免疫透射比濁法

1、免疫透射比濁法一、原理當(dāng)光線通過一個(gè)渾濁介質(zhì)溶液時(shí)，由于溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收一部分，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比，這種測(cè)定光吸收量的方法稱為透射比濁法。這一方法早于1959 年 Schultre 和 Schuick等報(bào)道應(yīng)用于血漿蛋白與其抗體結(jié)合后形成復(fù)合物，導(dǎo)致濁度的改變，再進(jìn)行透射比濁測(cè)定，一般采用抗體對(duì)抗原定量的透射比濁法， 稱為免疫透射比濁法。 其原理是，利用抗原和抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物，通過測(cè)定復(fù)合物形成量的多少對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定量的方法。在介質(zhì)溶液中，抗原與特異性抗體在一定條件下才能形成復(fù)合物，一定的條件包括：對(duì)抗體的要求，作為體液或組織中蛋白質(zhì)種類很多，若要快速特

2、異檢測(cè)， 要求有單價(jià)特異抗體才能與抗原形成復(fù)合物。某一種蛋白質(zhì)， 有其特異抗體才能與該抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物進(jìn)行定量，若抗體不純混雜有另一種或兩種少量的抗體，這種免疫復(fù)合物就不是單一復(fù)合物而是大雜燴，結(jié)果偏高；抗原抗體比例適當(dāng)，因免疫復(fù)合物形成有三個(gè)階段，第一階段是復(fù)合物形成抗原抗體復(fù)合物；第二階段是初步形成抗原抗體復(fù)合物，此階段是復(fù)合物交聯(lián)成大的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)；第三階段是復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀。只有在抗原與抗體等價(jià)時(shí)即無過剩抗體，此時(shí)，復(fù)合物的結(jié)合與解離處于平衡狀態(tài)，其混濁程度達(dá)高峰。在抗體過量時(shí)，隨抗原量的增加而復(fù)合物形成也增加，其測(cè)定只能在反應(yīng)曲線的左側(cè)進(jìn)行（見圖18-4 ）；一般要求溶液

3、中有非離子性親水多聚體促進(jìn)免疫復(fù)合物的形成，如聚二乙醇 6000 等。溶液 pH 為 6.5 8.0 之間為宜。載脂蛋白有形成兩性螺旋片（amphipathichelix ）的特性，對(duì)脂質(zhì)（特別是磷脂）有高度親和力，與脂質(zhì)結(jié)合后有時(shí)會(huì)掩蓋抗原位點(diǎn)或構(gòu)象改變，可以部分或完全喪失對(duì)抗血清的特異反應(yīng)。為此，載脂蛋白檢測(cè)過程中有必要先暴露抗原位點(diǎn)，所用試劑有表面活性劑，尿素，鹽酸胍和吐溫等解離蛋白劑，或用四甲基脲脫脂或有機(jī)溶劑脫脂等暴露抗原決定簇等方法，血清脂蛋白顆粒中的載脂蛋白，能在短時(shí)間內(nèi)形成抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行定量；抗原不能過量，因?yàn)榭乖^量，抗原抗體復(fù)合物形成不但不增加，反而會(huì)減少，光散射或光吸

4、收減少，檢測(cè)結(jié)果反而偏低。1 / 8圖 18-4 抗原抗體反應(yīng)曲線在免疫比濁過程中，由于抗原抗體結(jié)合的三過程，從而導(dǎo)致光密度與濃度之間不呈線性關(guān)系，一般是3 次方程曲線關(guān)系。若將抗原與抗體兩個(gè)變量之間的變動(dòng)特征恰當(dāng)?shù)胤从吵鰜恚枰?jīng)過3 次方程擬合成近似直線化的曲線方程，再進(jìn)行運(yùn)算，免疫比濁中，采用終點(diǎn)法或速率法，用5 個(gè)或 7 個(gè)不同梯度進(jìn)行定標(biāo)，經(jīng) 3 次曲線方程求出一條能反映真實(shí)情況的濃度與光密度的關(guān)系曲線方程，才能作為定量的工作曲線。二、血清 ApoA （ B100 ）透射比濁測(cè)定法脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒，分散于溶液介質(zhì)中，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定其混濁程

5、度，進(jìn)行ApoA （ B100 ）的定量測(cè)定。（一）手工操作1原理血清 ApoA （ B 100 ） +抗人 ApoA （ B100 ） 抗原抗體復(fù)合物 測(cè)定光密度2試劑（伊利康）（1 ）Apo 緩沖液（ R），含4%PEG6000和表面活性劑（2 ）羊抗人 ApoA （ B 100 ）抗體液（ R）：監(jiān)用前取抗血清200l，加 0.9%NaCl液 700l，混勻，待用，置冰箱一周內(nèi)有效。（3 ）ApoA （ B 100 ）參考血清（ R ）2 / 83操作（ 1 ）按 ApoA 抗血清液或 ApoB 100 抗血清 100l，加相應(yīng)的 Apo 緩沖液 0.9ml 的比例混合成單一試劑（ Ap

6、o 抗體液）。最好臨用前配制當(dāng)天用量。（ 2 ）各試劑用量如下表ApoA ApoB 100標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管空白管參考血清5l5l待測(cè)血清5l5lApoA 抗體液1.0ml1.0ml1.0mlApoB 100 抗體液1.0ml1.0ml1.0ml混勻各管， 37 保溫 10min ，波長(zhǎng) 340min ，于半自動(dòng)分析儀上先吸入空白管液，再吸入標(biāo)準(zhǔn)管，儀器根據(jù)光密度及參考值得出一換算系數(shù)，再吸入測(cè)定管，儀器內(nèi)根據(jù)光密度及系數(shù)進(jìn)行運(yùn)算，打印結(jié)果。（ 3 ）定標(biāo)方法，根據(jù)免疫比濁法原理，應(yīng)取多點(diǎn)（ 3 9 點(diǎn)），按 y=a+bx+cx 2 +dx 3 的 3 次方程回歸曲線進(jìn)行定標(biāo)，制作

7、參考工作曲線。校正工作曲線的繪制：配制抗血清稀釋工作液：按 R 試劑 0.9ml ，加 R 試劑 100l的比例（ Apo 抗體液）混勻，待用。制備 5 點(diǎn)校正液：取 R （參考血清），用0.9% 生理鹽水倍比稀釋成5 個(gè)濃度，第5 管為原參考血清濃度，其他4 管分別為第5 管的 1/2 、1/4 、 1/8、 1/16 （或濃度為0 即 0.9%NaCl ）。表 18-20標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的各管（點(diǎn)）濃度管號(hào)123451號(hào)管（ 0 ）（ l）52號(hào)管（ 1/8 ）（ l）53號(hào)管（ 1/4 ）（ l）54號(hào)管（ 1/2 ）（ l）55號(hào)管（ 1/1 ）（ l）5Apo 抗體液（ ml）1.01.

8、01.01.01.0混勻各管，置37 水浴保溫10min ，按程序上機(jī)作工作曲線。標(biāo)本測(cè)定：吸待測(cè)血清（測(cè)定管）5l，加上述稀釋抗血清工作液1.0ml ，于 37 水浴保溫10min ，上機(jī)讀數(shù)，打印結(jié)果。如測(cè)定值超過工作曲線上限值，儀器會(huì)打印顯示“過高 ”，此時(shí)，將待測(cè)標(biāo)本稀釋1 倍再測(cè)。3 / 8每批號(hào)的抗血清應(yīng)作一次多點(diǎn)定標(biāo)，即測(cè)定標(biāo)本的抗血清應(yīng)與定標(biāo)的抗血清是同一批號(hào)抗血清。（二）生化分析儀測(cè)定1原理脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒分散于溶液介質(zhì)中，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定其混濁程度，進(jìn)行ApoA （ B100 ）的定量測(cè)定。ApoA （ B100 ）+ 抗人Apo

9、A （B 100 ） 抗原抗體復(fù)合物 測(cè)定吸光光密度2雙試劑單（雙）波長(zhǎng)法（1 ）試劑（溫州伊利康）R： Apo 緩沖液，含4% PEG6000和表面活性。R：羊抗人ApoA （ B100 ）稀釋抗血清R： Apo 定值血清（2 ）各試劑及標(biāo)本用量如下表：Apo 緩沖液ApoA 抗血清液ApoB 100 抗血清液項(xiàng)目血清（R）（ R）（R）ApoA 2 5l300 350l80 100lApoB 1002 5l300 350l80- 100l（3 ）定標(biāo)：以 5 點(diǎn) Apo 梯度濃度，采用免疫定標(biāo)法按表18-21參數(shù)上機(jī)定標(biāo)，如圖 18-5 所示。圖 18-5ApoA 五點(diǎn)免疫定標(biāo)曲線圖（以C

10、L-7200儀器為例）（4 ）上機(jī)（終點(diǎn)法或兩點(diǎn)法）4 / 8（ 5 ）說明： Apo 測(cè)定的光密度從 340 700nm 范圍都可采用，多用 340nm ；國(guó)內(nèi)已有的 Apo 試劑盒均無需處理；血清標(biāo)本也無需處理，均可直接檢測(cè)；本法適用于多種類型的全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，自動(dòng)扣除空白，快速準(zhǔn)確；效價(jià)不同的抗血清，其用量應(yīng)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。(5)計(jì)算 A=A2-A1, 以 A 值采用免疫定標(biāo)自動(dòng)運(yùn)算。3.單一試劑單波長(zhǎng)法(1)試劑同雙試劑法(2)標(biāo)本及試劑用量 :按 ApoA 抗血清液或 ApoB 抗血清液 (R )100 加l,相應(yīng)的 Apo 緩沖液 (R )0.3ml 的比例混合成單一試劑 (A

11、po 抗體液 )。最好臨用前配制當(dāng)天用量 ,此抗體液置 2 8保存一周有效。（3）定標(biāo)：按五點(diǎn)梯度稀釋定值血清（見表18-21 ），以終點(diǎn)法或兩點(diǎn)法進(jìn)行免疫定標(biāo)。（4）按以下步驟操作：（5 ）以 A=A2-A1 值按免疫定標(biāo)自動(dòng)運(yùn)算。（6 ）說明：該法一般用半自動(dòng)生化分析儀；通過設(shè)延遲時(shí)間以扣除空白；R、 R 試劑以臨用時(shí)混合為好，未用完的混合試劑應(yīng)置于2 8冰箱保存，只允許使用一周；血清標(biāo)本無需再處理。4.ApoA 、 A 、 B 、 C、 C 和 E 的全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)的有關(guān)數(shù)據(jù)。（ 1 ）上機(jī)參數(shù)（以 CL-7200 型為例）如表 18-21 所示。表 18-21 自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)

12、 Apo 有關(guān)參數(shù)ApoA ABC C E反應(yīng)類型終 點(diǎn)法樣品量3l3l3l8l3l5l600nm （第一）數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)700nm700nm700nm測(cè)量波長(zhǎng)700nm （第二）數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)340nm340nm340nm第一波長(zhǎng) 5min數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)反應(yīng)時(shí)間第二波長(zhǎng) 4.99min數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)試劑350l290l350l300l290l350l試劑100l75l100l50l75l50l單位g/Lg/Lg/Lmg/dlmg/dlmg/dl5 / 8標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)數(shù)555555（ 2 ）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備參數(shù)如表 18-22 所示。表 18-22 生化分析儀檢測(cè) Apo 的定標(biāo)濃度標(biāo)準(zhǔn)管號(hào)1234

13、56稀釋倍數(shù)01：21： 41： 81： 160ApoA 度數(shù) (g/L)172864321.510.80ApoA 度數(shù) (g/L)361894.52.250ApoB 濃度 (g/L)1809145.522.611.30ApoC 濃度 (mg/dl)4210.50.250ApoC 濃度 (mg/dl)52.51.250.630.310ApoE 濃度 (mg/dl)1052.51.250.62505單一試劑和雙試劑檢測(cè)方法的比較單一試劑和雙試劑在全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定的光密度變化過程，如圖18-6 所示。從理論上考慮任何一種生化測(cè)定方法的試劑，臨用時(shí)混合最好，可以消除試劑各種成份的自身化學(xué)變化和相

14、互影響。而在實(shí)際工作中，是不可能的，只能是將幾種不會(huì)起化學(xué)反應(yīng)而又無相互影響的試劑配制成 2 4 種，臨用時(shí)按一定比例配制使用。臨床化學(xué)試劑盒，目前主要以1 或 2 種試劑形式供醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)使用，即單一試劑和雙試劑兩種形式。筆者認(rèn)為雙試劑比單一試劑好，尤其是含酶試劑和免疫試劑以雙試劑包裝形式為好，有利于對(duì)酶的活性或抗體效價(jià)的保存。單一試劑是所有試劑混合在一起，存放過程中，有可能因化學(xué)物質(zhì)的存在而損害試劑中的工具酶或抗體，存放時(shí)間越長(zhǎng)，損害可能性越大，然而雙試劑不存在這一問題。對(duì)脂質(zhì)的測(cè)定雙試劑法更顯其優(yōu)越性，因?yàn)檠逯兄|(zhì)與載脂蛋白是以脂蛋白的形式存在，當(dāng)測(cè)定試劑與血清標(biāo)本混合后，首先解聯(lián)脂蛋白，

15、讓其釋放出脂質(zhì)和載脂蛋白，。作為免疫測(cè)定試劑還兼有使載脂蛋白抗原決定簇暴露的作用。當(dāng)R1試劑作用完后，加進(jìn)第二試劑（R2 ）后，使其抗體適應(yīng)抗原決定簇的要求，達(dá)到抗原抗體結(jié)構(gòu)呈完全的互補(bǔ)狀態(tài)，從而產(chǎn)生最大的抗原抗體結(jié)合量，達(dá)到定量的目的。雙試劑測(cè)定法，既能自動(dòng)扣去空白，又能使化學(xué)反應(yīng)快速進(jìn)行，從而迅速地完成檢測(cè)的全過程。6 / 8圖 18-6單雙試劑法反應(yīng)過程的光密度變化曲線圖A ：雙試管法； B ：為單一試劑法（賀小玲胡漢寧）參考文獻(xiàn)1劉秉文 .血漿載脂蛋白的免疫測(cè)定及應(yīng)用，見王克勤主編，脂蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化，北京：人民衛(wèi)生出版社， 1995 ： 3622 FagerG.WiklundO.e

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