàn)行的菌種保藏方法有下列諸種:(一)低溫保藏法 n這是一種常用的簡(jiǎn)便方法。一般的斜面孢子、液態(tài)孢子、斜面種子以及用麩皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在4冰箱內(nèi)保藏，這種溫度條件下不能使菌體進(jìn)入休眠，而僅是抑制微生物的生命活動(dòng)。因此，保藏時(shí)間不宜過長(zhǎng)，一般不超過13個(gè)月為宜。本方法雖

15、然簡(jiǎn)便，但由于菌株處于較高的水平活性下，這對(duì)保藏株的生產(chǎn)性狀是不利的，因此，生產(chǎn)菌種一般不采用此法保藏。(二)低溫定期移植法 n把培養(yǎng)好的斜面菌種放在低溫干燥處保存，定期移植，一般36個(gè)月移植一次(視菌種特征而定)。也可以用穿刺培養(yǎng)，定期移植法保藏細(xì)菌，其效果也較好。穿刺培養(yǎng)是將含0.60.8的瓊脂培養(yǎng)基裝試管滅菌后直立冷凝后，用接種針尖挑取少量菌體，垂直刺入瓊脂培養(yǎng)基中心，放在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)，待菌長(zhǎng)好后即可放低溫保存，此法較斜面保存有利，大腸桿菌可保藏2年以上不發(fā)生明顯變異。(二)低溫定期移植法n 斜面定期移植與穿刺移植法有其缺陷，即容易發(fā)生遺傳變異；連續(xù)傳代可使一些生產(chǎn)性狀丟失或減弱，也易

16、于污染雜菌。因此，一些貴重菌株及生產(chǎn)優(yōu)良菌株不宜用此法保藏。(三)液體石蠟封存法 n本方法的原理是在長(zhǎng)好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達(dá)到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長(zhǎng)和代謝停止?fàn)顟B(tài)，同時(shí)石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達(dá)到較長(zhǎng)期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-44下。液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。(三)液體石蠟低溫封存法n具體操作是：菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過長(zhǎng)；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶中經(jīng)過121高壓蒸汽滅菌12h，將其放烘箱中(160左右)干熱處理，去除滅菌時(shí)滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm左右為宜。(四)

17、干燥保藏 n微生物生長(zhǎng)需要水分，干燥法是使菌處于干燥條件下停止生長(zhǎng)及處于休眠狀態(tài)，達(dá)到較長(zhǎng)期保藏的目的。此法用于細(xì)菌芽孢或產(chǎn)分生孢子的菌種，是現(xiàn)在發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中較常用的菌種保藏方法。為了轉(zhuǎn)接方便，控制接種量以及對(duì)菌種的保護(hù)作用，通常將菌種的分生孢子、芽孢，甚至菌絲體吸附于一些載體表面放至干燥容器里進(jìn)行常壓干燥或真空干燥，所用載體有沙土、濾紙、硅膠及大(小)米等。1.沙土管法 取河(海)沙，過0.78mm(24目)篩，用10鹽酸浸泡24h，倒去鹽酸用清水沖洗至ph呈中性，去水烘干或曬干。取菜園或果園土粉碎過篩，把烘干的沙土按3：2或1：1混合裝入指形管或高100mm，直徑為10mm的小試管中，高

18、約1cm(約2g)，塞棉塞121滅菌1h，也可用1702h干熱滅菌(或蒸汽三次間歇滅菌)，蒸汽滅菌后需烘干。經(jīng)肉湯檢查確實(shí)證明無菌即可使用。將要保存的斜面菌種制成濃孢子懸液(106/ml)，用滅菌滴管或吸管吸取孢子懸液滴入無菌沙土上，每管約0.30.5ml，用接種環(huán)將其混合均勻。1.沙土管法n也可將真菌分生孢子用接種環(huán)從斜面直接挑取放入沙土中。然后將沙土管抽真空干燥。這時(shí)管內(nèi)砂土松散，表明已干燥。將干燥的砂土管放置在干燥器或密閉容器內(nèi)、干燥器下部放置變色硅膠等干燥劑，于4下保存。從斜面取出的孢子放入沙土管中混勻后，可以不抽真空直接放干燥器內(nèi)保存。1.沙土管法n在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后逐

19、漸減慢，存活下來的孢子在以后保存期間穩(wěn)定性較好，保藏的有效時(shí)間與菌種存活率的關(guān)系見圖2-10。 用沙土管保藏的某些抗生素產(chǎn)生菌保藏期可達(dá)18年(土霉素和鏈霉素產(chǎn)生菌)到22年(新霉素產(chǎn)生菌)，但對(duì)利福霉素、卡那霉素、四環(huán)素等容易產(chǎn)生變異的菌種，就不適合作長(zhǎng)期的沙土管保存。1.沙土管法2.濾紙保藏法 n本法是將要要保藏的微生物細(xì)胞或孢子吸附在滅菌濾紙上，干燥后冷藏。其方法是3#濾紙剪成5mm50mm的小條，放入干燥的培養(yǎng)皿中滅菌。將培養(yǎng)好的菌種用滅菌脫脂乳或奶粉復(fù)原乳制成孢子懸液，用滅菌鑷子將準(zhǔn)備好的濾紙條在滅菌操作下浸入菌懸液中，充分吸附菌細(xì)胞，取出后放入滅菌小試管或安瓿管中，在真空干燥機(jī)上抽

20、干，真空條件下火焰熔封，冷藏。3.大(小)米保藏法 n 是根據(jù)我國制曲原理加以改進(jìn)的一種方法。此法是將曲霉等大量產(chǎn)生孢子的菌直接培養(yǎng)在大(小)米培養(yǎng)基上，待孢子充分成熟后干燥后保藏。 (五)甘油管保藏法n本法也是利用微生物在甘油中生長(zhǎng)和代謝受到抑制的原理達(dá)到保藏目的。其方法是，將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無菌種用無菌水制成高濃度的菌懸液(1081010/ml)。取1ml滅菌甘油放入與甘油充分混勻，使甘油濃度約為40%，于-20下凍存。(六)真空冷凍干燥法 n真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對(duì)病毒、細(xì)菌、放線菌

21、、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。冷凍干燥保存的菌種存活時(shí)間長(zhǎng)、效果好，一般菌種可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發(fā)生變異。還具有體積小、不易污染、便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，是一種用得最為廣泛的菌種保藏方法。(六)真空冷凍干燥法n冷凍干燥法是在低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，然后在真空條件下干燥，使微生物的生長(zhǎng)和酶活動(dòng)停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對(duì)細(xì)胞的損害，要采用保護(hù)劑來制備細(xì)甩懸液，使菌在凍結(jié)和脫水過程中起到保護(hù)作用的溶質(zhì)，通過氫鍵和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。(六)真空冷凍干燥法n1.冷凍干燥的基本原理 即是使樣品中的水分在冰凍狀態(tài)下

22、，抽真空減壓，使凍結(jié)的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達(dá)到干燥。干燥后的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。n2.設(shè)備 冷凍干燥備有不同型號(hào)和類型，但都由四個(gè)部分組成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷凍系統(tǒng)。干燥箱可控制溫度范圍為-4040。 (六)真空冷凍干燥法n3.操作方法 n(1)安瓿管準(zhǔn)備 選取規(guī)格約直徑為8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%鹽酸浸泡810h，再經(jīng)自來水沖洗多次，用蒸餾水涮洗23次，烘干；在每管內(nèi)放入打好菌號(hào)及日期的標(biāo)簽，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，滅菌備用。 (六)真空冷凍干燥法(六)真空冷凍干燥法n(2)保護(hù)劑的選擇及制備 冷凍干燥保藏法使用的保護(hù)

23、劑種類很多，列于表2-8，效果不盡相同，通常采用高分子化合物與低分子化合物混合使用效果更好。在配制時(shí)注意比例、濃度、ph和滅菌方法。一些對(duì)熱敏感的保護(hù)劑如血清等用過濾除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數(shù)菌種可以用脫脂乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數(shù)菌種可以用脫乳為保護(hù)劑。(六)真空冷凍干燥法n(3)菌種準(zhǔn)備及分裝 菌種要求為生長(zhǎng)良好的純種，菌齡以處于穩(wěn)定期為好，孢子是新鮮的。每支長(zhǎng)好的斜面加23ml保護(hù)劑，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮起(注意勿刮起培養(yǎng)基)，制成菌懸液。如用液體培養(yǎng)的菌種，則需經(jīng)離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細(xì)胞，收集的菌體用保護(hù)劑懸浮制成菌懸液。懸液中菌數(shù)要

24、求達(dá)到1081010cfu/ml為宜。懸液制備完成盡快分裝和凍結(jié)。分裝安瓿時(shí)可用滅菌的長(zhǎng)滴入安瓿管底部，裝量可依據(jù)冷凍干燥機(jī)效能而定。 (六)真空冷凍干燥法n(4)預(yù)凍 分裝好的安瓿管需要進(jìn)行預(yù)凍，即放在-3040下凍結(jié)2060min，也可以用干冰和無水乙醇凍510min。n(5)冷凍干燥 經(jīng)預(yù)凍的安瓿放入干燥箱中開始抽真空干燥。此時(shí)干燥箱溫度控制在-30以下，并盡快使真度達(dá)到66pa以下。此后可還漸升溫以加速水分升華，但升溫不宜過快，以免引起樣品融化。干燥時(shí)間視凍干機(jī)效率、樣品裝量及性質(zhì)等而寂，以樣品最終水分含量達(dá)到1%3%為準(zhǔn)。具體操作時(shí)是根據(jù)凍干樣品呈酥塊工松散片狀；真空度接近空載時(shí)最高

25、真空；樣品溫度與管外溫度接近。干燥完畢將安瓿管在真空下用火焰燒熔密封，并用高頻真空檢測(cè)真空度。(六)真空冷凍干燥法n(6)保藏及凍干管的啟用 密封好的凍干管在4或-18下保藏。當(dāng)需用凍干菌種時(shí)，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂輪在無菌條件下打開，或?qū)碴稠敳吭诰凭珶艋鹧嫔献茻?，迅速滴上冷的無菌水，使管破裂，然后用鑷子等輕輕敲碎管口，加入0.30.5ml液體培養(yǎng)基溶解凍干菌塊成為懸液，用無菌滴管或接種環(huán)移至斜面或液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。(六)真空冷凍干燥法n4.簡(jiǎn)易冷凍干燥裝置 在缺乏真空冷凍干燥機(jī)的情況下，可以自己裝配一個(gè)簡(jiǎn)易凍干裝置(圖2-11)，它主要由歧管(玻璃或金屬管制成)、冰浴、冷凝器(

26、水汽接收)和真空泵組成。冰浴用干冰(固體co2)和甲基溶纖劑致冷，干燥后期也可作溫度控制用。冷凝器也要置冰浴中，必要時(shí)用一根u玻璃彎管代用。安瓿管在凍干前也要預(yù)凍 (六)真空冷凍干燥法n1)菌的質(zhì)量 保藏的菌種應(yīng)培養(yǎng)地營養(yǎng)豐富的最適條件下，使之進(jìn)入穩(wěn)定期，稍老一些的菌體對(duì)環(huán)境抵抗力強(qiáng)。另處，作為冷凍干燥的菌懸液細(xì)胞濃度要高不同的菌對(duì)冷凍干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液細(xì)胞濃度不高，就會(huì)使以后傳種造成困難，保存期也會(huì)受到影響。(六)真空冷凍干燥法n(2)保護(hù)劑 不同種類的保護(hù)劑對(duì)不同微生物的作用是不同的，如個(gè)別菌種在脫脂乳作保護(hù)劑的情況下死亡率高達(dá)99.99%，而采用葡聚糖等混和保護(hù)劑時(shí)死亡率

27、大大減少。一般情況下，那些容易保存的菌種對(duì)保護(hù)劑的要求不很嚴(yán)格，而不易保存的菌種對(duì)保護(hù)劑的要求卻很苛刻。因此，選擇好的保護(hù)劑是冷凍干燥保存菌種的關(guān)鍵因素。(六)真空冷凍干燥法(六)真空冷凍干燥法n3)干燥速度 實(shí)驗(yàn)表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存活率為67.3%，而3h為59%。n(4)空氣的影響 冷凍干燥后空氣對(duì)細(xì)菌細(xì)胞影響較大，可導(dǎo)致細(xì)胞損傷進(jìn)而死亡，故在凍干后應(yīng)立即在真空下融封，才有利于長(zhǎng)期保存。 n(5)溫度的影響 在干燥和真空狀況下溫度的影響遠(yuǎn)沒有上述幾項(xiàng)因素重要，因此可以在室溫下保存，但許多微生物在4保存的存活率要比在室溫下高1倍。n(6)含水量的影響 水分含量

28、過高對(duì)菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細(xì)胞含水量控制在3%以下(1%3%)。 (六)真空冷凍干燥法(六)真空冷凍干燥法n(7)復(fù)蘇培養(yǎng) 打開安瓿管后加入無菌水使 凍干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。n菌種能否適宜竽凍干保存，需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)來證明，一般是在保存1個(gè)月進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，如果菌的成活率高于01.%，即認(rèn)為可用凍干保存法保存，以后6個(gè)月、2年、5年、10年再進(jìn)行檢查存活情況，以確定保存期的上限。n凍干保藏的效果因微生物種類而異，一般是細(xì)菌放線菌真菌藻類，而菌絲體不宜用此法保存。(七)液氮超低溫保存 n本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。大多數(shù)微生物如病毒、噬菌體，立

29、克氏體，各種細(xì)菌、放細(xì)菌、支原體，各種絲狀菌、酵母、藻類和原蟲，特別是一些無法用凍干保存的微生物，都可用此法長(zhǎng)期保存。工業(yè)微生物高產(chǎn)菌種也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130以下溫度時(shí)，它的新陳代謝作用停止，化學(xué)反應(yīng)也消失，而液氮溫度可達(dá)-196，在這種情況下可以長(zhǎng)期保存。 (七)液氮超低溫保存n1.保護(hù)劑 與冷凍干燥保存一樣，液氮保存菌種也需要有保護(hù)物質(zhì)，可以用10%的甘油，使用方便、效果好，但有些菌對(duì)甘油敏感，效果不佳，可選用其他保護(hù)劑，常用的有5%10%(v/v)二甲基亞砜；20%二甲亞砜加1%蛋白陳；汪溫80及0.4mmol聚乙烯氮戊環(huán)等，糖類也可作為一種保護(hù)劑，但濃度適當(dāng)加以控制。(七)液氮超低溫保存n2.操作程序n(1)安瓿管 一般要求用95%料或gg17的玻管制作，以能承受巨大的溫差變化而不破損，大小根據(jù)需要而定。用印同在管壁上