DNA的測序方法原理及其應用(1)

1、.1DNA的測序方法、原理及其應用.2一、一、DNA序列測定概述及其發(fā)展序列測定概述及其發(fā)展 即即核酸核酸DNADNA分子一級結(jié)構(gòu)的測定，是現(xiàn)代分子生物學一項分子一級結(jié)構(gòu)的測定，是現(xiàn)代分子生物學一項重要的技術(shù)重要的技術(shù)。 .3 1963年，年，Sanger和和Thompson等人第一次完成胰島素等人第一次完成胰島素51個個氨基酸的序列測定，這在當時來說是一件了不起的大事。氨基酸的序列測定，這在當時來說是一件了不起的大事。70年代后期，年代后期，Sanger和和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序等人又建立了核酸序列測定的方法，列測定的方法，Sanger雙脫氧末端終止法和雙脫氧末端終止法

2、和Maxam-Gilbert化學裂解法將核酸序列測定技術(shù)推進到化學裂解法將核酸序列測定技術(shù)推進到“直讀直讀”階段，階段，使核酸序列測定變得遠比蛋白質(zhì)氨基酸序列測定容易，這樣使核酸序列測定變得遠比蛋白質(zhì)氨基酸序列測定容易，這樣人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導出蛋白質(zhì)氨基酸的序人們可以通過核酸序列和遺傳密碼推導出蛋白質(zhì)氨基酸的序列。列。.4二、測序的常用方法二、測序的常用方法DNA序列測定常用方法有如下3種： 1、末端終止法2、化學裂解法3、DNA測序自動化使用特異性引物與單鏈模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下進行延伸反應，用ddNTP終止，用PAGE區(qū)分長度僅相差1個核苷酸的ssDNA，從而

3、完成測序的方法。用化學試劑在A、G、C、T處特定的裂解DNA片段，產(chǎn)生一簇各種長度的短鏈，經(jīng)過PAGE放射自顯影可直讀DNA順序。類似末端終止法，所不同的是用熒光染料標記，計算機自動讀出。優(yōu)點簡便、迅速、應用廣泛。不需酶促反應，可以對寡核苷酸測序。1、高負荷，1塊膠可測16個樣品；2、機讀不需放射自顯影；3、安全不用同位素；4、簡單迅速8-10h。.5 1）雙脫氧鏈終止法測序雙脫氧鏈終止法測序(the chain termination method) 基本原理： 通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈，由于合成的互補鏈可在不同位置隨機終止反應，產(chǎn)生只差一個核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DN

4、A分子的順序。.6用于終止反應的雙脫氧核苷酸： 將2 ，3 雙脫氧核苷酸（ddNTP）參入到新合成的DNA鏈中，由于參入的ddNTP缺乏3 羥基，因此不能與下一位核苷酸反應形成磷酸二酯鍵，DNA合成反應將中止。.7O堿基堿基CPOH12345O堿基堿基CPHH12345H2O脫氧核苷酸的連接脫氧核苷酸的連接.8O堿基堿基CPHH12345O堿基堿基CPOHH12345OHX雙脫氧核苷酸雙脫氧核苷酸?.9.102）Maxam-Gilbert 化學降解法測序化學降解法測序基本原理：基本原理： 用放射性核素標記待測用放射性核素標記待測DNA一側(cè)末端一側(cè)末端 將標記將標記DNA分為分為G、A+G、C+

5、T、C 4個反應體系個反應體系 用不同的化學試劑處理不同反應體系，隨機斷裂用不同的化學試劑處理不同反應體系，隨機斷裂DNA片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線標記片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線標記的末端，另一端為不同大小的的末端，另一端為不同大小的DNA片段的混合物片段的混合物 電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出讀出DNA序列序列.11.12表表-特異斷裂特異斷裂4種脫氧核苷酸的方法種脫氧核苷酸的方法作用的堿基作用的堿基試劑與反應試劑與反應堿基釋放堿基釋放DNA斷裂斷裂強強G/弱弱A稀釋稀釋250倍硫酸

6、二甲酯，在倍硫酸二甲酯，在50mM卡可酸（卡可酸（PH8.0）10MMgCl2、0.1MEDTA20060分鐘，分鐘，DNAG的的N7和和A的的N3甲基化甲基化甲基化嘌呤不穩(wěn)定，甲基化嘌呤不穩(wěn)定，在中型在中型PH加熱被破壞加熱被破壞在在0.1M堿中，堿中，9015分鐘，戊糖脫落，分鐘，戊糖脫落，DNA鏈斷裂，鏈斷裂，G斷裂斷裂比比A快快5倍倍A同上同上0.2NHCl、0、60分分鐘，堿基被破壞鐘，堿基被破壞同上，同上，A斷裂比斷裂比G快快C+T15-18M聯(lián)苯胺、聯(lián)苯胺、2050分鐘，嘧啶環(huán)被破壞釋放分鐘，嘧啶環(huán)被破壞釋放0.5M哌啶處理，斷裂哌啶處理，斷裂DNA鍵，鍵，C與與T有同有同樣速率

7、樣速率C2MNaCl，聯(lián)氨處理方法同上，聯(lián)氨處理方法同上，100分鐘，此時，分鐘，此時，T的破壞被抑制，只有的破壞被抑制，只有C被破壞釋放被破壞釋放同上，只在同上，只在C處斷裂處斷裂DNA鏈鏈.13在在4種反應體系中，化學試劑特異地斷裂種反應體系中，化學試劑特異地斷裂DNA的機制是：的機制是： G反應反應-硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMS）使）使GN7甲基化，其后斷開甲基化，其后斷開了了C8-C9間的化學鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。間的化學鍵，哌啶置換了被修飾鳥嘌呤與核糖的結(jié)合。 G+A反應反應-（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削（哌啶）甲酸使嘌呤環(huán)上氮原子質(zhì)子化，削弱了嘌呤脫氧

8、核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，弱了嘌呤脫氧核糖核苷酸和腺嘌呤脫氧核糖核苷酸的糖苷鍵，然后哌啶置換了嘌呤。然后哌啶置換了嘌呤。 T+C反應反應-肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。肼斷開了嘧啶環(huán)，產(chǎn)生堿基片段被哌啶置換。 C反應反應-在在NaCl存在時，只有存在時，只有C才能與肼發(fā)生反應，隨后，才能與肼發(fā)生反應，隨后，被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。被修飾的胞嘧啶被哌啶置換。.14 堿基特異性修飾及裂解堿基特異性修飾及裂解反應體系反應體系堿基修飾試劑堿基修飾試劑堿基修飾反應堿基修飾反應主鏈斷裂試劑主鏈斷裂試劑斷裂點斷裂點G硫酸二甲酯硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化鳥嘌呤甲基化六氫吡啶六氫吡啶GG

9、+A甲酸甲酸脫嘌呤作用脫嘌呤作用六氫吡啶六氫吡啶G和和AC+T肼肼嘧啶開環(huán)嘧啶開環(huán)六氫吡啶六氫吡啶C和和TC肼（加鹽）肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶六氫吡啶C.15.163） DNA自動化測序自動化測序特點特點原理同末端終止法原理同末端終止法標記物為熒光染料標記物為熒光染料激光掃描自動測序激光掃描自動測序結(jié)果清晰、準確、分辨率高結(jié)果清晰、準確、分辨率高測序速度快測序速度快 200bp/h.0.21.22三、三、3種方法的比較種方法的比較 化學法沒有末端終止法應用廣泛，但有一個明化學法沒有末端終止法應用廣泛，但有一個明顯的優(yōu)點，即所測序列來自原顯的優(yōu)點，即所測序列來自

10、原DNA分子而不是酶促分子而不是酶促合成反應所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學法可以對合合成反應所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學法可以對合成的寡核苷酸進行測序，可以分析諸如甲基化等成的寡核苷酸進行測序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，不能通過化學保護及修飾干擾實修飾的情況，不能通過化學保護及修飾干擾實驗來研究驗來研究DNA二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。的相互作用。.23Maxam-Gilbert法只需簡單化學試劑。法只需簡單化學試劑。所測序列來自原所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成反應所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化分子而不是酶促合成反應所產(chǎn)生的拷貝，因此利用化學法可以對合成的寡核

11、苷酸進行測序，可以分析諸如甲基學法可以對合成的寡核苷酸進行測序，可以分析諸如甲基化等化等DNA修飾的情況。修飾的情況。但所能測定的長度要比但所能測定的長度要比Sanger法法短一些，它對放射性標記末端短一些，它對放射性標記末端 250個核苷酸以內(nèi)的個核苷酸以內(nèi)的DNA序序列效果最佳。列效果最佳。Sanger 法雖需要單鏈模板和特異寡核苷酸，并需獲得大法雖需要單鏈模板和特異寡核苷酸，并需獲得大腸桿菌腸桿菌DNA 聚合酶聚合酶IKlenow 片段的高質(zhì)量酶制劑，而隨片段的高質(zhì)量酶制劑，而隨著著M13 噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引噬菌體和噬菌粒載體的發(fā)展，也由于現(xiàn)成的合成引物容易獲得

12、及測序反應日期完善，雙脫氧鏈終止法如今遠物容易獲得及測序反應日期完善，雙脫氧鏈終止法如今遠比比Maxam-Gilbert法應用得廣泛。法應用得廣泛。由于由于Sanger法既簡便又快速，目前大多數(shù)測序策略都是法既簡便又快速，目前大多數(shù)測序策略都是為為Sanger法而設計的。法而設計的。 .24 DNA自動測序與手工測序的不同點自動測序與手工測序的不同點1）標記物不同：手工測序采用放射性核素標記，而自動測）標記物不同：手工測序采用放射性核素標記，而自動測序采用序采用4種熒光染料分別標記種熒光染料分別標記ddNTP或標記引物或標記引物2) 加樣方式不同：手工測序，一個樣品的加樣方式不同：手工測序，一

13、個樣品的4個測序反應物分個測序反應物分別在不同泳道進行，而自動測序可在一個泳道內(nèi)電泳別在不同泳道進行，而自動測序可在一個泳道內(nèi)電泳3) 檢測手段不同：手工測序采用放射自顯影，從檢測手段不同：手工測序采用放射自顯影，從4種寡聚核種寡聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出苷酸的梯子形圖譜中讀出DNA序列，而自動測序則采用序列，而自動測序則采用激光掃描器同步掃描，計算機進行閱讀和編輯激光掃描器同步掃描，計算機進行閱讀和編輯.25四、四、DNA序列測定的應用序列測定的應用1) 測序測序 PCR克隆測序驗證 突變體檢測 新基因測序 全基因組測序 系統(tǒng)發(fā)育及物種鑒定2) 2) 片段分離片段分離 個體識別：親緣鑒定 S

14、NP關(guān)聯(lián)分析 疾病診斷等.2626一、在線分析的核心網(wǎng)站一、在線分析的核心網(wǎng)站http:/bip.weizmann.ac.il/tools/#primaryhttp:/www.ebi.ac.uk/embl/http:/www.ddbj.nig.ac.jp/二、本地分析的重要軟件二、本地分析的重要軟件Vector NTI Suite 6.0及以上的版本：綜合分析、載體分析。及以上的版本：綜合分析、載體分析。DNA Star：綜合分析：綜合分析Primer Premier 5.0：引物設計：引物設計Oligo 7：寡核苷酸分析，引物計算：寡核苷酸分析，引物計算GCG：蛋白質(zhì)、核酸序列：蛋白質(zhì)、核酸序列2 2、核苷酸序列的生物信息分析、核苷酸序列的生物信息分析.27西南大學生物技術(shù)專業(yè) 基因工程271) Genbank序列檢索序列檢索.28氨基酸序列同源性分析.29堿基序列同源性.30分子進化樹分析親緣性關(guān)系 HUN0801 JS080