第三章 中藥藥物分析方法

1、第三章第三章 中藥藥物分析方法中藥藥物分析方法藥物分析教研室 控制中藥質(zhì)量，對保證中醫(yī)臨床用藥安全、合控制中藥質(zhì)量，對保證中醫(yī)臨床用藥安全、合理、有效、可靠極為重要。而中藥中有效成分含量理、有效、可靠極為重要。而中藥中有效成分含量的多少與其質(zhì)量優(yōu)劣有直接關(guān)系，另一方面，含有的多少與其質(zhì)量優(yōu)劣有直接關(guān)系，另一方面，含有毒劇成分的中藥，只有嚴(yán)格控制其毒劇成分的含量，毒劇成分的中藥，只有嚴(yán)格控制其毒劇成分的含量，才能確保臨床用藥的安全和有效。因此，中藥成分才能確保臨床用藥的安全和有效。因此，中藥成分的定量分析是中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的核心部分，亦是的定量分析是中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的核心部分，亦是質(zhì)量控制中最能

2、有效考察中藥材內(nèi)在質(zhì)量的項(xiàng)目，質(zhì)量控制中最能有效考察中藥材內(nèi)在質(zhì)量的項(xiàng)目，同時(shí)也是中藥穩(wěn)定性考察的依據(jù)。同時(shí)也是中藥穩(wěn)定性考察的依據(jù)。方法方法學(xué)考學(xué)考察察提取條件的考察提取條件的考察測定方法與條件的選擇測定方法與條件的選擇定量分析方法驗(yàn)證定量分析方法驗(yàn)證第一節(jié)第一節(jié) 中藥藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證中藥藥物分析方法學(xué)驗(yàn)證 定量分析方法驗(yàn)證定量分析方法驗(yàn)證內(nèi)容包括內(nèi)容包括準(zhǔn)確度、精密度準(zhǔn)確度、精密度線性與范圍線性與范圍專屬性、檢測限、定量限專屬性、檢測限、定量限耐用性耐用性第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)分析法化學(xué)分析法 重量分析法：揮發(fā)法、萃取法和沉淀法重量分析法：揮發(fā)法、萃取法和沉淀法 酸堿滴定法酸堿滴定法 滴定分

3、析法滴定分析法 沉淀滴定法沉淀滴定法 配位滴定法配位滴定法 氧化還原滴定法氧化還原滴定法 重量分析法重量分析法標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液化學(xué)計(jì)量關(guān)系化學(xué)計(jì)量關(guān)系指示劑指示劑被測物質(zhì)被測物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液待測溶液待測溶液 滴定分析法滴定分析法 第三節(jié)第三節(jié) 紫外紫外-可見分光光度法的應(yīng)用可見分光光度法的應(yīng)用一、原理一、原理Lambert-Beer Lambert-Beer 定律：定律： 當(dāng)入射光波長一定時(shí)，待測溶液的吸光度當(dāng)入射光波長一定時(shí)，待測溶液的吸光度A A與其濃度和與其濃度和液層厚度成正比，液層厚度成正比，即即k k 為比例系數(shù)，與溶液性質(zhì)、溫度和入射波長有關(guān)。為比例系數(shù)，與溶液性質(zhì)、溫度和入射

4、波長有關(guān)。 當(dāng)濃度以當(dāng)濃度以 g/L g/L 表示時(shí)，稱表示時(shí)，稱 k k 為吸光系數(shù)，以為吸光系數(shù)，以 a a 表表示，即示，即 當(dāng)濃度以當(dāng)濃度以mol/Lmol/L表示時(shí)，稱表示時(shí)，稱 k k 為摩爾吸光系數(shù)，以為摩爾吸光系數(shù)，以 表示，即表示，即 比比 a a 更常用。更常用。 越大，表示方法的靈敏度越高。越大，表示方法的靈敏度越高。 與波長有關(guān)，因此，與波長有關(guān)，因此， 常以常以 表示。表示。kbcA abcA bcA二、定量分析二、定量分析1. 1. 單組份定量分析法的應(yīng)用單組份定量分析法的應(yīng)用（1 1）吸收系數(shù)法）吸收系數(shù)法 根據(jù)根據(jù)BeerBeer定律定律A=A=clcl，若，若

5、l l和吸光系數(shù)和吸光系數(shù)或或 已知，即可根據(jù)測得的已知，即可根據(jù)測得的A A求出被測物的濃求出被測物的濃度。度。clAC%11cmE（2 2）工作曲線法）工作曲線法 從標(biāo)準(zhǔn)品吸光度從標(biāo)準(zhǔn)品吸光度- -濃度曲線求得樣濃度曲線求得樣品溶液的濃度。品溶液的濃度。 KCAKCA或（3 3）對照品對照法）對照品對照法 C C樣樣=C=C標(biāo)標(biāo) A A樣樣/A/A標(biāo)標(biāo)； C C標(biāo)標(biāo) A A樣樣/ /（A A標(biāo)標(biāo) C C 樣樣）= =樣品樣品% % C C樣樣和和C C標(biāo)標(biāo)分別為樣品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為樣品濃度和標(biāo)準(zhǔn)品濃度 C C 樣樣為樣品標(biāo)示濃度。為樣品標(biāo)示濃度。（四）示例（四）示例 例：B12樣品2

6、5.0mg用水溶成1000ml后，盛于1cm洗手池，在361nm處測得吸光度A為0.507，則：%00.982072028%100(%)8 .2020025. 0507. 0%1cm1%1cm112%11標(biāo)樣）（）樣品EEBClAEcm2. 2. 解方程組法解方程組法 由于吸光度具有加合性，因此可以在同一試樣中測定多個(gè)組份。由于吸光度具有加合性，因此可以在同一試樣中測定多個(gè)組份。 設(shè)試樣中有兩組份設(shè)試樣中有兩組份 X X 和和 Y Y，將其顯色后，分別繪制吸收曲線，會(huì)出現(xiàn)如，將其顯色后，分別繪制吸收曲線，會(huì)出現(xiàn)如圖所示的三種情況：圖所示的三種情況： 圖圖a)a)：X,Y X,Y 組份最大吸收波

7、長不重迭，相互不干擾，可以按兩個(gè)單一組份處理。組份最大吸收波長不重迭，相互不干擾，可以按兩個(gè)單一組份處理。圖圖b)b)和和c) c) ：X,Y X,Y 相互干擾，此時(shí)可通過解聯(lián)立方程組求得相互干擾，此時(shí)可通過解聯(lián)立方程組求得X X和和Y Y的濃度：的濃度：其中，其中，X,Y X,Y 組份在波長組份在波長 1 1 和和 2 2 處的摩爾吸光系數(shù)處的摩爾吸光系數(shù) 可由已知濃度的可由已知濃度的 X, Y X, Y 純純?nèi)芤簻y得。解上述方程組可求得溶液測得。解上述方程組可求得 c cx x 及及 c cy y。 yyxxyxyyxxyxlclcAlclcA2221113. 3. 雙波長法雙波長法 當(dāng)混

8、合物的吸收曲線重迭時(shí)，如右下圖所示，可利用雙波長法來測定。當(dāng)混合物的吸收曲線重迭時(shí)，如右下圖所示，可利用雙波長法來測定。具體做法：將具體做法：將 a a 視為干擾組份，現(xiàn)要測定視為干擾組份，現(xiàn)要測定 b b 組份。組份。a)a) 分別繪制各自的吸收曲線；分別繪制各自的吸收曲線；b)b) 畫一平行于橫軸的直線分別交于畫一平行于橫軸的直線分別交于a a組份曲線上兩點(diǎn)，并與組份曲線上兩點(diǎn)，并與b b組分相交；組分相交；c)c) 以交于以交于 a a 上一點(diǎn)所對應(yīng)的波長上一點(diǎn)所對應(yīng)的波長 1 1 為參比波長，另一點(diǎn)對應(yīng)的為測量波長為參比波長，另一點(diǎn)對應(yīng)的為測量波長 2 2，并對混合液進(jìn)行測量，得到：，

9、并對混合液進(jìn)行測量，得到： A A1 1=A=A1a1a + A + A1b1b + A + A1s1s A A2 2 =A=A2a2a + A + A2b2b + A + A2s2s若兩波長處的背景吸收相同，即若兩波長處的背景吸收相同，即A A1s1s= A= A2s2s二式相減，得，二式相減，得， A=(AA=(A2a2a- A- A1a1a)+( A)+( A2b2b- A- A1b1b) )由于由于 a a 組份在兩波長處的吸光度相等，因此，組份在兩波長處的吸光度相等，因此， A=( AA=( A2b2b- A- A1b1b)=()=( 2b2b- - 1b1b)lc)lcb b從中可

10、求出從中可求出c cb b同理，可求出同理，可求出c ca a. .4.4.導(dǎo)數(shù)光譜法導(dǎo)數(shù)光譜法（1）導(dǎo)數(shù)光譜的特點(diǎn)l 零階光譜的max處，對應(yīng)于奇階導(dǎo)數(shù)光譜（n=1、3、5）的零點(diǎn)和偶階導(dǎo)數(shù)（n=2、4）的極值點(diǎn)（峰或谷），零階導(dǎo)數(shù)的拐點(diǎn)波長，對應(yīng)于奇階導(dǎo)數(shù)光譜的極值點(diǎn)和偶階導(dǎo)數(shù)光譜的零點(diǎn)。l 導(dǎo)數(shù)光譜的極值數(shù)=n+1個(gè)，即隨著導(dǎo)數(shù)階次的增加，極值數(shù)增加，譜帶變窄，變銳，分辨率提高，使重疊的譜帶被分離，譜帶的精細(xì)結(jié)構(gòu)更明顯、更突出，有利于物質(zhì)的鑒別。 （1 1）導(dǎo)數(shù)光譜及其特征）導(dǎo)數(shù)光譜及其特征4、導(dǎo)數(shù)光譜法、導(dǎo)數(shù)光譜法 通常的吸收光譜，其吸收度是波長的函通常的吸收光譜，其吸收度是波長的函

11、數(shù)數(shù)A=CE=CA=CE=C（）。對波長求導(dǎo)，將其）。對波長求導(dǎo)，將其微分微分 數(shù)（數(shù)（d dn nA/dA/dn n）對波長掃描可得導(dǎo)數(shù)光）對波長掃描可得導(dǎo)數(shù)光 譜圖。譜圖。 特征：特征： A.A.導(dǎo)數(shù)光譜的階數(shù)愈高，峰形愈尖銳且數(shù)導(dǎo)數(shù)光譜的階數(shù)愈高，峰形愈尖銳且數(shù) 量亦增多。量亦增多。 B.B.在零階光譜的極大處，其相應(yīng)的奇階光在零階光譜的極大處，其相應(yīng)的奇階光 譜通過零點(diǎn)。在零階光譜的兩拐點(diǎn)處，奇階譜通過零點(diǎn)。在零階光譜的兩拐點(diǎn)處，奇階 導(dǎo)數(shù)光譜為極大或極小。導(dǎo)數(shù)光譜為極大或極小。 C.C.偶階導(dǎo)數(shù)光譜的形狀與零階光譜類似，偶階導(dǎo)數(shù)光譜的形狀與零階光譜類似， 零階光譜的峰值對應(yīng)于偶階導(dǎo)數(shù)

12、光譜的值，零階光譜的峰值對應(yīng)于偶階導(dǎo)數(shù)光譜的值， 零階光譜的拐點(diǎn)在偶階導(dǎo)數(shù)光譜中通過零點(diǎn)。零階光譜的拐點(diǎn)在偶階導(dǎo)數(shù)光譜中通過零點(diǎn)。 D.D.導(dǎo)數(shù)光譜譜帶的極值數(shù)等于導(dǎo)數(shù)階數(shù)加導(dǎo)數(shù)光譜譜帶的極值數(shù)等于導(dǎo)數(shù)階數(shù)加1 1。 高斯曲線及其一至四階導(dǎo)數(shù)曲線高斯曲線及其一至四階導(dǎo)數(shù)曲線 （2 2）定量依據(jù)）定量依據(jù) 若某吸收服從Lambert-beer定律，A=ECL則根據(jù)導(dǎo)數(shù)光譜的定義有： （n=1、2、3）式中L為光積長度，對于給定物質(zhì)在一定波長處為定值，令導(dǎo)數(shù)值為D，則 由此可見，在一定波長處，導(dǎo)數(shù)值D與被測組分濃度C成線性關(guān)系，這是該法的定量依據(jù)。CLdEddAdnnnnnndEdkCCLdEdd

13、AdDnnnn（三）被測組分定量信息（三）被測組分定量信息零階光譜的繪制。在同一坐標(biāo)中繪制被測組分l，常用被測組分對照品溶液和干擾組分的吸收曲線，得零階光譜曲線。微分階數(shù)（n） n越大，分辨越高，但信噪比降低，通常不超過4階，一般由干擾組分吸收曲線形狀而定。導(dǎo)數(shù)光譜繪制 選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL間隔()繪制，為好。愈大，A亦增大，測定靈敏度增大，但分解降低，通常選樣12nm。測定方法 常用工作曲線法，可根據(jù)實(shí)際情況選擇DhDp或Do作為信號參數(shù)。 （4）應(yīng)用與示例）應(yīng)用與示例清宮沖劑中膽酸的二階導(dǎo)數(shù)光譜測定法清宮沖劑中膽酸的二階導(dǎo)數(shù)光譜測定法 （i i）干擾情況的考察）干擾情況的考察 膽酸對照液與樣品的

14、二階導(dǎo)數(shù)光譜顯示，在膽酸對照液與樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜顯示，在397nm397nm，386nm386nm波長處有相應(yīng)的吸收峰和吸收谷。陰性樣品二階導(dǎo)波長處有相應(yīng)的吸收峰和吸收谷。陰性樣品二階導(dǎo)數(shù)光譜呈近乎平直線條，見下左圖。豬去氧膽酸的二階導(dǎo)數(shù)光譜呈近乎平直線條，見下左圖。豬去氧膽酸的二階導(dǎo)數(shù)光譜將數(shù)光譜將360360420nm420nm區(qū)間的吸收消除為二次無關(guān)吸收，不區(qū)間的吸收消除為二次無關(guān)吸收，不干擾樣品中膽酸的含量測定如下中圖。下右圖表明，膽酸干擾樣品中膽酸的含量測定如下中圖。下右圖表明，膽酸二階導(dǎo)數(shù)光譜，其峰二階導(dǎo)數(shù)光譜，其峰- -谷振幅值谷振幅值D D與濃度具有良好的線性關(guān)與濃度具有良好

15、的線性關(guān)系，因此，可用系，因此，可用397nm397nm，386nm386nm兩波長的振幅兩波長的振幅D D為定量參數(shù)，為定量參數(shù)，用峰用峰- -谷法進(jìn)行測定。谷法進(jìn)行測定。 樣品，膽酸對照品溶樣品，膽酸對照品溶 膽酸、豬去氧膽酸二膽酸、豬去氧膽酸二 對照品溶液對照品溶液 液二階導(dǎo)數(shù)光譜液二階導(dǎo)數(shù)光譜 階導(dǎo)數(shù)光譜階導(dǎo)數(shù)光譜 二階導(dǎo)數(shù)光譜二階導(dǎo)數(shù)光譜 A A樣品樣品 1膽酸膽酸 B. B. 膽酸對照品膽酸對照品 C. C.陰性樣品陰性樣品 2 2豬去氧膽酸豬去氧膽酸( () )測定條件：零階光譜掃描波長：測定條件：零階光譜掃描波長：190190550nm550nm；二階導(dǎo)數(shù)光譜掃描波長，二階導(dǎo)數(shù)

16、光譜掃描波長，360360420nm420nm；=5nm=5nm。( () )標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 ：精密稱定膽酸對照品約：精密稱定膽酸對照品約30mg30mg，置，置100ml100ml量瓶中，加入量瓶中，加入6060醋酸稀釋至刻度，分別精醋酸稀釋至刻度，分別精密吸取密吸取0.10.1、0.21.0ml0.21.0ml于于15ml15ml具塞刻度試管中，具塞刻度試管中，加加6060醋酸至醋酸至1.0ml1.0ml，加入稀硫酸，加入稀硫酸14140ml0ml，搖勻，搖勻，7070水浴中放置水浴中放置2020分鐘，取出靜置分鐘，取出靜置2020分鐘后，用分鐘后，用1.0ml 601.0ml 60醋酸

17、加醋酸加14.0ml14.0ml上述稀硫酸作空白，測上述稀硫酸作空白，測二階導(dǎo)數(shù)光譜。中間波長二階導(dǎo)數(shù)光譜。中間波長397nm397nm，386nm386nm，測出各，測出各峰峰- -谷振幅值谷振幅值D D，得回歸方程：，得回歸方程： D= 57.3066C D= 57.3066C 0.1547(r=1 0.1547(r=1. .000)000)( () )樣品測定樣品測定 精密稱取約精密稱取約2.5g2.5g樣品粉末加樣品粉末加50ml50ml氯仿回流提取氯仿回流提取4 4小時(shí)，常壓回收氯仿至干，用小時(shí)，常壓回收氯仿至干，用6060醋酸溶解，定醋酸溶解，定容于容于10ml10ml量瓶中，精密

18、吸取量瓶中，精密吸取1.0ml1.0ml樣品液于樣品液于15ml15ml具具塞刻度試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，測峰塞刻度試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下操作，測峰- -谷振谷振幅值幅值D D，按回歸方程計(jì)算樣品中膽酸含量。，按回歸方程計(jì)算樣品中膽酸含量。本法平均回收率：本法平均回收率：102.9102.9，RSDRSD0.60.6。 5 5、差示光譜法、差示光譜法 （1 1）基本原理）基本原理 差示光譜法的關(guān)鍵有二，其一，提供一個(gè)近似理想的參比溶差示光譜法的關(guān)鍵有二，其一，提供一個(gè)近似理想的參比溶液。其二，使待測組分發(fā)生特征光譜變化，而賦形劑或其他共有液。其二，使待測組分發(fā)生特征光譜變化，而賦形劑或其他

19、共有組分卻不引起光譜變化，因而可消除它們的干擾。組分卻不引起光譜變化，因而可消除它們的干擾。 設(shè)設(shè)A Ax x、A Ay y分別代表兩種不同介質(zhì)中待測組分在測定波長處的分別代表兩種不同介質(zhì)中待測組分在測定波長處的吸收度，吸收度，A Az z代表背景和干擾組分的吸收度，其不受測定介質(zhì)改變代表背景和干擾組分的吸收度，其不受測定介質(zhì)改變的影響。根據(jù)吸收度加和性原理，則的影響。根據(jù)吸收度加和性原理，則 A=AA=A樣樣 - A- A參參=(A=(Ax x +A+Az z)-(A)-(Ay y + A+ Az z)= A)= Ax x - A- Ay y =(=(x x - - y y)CL )CL 差

20、示光譜中的振幅，即最大吸收與最小吸收之差值，也可進(jìn)差示光譜中的振幅，即最大吸收與最小吸收之差值，也可進(jìn)行定量測定，這可提高本法的專屬性。行定量測定，這可提高本法的專屬性。（2 2）應(yīng)用與示例）應(yīng)用與示例 差示光譜法測定含牛黃的中成藥中膽紅素的含量差示光譜法測定含牛黃的中成藥中膽紅素的含量 1 1）測定原理）測定原理 膽紅素具有高度共軛體系結(jié)構(gòu)，在波長膽紅素具有高度共軛體系結(jié)構(gòu)，在波長453nm453nm處為最處為最大吸收，在可見光照射下膽紅素易氧化成藍(lán)色產(chǎn)物，在大吸收，在可見光照射下膽紅素易氧化成藍(lán)色產(chǎn)物，在453nm453nm處吸收度顯著降低。處吸收度顯著降低。 2 2）選用日光下照射）選用

21、日光下照射3030分鐘或在紅外燈下照射分鐘或在紅外燈下照射4 4小時(shí)測小時(shí)測AA值。值。 3 3）精密稱取膽紅素）精密稱取膽紅素2mg2mg于于50ml50ml棕色量瓶中，棕色量瓶中， 加入適量冷加入適量冷(10(10以下以下) )的酸性氯仿的酸性氯仿(150ml(150ml氯氯 仿中含仿中含0.05ml0.05ml濃鹽酸濃鹽酸) )，于冰水浴中超聲振，于冰水浴中超聲振 蕩蕩2020分鐘，稀釋至刻度，制成儲備液。準(zhǔn)分鐘，稀釋至刻度，制成儲備液。準(zhǔn)確確 吸取吸取0 0，4 4、0 08 8、1 1，2 2、1.61.6、2.0ml2.0ml儲備儲備液液 于于10ml10ml量瓶中，加冷酸性氯仿至

22、刻度，測量瓶中，加冷酸性氯仿至刻度，測其其 光照前后在光照前后在453nm453nm處的吸收度?；貧w方程處的吸收度?；貧w方程 膽紅素在酸性氯仿溶液中的吸收光譜膽紅素在酸性氯仿溶液中的吸收光譜 為為A=0.0804C + 0.00570 (r=0.9995)A=0.0804C + 0.00570 (r=0.9995)。 a a光照前光照前 b b光照后光照后 除光照反應(yīng)外，其余操作均需避光。除光照反應(yīng)外，其余操作均需避光。 4 4）分別制得六應(yīng)丸、六神丸、牛黃消炎丸的空白樣品對）分別制得六應(yīng)丸、六神丸、牛黃消炎丸的空白樣品對照液，在照液，在453nm453nm處測得各自光照前后的處測得各自光照前

23、后的A A值，計(jì)算值，計(jì)算AA。實(shí)驗(yàn)表。實(shí)驗(yàn)表明三種成藥明三種成藥AA值為零或幾乎為零。說明其他干擾組分在以上值為零或幾乎為零。說明其他干擾組分在以上光照條件下不干擾膽紅素的測定。光照條件下不干擾膽紅素的測定。 5 5）精密稱取六應(yīng)丸、六神丸各）精密稱取六應(yīng)丸、六神丸各60mg60mg，牛黃消炎丸，牛黃消炎丸120mg120mg置置10ml10ml帶塞的試管中，準(zhǔn)確加入冷酸性氯仿帶塞的試管中，準(zhǔn)確加入冷酸性氯仿10ml10ml，冰水浴中振蕩，冰水浴中振蕩2020分鐘，過濾，棄去初濾液，測續(xù)濾液光照前后的分鐘，過濾，棄去初濾液，測續(xù)濾液光照前后的A A值，算出值，算出AA值。由回歸方程算得樣品的

24、含量。值。由回歸方程算得樣品的含量。 本法加樣回收率：六應(yīng)丸為本法加樣回收率：六應(yīng)丸為98.898.8，RSD=1.8RSD=1.8；六神丸；六神丸為為100.7100.7，RSD=2.2RSD=2.2；牛黃消炎丸為；牛黃消炎丸為93.093.0，RSDRSD1.11.1。、紫外光譜法中對儀器和試劑的要求、紫外光譜法中對儀器和試劑的要求（1）儀器的校正和檢定：包括波長精度、吸收度 的準(zhǔn)確性、 雜散光等。 （2）對溶劑的要求：用1 cm石英池盛裝溶劑，以 空氣為空白，測定其吸光度，溶劑和吸收池 的吸光度在220nm 240nm范圍內(nèi)不得超過 0.40；在241nm 250nm 范圍內(nèi)不得超過 0

25、.20；在251nm 300nm 的范圍內(nèi)不得超過 0.10；300以上不得超過0.05。 紫外分光光度計(jì)紫外分光光度計(jì)0.575光源光源單色器單色器吸收池吸收池檢測器檢測器信號處理及顯示信號處理及顯示第四節(jié)第四節(jié) 熒熒 光光 分分 析析 法法1 1、分子熒光的產(chǎn)生、分子熒光的產(chǎn)生 當(dāng)處于基態(tài)單線態(tài)的分子吸收了一定頻率的紫外可見光后，可以躍遷到激發(fā)單線態(tài)的各個(gè)不同能級，然后經(jīng)過振動(dòng)弛豫到達(dá)第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級，如果以發(fā)射光量子的方式，躍遷回到基態(tài)各個(gè)不同振動(dòng)能級，即產(chǎn)生熒光。2 2、分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系及其影響因素、分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系及其影響因素 熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

26、 分子熒光的產(chǎn)生必須同時(shí)具備2個(gè)條件： 物質(zhì)分子必須具有能吸收一定頻率 紫外可見光的特定結(jié)構(gòu)和有較高的熒光量子效率 影響因素影響因素 溫度、溶劑的粘度、極性和溶液的PH值、熒光猝滅劑、散射光的干擾。3 3、熒光光譜及其特點(diǎn)、熒光光譜及其特點(diǎn)（1 1）熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜）熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜 激發(fā)光譜 測定樣品對每一波長的激發(fā)光所發(fā)射的熒光強(qiáng)度，以激發(fā)光波長為橫座標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱座標(biāo)作圖，得熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。 發(fā)射光譜 從激發(fā)光譜上可找到發(fā)生熒光最強(qiáng)時(shí)的激發(fā)光波長，以此進(jìn)行激發(fā)，將物質(zhì)發(fā)射的熒光通過單色器分光，測定每一個(gè)波長的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對熒光波長作圖，得熒光光譜。 （2 2）熒

27、光光譜的特點(diǎn)）熒光光譜的特點(diǎn) 熒光光譜與其激發(fā)光譜具有鏡像特點(diǎn)。一般熒光的波長比激發(fā)光波長要長些。 4、定量分析方法、定量分析方法 （1 1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 以熒光強(qiáng)度F對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C作工作曲線（或回歸方程）。在相同條件下測定試驗(yàn)樣溶液的熒光強(qiáng)度，由工作曲線（或回歸方程）求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。 （2 2）比例法比例法 取已知量的對照品，配成標(biāo)準(zhǔn)溶液（Cs），測定其熒光強(qiáng)度（Fs），然后在相同條件下測定試樣溶液的熒光強(qiáng)度（Fx），按比例關(guān)系計(jì)算試樣中熒光物質(zhì)的含量。常用空白校正。 5 5、熒光分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)（1）儀器的結(jié)構(gòu) 激發(fā)光原、樣品池、檢測器、濾光片或單色器。（2）

28、儀器的類型目視熒光計(jì)、光電熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì) 二、熒光分析儀器二、熒光分析儀器6 6、應(yīng)用與示例、應(yīng)用與示例l直接熒光法：中藥成分中有的本身具有熒光特征，可經(jīng)提取分離后，用直接法測定。l化學(xué)誘導(dǎo)熒光法：利用氧化還原、水解、縮合、配合、光化學(xué)反應(yīng)等化學(xué)方法，使一些自身不能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒饣衔?，從而用熒光法測定。l制備熒光衍生物：對于無熒光或熒光較弱的物質(zhì)可選擇適當(dāng)?shù)臒晒庠噭┡c其生成具有特異熒光的衍生物，再進(jìn)行測定。l熒光猝滅法：利用某些物質(zhì)可以使熒光物質(zhì)的熒光猝滅的性質(zhì)，間接地測定其含量。 第五節(jié)第五節(jié) 原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法1 1、原子的吸收與發(fā)射、原子的吸收與發(fā)射

29、 原子是由帶正電荷的原子核和帶負(fù)電荷的電子所組成，核外電子按一定的量子軌道繞核旋轉(zhuǎn)，這些軌道呈。分立的層狀結(jié)構(gòu)，每層具有各自確定的能量，稱為原子能級或量子態(tài)。離核越遠(yuǎn)的能級能量越高。通常情況下，電子都處在各自能量最低的能級上，整個(gè)原子的能量最低稱為基態(tài)，基態(tài)原子最穩(wěn)定。 當(dāng)基態(tài)原子受到外界能量(輻射)作用時(shí)，電子就可能吸收能量而向高能級軌道躍遷，此過程就是原子的吸收過程。處于高能態(tài)的原子稱為激發(fā)態(tài)原子。激發(fā)態(tài)原子很不穩(wěn)定，在極短時(shí)間內(nèi)(10-8秒左右)，電子又會(huì)從高能態(tài)躍遷回至基態(tài)，同時(shí)將所吸收的能量以光輻射的形式釋放出來，發(fā)射相應(yīng)的光譜線，這就是原子的發(fā)射過程。 2 2、原子的量子能級和能級

30、圖、原子的量子能級和能級圖（1）光譜項(xiàng) 在原子光譜學(xué)中，原子能級一般用光譜項(xiàng)符號nM LJ表示。光譜項(xiàng)用N、L、S、J四個(gè)量子數(shù)來表征。 n是價(jià)電子的主量子；表示電子層，決定電子能量。 L是總角量子數(shù)，其數(shù)值為外層價(jià)電子角量子數(shù)l的矢量和，即L=li。取值0，1，2，3通常分別用S、P、D、F.表示。 l是角量子數(shù)，電子層形狀。 S是總自旋量子數(shù)，其數(shù)值為各價(jià)電子自旋量子數(shù)s的矢量和，即S=si， J是內(nèi)量子數(shù)。由L和S耦合的結(jié)果，數(shù)值為二者的矢量和，即J=L+S。 （2）能級圖 元素原子的能級通常以原子外層電子能級圖來表示。縱坐標(biāo)表示原子能量E(ev)，將基態(tài)原子的能量定為E=0，能級之間的

31、連線表示價(jià)電子在相應(yīng)能級之間躍遷時(shí)產(chǎn)生的原子光譜線，橫坐標(biāo)是用光譜支項(xiàng)表示的原子實(shí)際所處的能級。 3 3、原子吸收線的輪廓及影響因素、原子吸收線的輪廓及影響因素（1）原子吸收線的輪廓及表征 所謂譜線輪廓是指譜線強(qiáng)度按波長有一分布值。 表征：吸收線的頻率、半寬度、強(qiáng)度（2）影響原子吸收線變寬的因素自然變寬 熱變寬壓力變寬 其他變寬4 4、原子吸收與原子濃度的關(guān)系及定量方法、原子吸收與原子濃度的關(guān)系及定量方法積分吸收系數(shù)峰值吸收系數(shù)原子吸收與原子濃度的關(guān)系5、原子吸收分光光度計(jì)（1）結(jié)構(gòu) 光源光源 原子化器原子化器 分光系統(tǒng)分光系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)光源光源檢測原子原子化器化器分光分光原子原子化器

32、化器分光分光光源光源檢檢測測檢檢測測（2）光源燈 光源的功能是發(fā)射被測元素基態(tài)原子所吸收的特征共振輻射。對光源的基本要求是：發(fā)射輻射的波長半寬度要明顯小于吸收線的半寬度、輻射強(qiáng)度足夠大、穩(wěn)定性好、使用壽命長。 目前最能滿足上述要求的銳線光源是空心陰極燈。（3）原子化器 原子化器的功能是提供能量，使試樣干燥、蒸發(fā)和原子化。入射光束在這里被基態(tài)原子吸收，因此也可把它視為“吸收池”。對原子化器的基本要求：必須具有足夠高的原子化效率；必須具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)形；操作簡單及低的干擾水平等。常用的原子化器有火焰原子化器和非火焰原子化器?；鹧嬖踊魇珷t原子化器 石墨爐原子化法的過程是將試樣注入石墨管中

33、間位置，用大電流通過石墨管以產(chǎn)生高達(dá)2000 -3000的高溫使試樣經(jīng)過干燥、蒸發(fā)和原子化。 石墨爐的基本結(jié)構(gòu)包括：石墨管（杯）(graphite tube)、爐體（保護(hù)氣系統(tǒng)）、電源等三部分組成。工作是經(jīng)歷干燥(dryness)、灰化(incineration)、原子化和凈化(depuration)等四個(gè)階段，即完成一次分析過程。（4 4）其他系統(tǒng)及附件）其他系統(tǒng)及附件（5）原子吸收分光光度計(jì)的類型 單光束原子吸收分光光度計(jì) 雙光束原子吸收分光光度級6.原子吸收分析方法及應(yīng)用（1）原子吸收定量分析方法 配制一組含有不同濃度被測元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在與試樣測定完全相同的條件下，按濃度由低到高的順序

34、測定吸光度值。繪制吸光度對濃度的校準(zhǔn)曲線。測定試樣的吸光度，從校準(zhǔn)曲線上用內(nèi)插法求出被測元素的含量。ACCxAxO7、原子吸收干擾及其抑制l物理干擾（物理干擾（physical interferencephysical interference） 物理干擾是指試液與標(biāo)準(zhǔn)溶液 物理性質(zhì)有差異而產(chǎn)生的干擾。如粘度、表面張力或溶液的密度等的變化，影響樣品的霧化和氣溶膠到達(dá)火焰?zhèn)魉偷纫鹪游諒?qiáng)度的變化而引起的干擾。 消除辦法：配制與被測試樣組成相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液或采用標(biāo)準(zhǔn)加入法。若試樣溶液的濃度高，還可采用稀釋法。 化學(xué)干擾測元素原子與共存組份發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成穩(wěn)定的化合物 電離是化學(xué)干擾的又一重要形式

35、。原子失去一個(gè)或幾個(gè)電子 后形成離子，不產(chǎn)生吸收，所以部分基態(tài)原子的電離會(huì)使吸收強(qiáng)度減弱。這種干擾是某些元素所特有的，對于電離電位6eV的 元素，在火焰中容易電離(表86)，火焰溫度越高，干擾越嚴(yán)重。這種現(xiàn)象在堿金屬和堿士金屬中特別顯著。消除化學(xué)干擾的方法：消除化學(xué)干擾的方法：l 選擇合適的原子化方法選擇合適的原子化方法l 加入釋放劑加入釋放劑l 加入保護(hù)劑加入保護(hù)劑l 加入消電離劑加入消電離劑l 加入緩沖劑加入緩沖劑l電離干擾電離干擾 在高溫條件下，原子會(huì)電離，使基態(tài)原子數(shù)減少，吸光度下降，這種干擾稱為電離干擾。 消除方法是加入過量的消電離劑。消電離劑是比被測元素電離電位低的元素，相同條件下

36、消電離劑首先電離，產(chǎn)生大量的電子，抑制被測元素的電離。l光學(xué)干擾光譜線干擾 是指原子光譜對分析線干擾，分為非吸收線未能被單色器分離和吸收線重疊。背景干擾 是一種非原子性吸收，包括分子吸收干擾和光散射、折射。第六節(jié) 高效液相色譜法1 1、基本原理、基本原理（1 1）基本理論和術(shù)語）基本理論和術(shù)語 色譜法是一種分離技術(shù)。 混合物分離過程：試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配。 一相固定不動(dòng)，稱為固定相。 另一相是攜帶試樣混合物流過固定相的流體(氣體或液體)，稱為流動(dòng)相。 原理：原理：是溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間進(jìn)行的一種連續(xù)多次交換過程。它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或

37、分子大小不同而引起的排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離。 基線基線 無試樣通過檢測器時(shí)，檢測無試樣通過檢測器時(shí)，檢測到的信號即為基線。到的信號即為基線。保留值保留值 A.A.時(shí)間表示的保留值時(shí)間表示的保留值 保留時(shí)間保留時(shí)間( (t tR R) )：組分從進(jìn)：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時(shí)所需的時(shí)間；時(shí)間；（動(dòng)畫）（動(dòng)畫） 死時(shí)間死時(shí)間( (t tM M) )：不與固定相作用的氣體：不與固定相作用的氣體( (如空氣如空氣) )的保留時(shí)的保留時(shí)間；間； 調(diào)整保留時(shí)間（調(diào)整保留時(shí)間（t tR R ）：）：t tR R= = t tR Rt tM M B.B.用體積表示

38、的保留值用體積表示的保留值 保留體積（保留體積（V VR R）：）： V VR R = = t tR Rq qv vq qv v為柱出口處的載氣流量，為柱出口處的載氣流量，單位：單位：m L / minm L / min。 死體積（死體積（V VM M）：）： V VM M = = t tM M q qv v 調(diào)整保留體積調(diào)整保留體積( (V VR R) )： V V R R = = V VR R V VM M 相對保留值r21 組分組分2 2與組分與組分1 1調(diào)整保留值之比：調(diào)整保留值之比： r r2121 = = t t R R2 2 / / t t R R1 1= = V V R R2

39、2 / / V V R R1 1 相對保留值只與柱溫相對保留值只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他和固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他色譜操作條件無關(guān)，它表示色譜操作條件無關(guān)，它表示了固定相對這兩種組分的選了固定相對這兩種組分的選擇性。擇性。區(qū)域?qū)挾?衡量色譜峰寬度的參數(shù)，三種衡量色譜峰寬度的參數(shù)，三種表示方法：表示方法：A.A.標(biāo)準(zhǔn)偏差標(biāo)準(zhǔn)偏差( ( ) )：即：即0.6070.607倍峰高倍峰高處色譜峰寬度的一半。處色譜峰寬度的一半。B.B.半峰寬半峰寬( (Y Y1/21/2) )：色譜峰高一半處：色譜峰高一半處的寬度的寬度 Y Y1/21/2 =2.354 =2.354 。C.C.峰底寬峰底寬( (W

40、 Wb b) )：W Wb b=4 =4 。（2 2）分離度及其影響因素）分離度及其影響因素 塔板理論和速率理論都難以描述難分離質(zhì)對的實(shí)際分離程度。即柱效為多大時(shí)，相鄰兩組分能夠被完全分離。 難分離物質(zhì)對的分離度大小受色譜過程中兩種因素的綜合影響：保留值之差色譜過程的熱力學(xué)因素； 區(qū)域?qū)挾壬V過程的動(dòng)力學(xué)因素。 色譜分離中的四種情況如圖所示： 柱效較高，K(分配系數(shù))較大，完全分離。 K不是很大，柱效較高，峰較窄，基本分離。柱效較低，K較大，但分離的不好。 K小，柱效低，分離效果更差。分離度的表達(dá)式：6991)(2)(2)1(21)2(211R2R1b2b1R2R/YY.ttWWttR R=0

41、.8：兩峰的分離程度可達(dá)89%；R=1.0：分離程度98%；R=1.5：達(dá)99.7%（相鄰兩峰完全分離的 標(biāo)準(zhǔn)）分離度基本關(guān)系式分離度基本關(guān)系式：1141kknR有效nkkn2)1(141有效nRl分離度與柱效 分離度與柱效 (n) 的平方根成正比，r21一定，增加柱效，可提高分離度。但通過增加柱長來增加 n 使組分保留時(shí)間增加且峰擴(kuò)展，分析時(shí)間長。l分離度與r21 增大r21是提高分離度的最有效方法，計(jì)算可知，在相同分離度下，當(dāng)r21增加一倍，需要的n有效減小10000倍。 增大r21的最有效方法是選擇合適的固定液。2 2、主要分離分析方法、主要分離分析方法（1）吸附色譜法（2）正相色譜法（

42、3）反相色譜法 一般反相色譜法 反相離子對色譜 反相離子抑制色譜3 3、高效液相色譜儀、高效液相色譜儀（1）高壓輸出系統(tǒng)（2）進(jìn)樣系統(tǒng)（3）分離系統(tǒng)（4）檢測系統(tǒng)（5）記錄系統(tǒng)系統(tǒng)4 4、高效液相色譜法實(shí)驗(yàn)條件的選擇、高效液相色譜法實(shí)驗(yàn)條件的選擇（1 1）色譜柱的選擇）色譜柱的選擇硅膠柱：用于苯、萘、聯(lián)苯及菲的混合物的分離。ODS（C18）柱：同硅膠柱，但需乙醇配制。氰基與氨基柱：用于偶氮苯、氧化偶氮苯及硝基苯 的混合物的分離。強(qiáng)堿性陰離子交換柱：可用于鄰、間、對苯二甲酸的混合物的分離。強(qiáng)酸性陽離子交換柱：用于芳胺、吡啶及8-羥基喹啉的混合物的分離。(2)(2)流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相的選擇 在選擇

43、溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)， 采用正相液-液分配分離時(shí)，首先選擇中等極性溶劑， 若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加， 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保 留時(shí)間縮短。 常用溶劑的極性順序常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)（3 3）前處理方法）前處理方法l 液-液萃取分離(LLE) 有機(jī)溶劑直接萃取法與離子對萃取法。樣品萃取后需將溶液相過濾，加無水硫酸鈉干燥、蒸發(fā)、濃縮、定容后才可使用。l 液-固萃取分離(LSE

44、) 方法簡介： 本法是用液相色譜的原理來處理樣品的一種方法。在一小柱中裝上固體萃取劑，將樣品上柱后，藥物在柱上保留，用選好的溶劑清洗除去雜質(zhì)后，再將藥物從柱上洗脫下來。 親脂性鍵合相硅膠： C18是最常用的固體萃取劑，適用于萃取、純化水基質(zhì)體液中親脂性藥物。（4）系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾銀子等四個(gè)指標(biāo)。其中，分離度和重復(fù)性是系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中更具實(shí)用意義的參數(shù)（5 5）應(yīng)用示例）應(yīng)用示例l 定性分析方法：（i）保留時(shí)間 保留時(shí)間(tR) 死時(shí)間(t0)：在反相HPLC中可用苯磺酸鈉來測定死時(shí)間。 調(diào)整保留時(shí)間(tR )： tRtR - t0 在實(shí)

45、驗(yàn)條件一定時(shí)，調(diào)整保留時(shí)間只決定于組分的性質(zhì)。（ii）保留體積 保留體積(VR)：VR = tRFc，F(xiàn)c為流動(dòng)相 的流速 死體積(Vo)： 調(diào)整保留體積 ( )VR - VoRVl定量分析方法 HPLC定量分析的參數(shù)是色譜峰高和峰面積，定量依據(jù)是樣品中組分的量(或濃度)與峰高或峰面積成正比。常用的定量方法有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法和內(nèi)加法。（i i）峰高和峰面積）峰高和峰面積正常峰面積正常峰面積 ： A=1.065Wh/2A=1.065Wh/2h h 不對稱峰的面積可用平均峰寬不對稱峰的面積可用平均峰寬來計(jì)算：來計(jì)算： A A1/2(W0.15h + W0.85h) 1/2(W0.15h + W0.8

46、5h) h h 一般說來，當(dāng)分離度小或流量一般說來，當(dāng)分離度小或流量波動(dòng)波動(dòng) 時(shí)，常用峰高定量。當(dāng)峰形不時(shí)，常用峰高定量。當(dāng)峰形不正或色譜正或色譜 柱超負(fù)荷時(shí)，用峰面積定量。柱超負(fù)荷時(shí)，用峰面積定量。（ii）外標(biāo)法 用與待測組分同質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品作對照品，以對照品的量對比求算試樣含量的方法稱為外標(biāo)法。外標(biāo)法是HPLC常用定量分析方法之一。分為外標(biāo)工作曲線法和外標(biāo)一點(diǎn)法 （iii）內(nèi)標(biāo)法 選擇適宜的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，以待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰高比或峰面積比求算試樣含量的方法稱為內(nèi)標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。內(nèi)標(biāo)法可以分為工作曲線法、內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法、內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法及校正因子法等。（iiii）內(nèi)加法 將待測組

47、分i的純品加至待測樣品溶液中，測定增加純品后的溶液比原樣品溶液中i組分的峰面積增量，求算i組分的含量。 內(nèi)加法定量分析計(jì)算公式如下： mi =（Ai /Ai）mi 式中mi是純物質(zhì)i的加入量，Ai是相應(yīng)增加的峰面積。第七節(jié)第七節(jié) 薄層掃描分析法薄層掃描分析法1、基本原理 薄層掃描法是指薄層色譜斑點(diǎn)的色譜掃描，薄層色譜掃描是指固定波長，斑點(diǎn)移動(dòng)，測定A-l或F-l曲線。根據(jù)薄層掃描的測定方式分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法二種方法。薄層吸收掃描法薄層吸收掃描法 光源：鎢燈和氘燈； 靈敏度：在200-800nm波長范圍內(nèi)選擇合適波長進(jìn)行測定，其靈敏度可達(dá)ng級； 適用范圍：適用于在可見、紫外區(qū)有

48、吸收的物質(zhì)，及通過色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分。薄層熒光掃描法薄層熒光掃描法 光源：氙燈或汞燈。 靈敏度：最低可測到10-50pg。 適用范圍：適合于本身具有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測定。2 2、定量分析方法、定量分析方法 方法學(xué)考察 常用的定量方法有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、追加法（疊加法）及回歸曲線定量法。l外標(biāo)法外標(biāo)法 外標(biāo)法是薄層色譜掃描最常用的定量方法，方法簡便，但點(diǎn)樣必須準(zhǔn)確。 A.A.外標(biāo)一點(diǎn)法外標(biāo)一點(diǎn)法 工作曲線通過原點(diǎn)（截距為零）時(shí)可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量。 計(jì)算公式為： C=F1A 式中：C為組分的重量或濃度，A為測得該組分的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)。

49、B.B.外標(biāo)二點(diǎn)法外標(biāo)二點(diǎn)法 工作曲線不通過原點(diǎn)時(shí)，只能用外標(biāo)二點(diǎn)法定量。計(jì)算公式為： C=F1A+F2 式中：C、A同前，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為縱坐標(biāo)的截距，F(xiàn)1和F2值由儀器自動(dòng)算出。 l內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)法是選一個(gè)純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，并準(zhǔn)確稱取一定量內(nèi)標(biāo)物加至供試液及標(biāo)準(zhǔn)液中，計(jì)算供試品溶液中某組分含量的定量方法。 l回歸曲線定量法回歸曲線定量法A.將不同濃度（或不同量）的標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試液點(diǎn)在同一塊薄層板上，展開、掃描;B.由計(jì)算機(jī)對所測得的峰面積及相應(yīng)點(diǎn)樣量進(jìn)行線性或非線性回歸;C.直接由回歸方程或回歸曲線計(jì)算供試液含量的方法。 l 追加法追加法 追加法適用于成分復(fù)雜樣品的定

50、量分析，既具有內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn)又不需要內(nèi)標(biāo)物，方法與HPLC的內(nèi)加法類似。第八節(jié)第八節(jié) 氣氣 相相 色色 譜譜 法法原理原理 氣相色譜法（氣相色譜法（GCGC）是將汽化后的試樣由）是將汽化后的試樣由載氣（流動(dòng)相）帶入色譜柱，根據(jù)各組分載氣（流動(dòng)相）帶入色譜柱，根據(jù)各組分在流動(dòng)相和固定相間作用的不同而分離，在流動(dòng)相和固定相間作用的不同而分離，并隨載氣依次流出氣譜柱，經(jīng)檢測器檢測，并隨載氣依次流出氣譜柱，經(jīng)檢測器檢測，利用保留值進(jìn)行定性，色譜峰面積或峰高利用保留值進(jìn)行定性，色譜峰面積或峰高進(jìn)行定量的分析方法。進(jìn)行定量的分析方法。1 1、實(shí)驗(yàn)條件的選擇、實(shí)驗(yàn)條件的選擇分離條件的選擇分離條件的選擇 固定相

51、固定相 柱溫柱溫 載氣載氣（1 1）固定相的選擇）固定相的選擇一般按極性相似的原則來選擇。分離非極性化合物，應(yīng)選非極性固定液，基本上是按沸點(diǎn)順序出柱，低沸點(diǎn)先出柱，若有極性組分，則相同沸點(diǎn)的極性組分先出柱。中等極性化合物，選中等極性固定液，基本上仍按沸點(diǎn)順序出柱，但對沸點(diǎn)相同的極性與非極性組分，誘導(dǎo)力起主要作用，非極性組分先出柱。極性化合物，選用極性固定液，組分按極性順序出柱，極性弱的組分先出柱。分離復(fù)雜樣品，若組分沸點(diǎn)差別較大，可選非極性固定液，若極性差別較大，可選擇極性固定液。分離氫鍵型組分，應(yīng)選擇氫鍵型固定液，組分按其與固定液形成氫鍵能力的大小出柱，能力弱的先出柱。（2 2）柱溫及固定液

52、與擔(dān)體配比的選擇）柱溫及固定液與擔(dān)體配比的選擇高沸點(diǎn)樣品（沸點(diǎn)300400），采用15低固定液配比，柱溫200250。沸點(diǎn)為200300的樣品，采用510固定液配比柱溫150 cm/s180。 沸點(diǎn)為100200的樣品，采用1015固定液配比，柱溫選各組分的平均沸點(diǎn)2/3左右。氣體等低沸點(diǎn)采用15%25%高固定相配比，柱溫選沸點(diǎn)左右，在室溫或50下進(jìn)行分析。對于寬沸程樣品，需選擇程序升溫方法進(jìn)行。 （3 3）載氣的選擇）載氣的選擇 載氣的選擇主要從對峰展寬（柱效）、柱壓和對檢測靈敏度的影響三方面考慮，當(dāng)采用低流速時(shí)，宜用分子量較大的N2，當(dāng)高流速時(shí)，宜用分子量低、粘度小的H2或He。當(dāng)色譜柱較

53、長時(shí),宜采用H2，當(dāng)使用TCD時(shí)，宜用H2或 He，F(xiàn)ID、ECD等一般常用N2。通常載氣流速可為2080ml/min，可通過實(shí)驗(yàn)選擇最佳流速，但為縮短分析時(shí)間，載氣流通常高于最佳流速。(4)(4)其他條件的選擇其他條件的選擇氣化室溫度 氣化室溫度取決于樣品的揮發(fā)性、沸點(diǎn)及進(jìn)樣量，一般采用樣品沸點(diǎn)或稍高一點(diǎn)的溫度，保證瞬間溶化，但不要超過沸點(diǎn)50以上，以防樣品分解，一般氣化室溫度應(yīng)高于柱溫3050。檢測室溫度 檢測室溫度一般高于柱溫3050或等于汽化室溫為宜，以防止流出物在檢測器中冷凝而對其造成污染。進(jìn)樣量 對于填充柱以氣體樣品0.11ml、液體樣品011l、最大不超過4l為宜；毛細(xì)管柱采用分流器進(jìn)樣，分流后的進(jìn)樣量為填充柱的1/101/100。檢測器檢測器氫焰離子化檢測器（FID） 利用有機(jī)物在氫火焰的作用下，化學(xué)電離而形成離子流，通過測定離子流強(qiáng)度進(jìn)行檢 測。熱導(dǎo)檢測器（TCD） 是根據(jù)被測組分與載氣的熱導(dǎo)率不同來檢測組分濃度的變化，無機(jī)物和有機(jī)物均可測定 電子捕獲檢測器（ECD） 是一種用63Ni或3H作放射源的