類胡蘿卜素形成酶基因及其生物代謝工程

1、 類胡蘿卜素形成酶基因及其生物代謝工程類胡蘿卜素通常是指C40的碳氫化合物（胡蘿卜素）和它們的氧化衍生物(葉黃素)兩大類色素的總稱。它們在結(jié)構(gòu)上由8個類異戊二烯單位濃縮形成，典型的C40類胡蘿卜素攜帶紫羅酮環(huán)（ionone），在環(huán)的不 同位置可被氧基、羥基、環(huán)氧基代替1；類胡蘿卜素分子中最重要的部分是決定顏色和生物功能的共軛雙鍵系統(tǒng)，能使單態(tài)氧失活，猝滅羧基自由基。由于類胡蘿卜素本身的化學特性，它們是所有光合生物的基本成分,貯存在生物體的脂相中。在植物中，類胡蘿卜素對葉綠體的光合作用起著至關(guān)重要的作用，一方面，它們是葉綠體光合天線的輔助色素，幫助葉綠素接收光能；另一方面，它們在高溫、強光下能通

2、過葉黃素循環(huán)，以非輻射的方式耗散光系統(tǒng)（PS）的過剩能量保護葉綠素免受破壞2,3。除八氫番茄紅素、六氫番茄紅素等幾種類胡蘿卜素無色外，絕大多數(shù)類胡蘿卜素呈黃色、橙色或紅色4，是許多植物花和果實呈現(xiàn)鮮艷色彩的原因2。類胡蘿卜素也是合成植物激素ABA的前體5。約有10%的類胡蘿卜素是維生素A（VA）的前體6,7，人體VA不足易得夜盲癥。近年來，越來越多的醫(yī)學研究表明，類胡蘿卜素在猝滅自由基 8、增強人體免疫力9、預防心血管疾病和防癌抗癌2,10等保護人類健康方面起著更為重要的作用。人體血液中主要含有番茄紅素、胡蘿卜素、葉黃質(zhì)、隱黃質(zhì)、胡蘿卜素等類胡蘿卜素11，但人體不能合成類胡蘿卜素，主要依賴飲食

3、中類胡蘿卜素的供應。一些重要的類胡蘿卜素如玉米黃素，和葉黃質(zhì)一起，是眼睛斑點色素（macular pigment）中不可缺少的成分,但在食品中含量并不豐富，也不能通過外界藥物供給，玉米黃素如長期攝入不足對眼睛健康極為不利12。隨著類胡蘿卜素藥用價值的不斷發(fā)現(xiàn)，人類對類胡蘿卜素的種類和產(chǎn)量需求將越來越大。然而，類胡蘿卜素很難通過化學合成，迄今為止，已鑒定的天然類胡蘿卜素有600余種，但只有于少數(shù)幾種類胡蘿卜素如胡蘿卜素、蝦青素、角黃素等能通過化學合成進入商業(yè)化生產(chǎn)，它們主要用于營養(yǎng)補充、食品著色和動物飼料的添加；通過天然微生物發(fā)酵途徑也能生產(chǎn)胡蘿卜素、蝦青素，但所占的市場份額微不足道13。顯然，

4、類胡蘿卜素目前這種生產(chǎn)狀況已不能滿足市場的需求。現(xiàn)代分子生物學研究手段的發(fā)展，使得類胡蘿卜素生物合成途徑中的一系列關(guān)鍵酶基因被陸續(xù)分離鑒定，為通過DNA重組技術(shù)和遺傳工程生產(chǎn)類胡蘿卜素開辟了道路，近年來，有關(guān)這方面的研究在微生物和高等植物上取得重大突破。1. 類胡蘿卜素的生物合成途徑及其相關(guān)酶的基因克隆1.1類胡蘿卜素的生物合成途徑通過類胡蘿卜素生物合成的生化分析、經(jīng)典遺傳學和近年來分子遺傳學的研究，已經(jīng)基本清楚類胡蘿卜素的主要生物合成途徑。然而對于復雜類胡蘿卜素的末端基團、甲基基團及多烯烴鏈的額外修飾過程仍不太清楚14。所有的類胡蘿卜素均通過類異戊二烯化合物或萜類化合物途徑合成。IPP（異戊

5、烯焦磷酸）是該途徑的前體物質(zhì)，IPP在IPP異構(gòu)酶作用下生成DMAPP（二甲基丙烯基二磷酸），然后再與3個IPP縮合依次生成GPP（牻牛兒焦磷酸）、FPP（法尼基二磷酸）、GGPP（牻牛兒牻牛兒焦磷酸）。2個GGPP在Psy（八氫番茄紅素合成酶）作用下形成第一個無色的類胡蘿卜素八氫番茄紅素。八氫番茄紅素經(jīng)過連續(xù)的脫氫反應，共軛雙鍵延長，直至形成鏈孢紅素、番茄紅素。番茄紅素在不同環(huán)化酶的作用下分別生成胡蘿卜素、胡蘿卜素，在、胡蘿卜素的C4（C4，）引入酮基和（或）C3（C3，）引入羥基以及在環(huán)上引入C（5,6）環(huán)氧基后,則形成更為復雜的葉黃素（圖1）。1.2類胡蘿卜素形成酶基因目前，已從細菌、真

6、菌、藻類和植物等生物中分離出150多個類胡蘿卜素形成酶基因，它們分別編碼20多種類胡蘿卜素形成酶17。這些基因的克隆成功為利用DNA重組技術(shù)通過微生物生產(chǎn)有經(jīng)濟價值的類胡蘿卜素，以及改變植物類胡蘿卜素的生物合成途徑提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量提供了便利。 編碼早期類胡蘿卜素生物合成的酶，如GGPP合成酶、八氫番茄紅素合成酶、八氫番茄紅素脫氫酶的基因等占總體的一半以上，其中，八氫番茄紅素脫氫酶基因包含兩步、三步、四步和五步脫氫反應的不同基因。番茄紅素環(huán)化酶基因從細菌和植物中克隆到，它能促進雙環(huán)類胡蘿卜素形成；番茄紅素環(huán)化酶基因僅從植物中克隆到，除萵苣番茄紅素環(huán)化酶基因外，一般只形成單環(huán)。迄今為止，僅有修

7、飾類胡蘿卜素環(huán)的酶基因得到克隆，包括胡蘿卜素羥化酶、胡蘿卜素加氧酶（或酮化酶）。在過去幾年，已先后從植物上克隆到玉米黃素環(huán)氧酶、紫黃質(zhì)脫環(huán)氧酶、辣椒紅素/辣椒玉紅素合成酶、新黃質(zhì)合成酶。表1列出了調(diào)控類胡蘿卜素生物合成的關(guān)鍵酶及其基因。2. 微生物類胡蘿卜素基因工程應用DNA重組技術(shù)將外源基因?qū)胛⑸?，利用微生物繁殖快、產(chǎn)量高的特點生產(chǎn)人們需要的、有商業(yè)價值的化學物質(zhì)，是現(xiàn)代生物技術(shù)制藥工業(yè)的主要發(fā)展方向20。這一技術(shù)的關(guān)鍵是，作為外源基因宿主的微生物首先必須具備大量生產(chǎn)所需要化學物質(zhì)的前體的能力21。有關(guān)類胡蘿卜素的基因工程近年來在大腸桿菌和酵母上取得成功。2.1.大腸桿菌大腸桿菌不能形成

8、類胡蘿卜素，但它含有的成分如多萜醇、. 苯醌和甲基萘醌類維生素與類胡蘿卜素一樣，都是由共同前體FPP轉(zhuǎn)化而來22。因此，在理論上講，向大腸桿菌中轉(zhuǎn)入GGPP合成酶基因crtE后，可誘導體內(nèi)部分C源轉(zhuǎn)向類胡蘿卜素的生物合成。表1編碼類胡蘿卜素生物合成的酶基因2,17-19酶基因生物登錄號類胡蘿卜素骨架的構(gòu)建GGPP合成酶crtE歐文氏菌Erwinia uredevoraD90087crtE集胞藻Synechocystis PCC6803D90899al-3粗糙脈孢霉Neurospora crassaX53979Ggps擬南芥 Arabidopsis thaliana L25813Ggps辣椒 C

9、apsicum annuumP80042八氫番茄紅素合成酶crtB農(nóng)桿菌Agrobacterium aurantiacumD58420crtB集胞藻Synechocystis PCC6803X69172al-2粗糙脈孢霉Neurospora crassaL27652Psy擬南芥 Arabidopsis thalianaL25812Psy黃水仙Lpsea speciosaX78814Psy1番茄 Lycopersicon esculentumA21360Psy2番茄 Lycopersicon esculentumL23424無環(huán)類胡蘿卜素的生物合成八氫番茄紅素脫氫酶Pds擬南芥Arabidops

10、is thaliana L16237Pds玉米Zea maysL39266Pds黃水仙Lpsea speciosaX78815Pds番茄 Lycopersicon esculentumM88683crtP集胞藻Synechocystis PCC6803 X62574crtI莢膜紅細菌Rhodobacter capsulatusZ11165crtI歐文氏菌Erwinia uredevoraD90087al-1粗糙脈孢霉Neurospora crassa M57465-胡蘿卜素脫氫酶crtQ集胞藻Synechocystis PCC6803 X62574Zds擬南芥Arabidopsis thali

11、anaU38550Zds辣椒Capsicum annuum X68058鏈孢紅素羥化酶crtC球形紅桿菌Rhodobacter sphaeroides X82458鏈孢紅素甲氧化脫氫酶crtD莢膜紅細菌Rhodobacter capsulatusZ11165鏈孢紅素羥基-氧-轉(zhuǎn)甲基酶crtF球形紅桿菌Rhodobacter sphaeroides X82458球形烯 (加)氧酶crtA莢膜紅細菌Rhodobacter capsulatus Z11165環(huán)化類胡蘿卜素生物合成番茄紅素環(huán)化酶crtY歐文氏菌Erwinia uredevoraD90087crtY集胞藻Synechocystis PC

12、C6803X74599-Lyc擬南芥Arabidopsis thalianaZ29211番茄紅素環(huán)化酶-Lyc擬南芥Arabidopsis thaliana U50738-胡蘿卜素羥化酶crtZ農(nóng)桿菌Agrobacterium aurantiacum D58420Bch擬南芥Arabidopsis thalianaU58919Bch辣椒Capsicum annuum Y09225玉米黃素轉(zhuǎn)葡糖基酶crtX歐文氏菌Erwinia herbicola M87280-胡蘿卜素C(4)加氧酶crtW農(nóng)桿菌Agrobacterium aurantiacum D58420crtW產(chǎn)堿桿菌Alcaligen

13、es PC1 D58422crtO集胞藻Synechocystis PCC6803 D64004CrtO/Bkt雨生紅球藻Haematococcus pluvialisX86782/D45881玉米黃素環(huán)氧酶Zep1擬南芥Arabidopsis thaliana T45502Zep1辣椒Capsicum annuumX91491紫黃質(zhì)脫環(huán)氧酶Vde1擬南芥Arabidopsis thalianaN37612紫黃質(zhì)裂解酶Vp14玉米Zea maysU95953辣椒紅素/辣椒玉紅素合成酶Ccs辣椒Capsicum annuumX77289-胡蘿卜素脫氫酶crtU灰色鏈霉菌Streptomyces

14、griseusX95596新黃質(zhì)合成酶Nxs馬鈴薯Solanum tuberosum AJ272136Rose 23等利用大腸桿菌載體pACYC184建立起三個攜帶歐文氏菌類胡蘿卜素形成基因的質(zhì)粒：pACCRT-EIB（載有 crtE, B, I）、pACCAR16crtX （載有 crtE, B, I, Y, ）和 pAC-CAR25crtX（載有crtE, B, I, Y, Z ）；將它們轉(zhuǎn)入JM101大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系后，分別生產(chǎn)出200500 mg/ gDW的番茄紅素、-胡蘿卜素和玉米黃素 24，25 。Misawa等研究發(fā)現(xiàn)，如果將上述質(zhì)粒的GGPP合成酶基因crtE去除，它們也能生產(chǎn)

15、類胡蘿卜素，但產(chǎn)量降為原來的24%26。這一結(jié)果表明在大腸桿菌中類胡蘿卜素生物合成的最終前體是GGPP，而非IPP，但大腸桿菌GGPP的含量遠遠低于地FPP，引入編碼GGPP合成酶基因crtE增加了FPP向GGPP的轉(zhuǎn)化。將pBluescript II的 lac啟動子插入農(nóng)桿菌類胡蘿卜素形成基因crtW 和 crtZ中形成的基因片斷，再插進pBluescript II載體構(gòu)成質(zhì)粒pAK916 （載有crtW）和 pAK96K（載有crtW 和 crtZ）27,28 ；將這兩個質(zhì)粒分別和pAC-CAR16crtX或 pACCAR25crtX. 一起轉(zhuǎn)入JM101 大腸桿菌菌株，結(jié)果類胡蘿卜素總量

16、達到400500g /g DW29。但是，不同組合合成的類胡蘿卜素不同，（pAK916和pACCAR16crtX）菌株只產(chǎn)生角黃素，而(pAK96K 和 pACCAR16crtX) 或(pAK916和 pACCAR25crtX)菌株，除積累最終產(chǎn)物蝦青素外，還積累了從-胡蘿卜素到蝦青素的一系列中間產(chǎn)物。這可能是CrtW 和 CrtZ的酶競爭同一底物的緣故27 。 然而，目前商業(yè)上生產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物，如杜氏藻、紅球藻，產(chǎn)量已達到50mg/gDW30。雖然上述研究實現(xiàn)了利用大腸桿菌合成類胡蘿卜素的目標，但產(chǎn)量僅有10500g /g DW，較之杜氏藻、紅球藻等實在太低，因此，有必要在此基礎(chǔ)上加以

17、改進。Misawa等29設想，如果提高大腸桿菌類異戊二烯途徑中IPP的產(chǎn)量和IPP到GGPP的轉(zhuǎn)化效率，增加C源向類胡蘿卜素生物合成途徑的轉(zhuǎn)化量，可進一步提高類胡蘿卜素產(chǎn)量。根據(jù)這一思路，Wang等通過IPP異構(gòu)酶和GGPP合成酶在大腸桿菌體內(nèi)的超量表達，使大腸桿菌的蝦青素產(chǎn)量提高50倍31。Albrecht等通過1脫氧木酮糖5磷酸合成酶基因、脫氧木酮糖5磷酸還原異構(gòu)酶和IPP異構(gòu)酶在大腸桿菌體內(nèi)的的超量表達使大腸桿菌中-胡蘿卜素和玉米黃素的產(chǎn)量提高3.5倍，最終產(chǎn)量達1.5mg/gDW32。然而如果再增加IPP的合成，則對大腸桿菌菌株產(chǎn)生毒害甚至嚴重致死，這可能是由于大腸桿菌中用于貯存類胡蘿

18、卜素的膜負荷超載。2.酵母目前，用于類胡蘿卜素生物合成研究的酵母主要以Saccharomyces cerevisiae 和Candida utilis 兩種為材料。2.1酵母Saccharomyces cerevisiae 食用酵母S. cerevisiae 不能合成類胡蘿卜素，但體內(nèi)積累的麥角固醇也是類異戊二烯化合物。麥角固醇與類胡蘿卜素的生物合成途徑在FPP分叉，這樣，通過引入歐文氏菌GGPP合成酶基因crtE競爭FPP，能夠?qū)⒉糠諪PP從麥角固醇生物合成途徑轉(zhuǎn)向類胡蘿卜素的生物合成途徑。Yamano等 33 將歐文氏菌類胡蘿卜素形成基因crtE, crtB, and crtI，用酵母PG

19、K (磷酸甘油酸酯激酶), GAL 7, 和GAP (3磷酸甘油醛脫氫酶glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 基因的啟動子和終止子連接后，插入到酵母載體YEp13上建立一個質(zhì)粒Y514。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入S. cerevisiae R7酵母后產(chǎn)生了113 g /gDW的番茄紅素，約占10%的麥角固醇轉(zhuǎn)向了類胡蘿卜素的合成。將歐文氏菌crtY 基因用ADH 1啟動子和 HIP 1終止子連接后插入Y513質(zhì)粒構(gòu)建成質(zhì)粒Y5143，載有Y5143的酵母轉(zhuǎn)化體 S. cerevisiae R7積累了-胡蘿卜素33 103 g /gDW，以及少量其它的類胡蘿卜素中間

20、產(chǎn)物。Ausich 等 34 報導，通過歐文氏菌的類胡蘿卜素形成基因的遺傳操作，在酵母轉(zhuǎn)化體 S. Cerevisiae上獲得了番茄紅素、-胡蘿卜素和玉米黃素。2.2 酵母Candida utilis食用酵母C. Utilis具備大規(guī)模生產(chǎn)單細胞蛋白的能力，是生產(chǎn)谷胱甘肽和RNA等幾種化學試劑的宿主35，36 (Boze et al., 1992; Ichii et al., 1993)，同時，人們發(fā)現(xiàn)，它體內(nèi)積累的麥角固醇含量是酵母S. Cerevisiae 的23倍37(Miura et al., 1997a)，因此，通過基因工程技術(shù)利用酵母C. Utilis生產(chǎn)類胡蘿卜素更具有應用前景。

21、利用編碼核糖體蛋白的調(diào)控基因L41作為抗藥標記建立起一個轉(zhuǎn)化體系，38(Kondo et al., 1995)。擁有改良基因L41、歐文氏菌類胡蘿卜素形成基因crtE, crtB和 crtI分別用GAP, PGK和 PMA (質(zhì)膜ATP酶)的啟動子和終止子連接構(gòu)成pCLEBI13-2質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入C. utilis IFO 0988 (ATCC 9950)，結(jié)果產(chǎn)生的758g /gDW DW番茄紅素和407g /gDW八氫番茄紅素(Miura et al., 1997a).，約有35%的麥角固醇轉(zhuǎn)向了類胡蘿卜素的合成。應用46個相應的類胡蘿卜素形成基因在合成-胡蘿卜素和蝦青素方面也取得成功39。

22、(Miura et al., 1997b).為進一步提高酵母類胡蘿卜素產(chǎn)量，使3羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因超量表達調(diào)控MVA途徑增加萜類化合物前體物質(zhì)的供應，通過甾醇途徑的競爭，破壞編碼角鯊烯合成的ERG9基因阻止麥角固醇的生物合成增加不速之客GGPP向類胡蘿卜素的合成方向轉(zhuǎn)化，結(jié)果獲得了能生產(chǎn)7.8mg/gDW的番茄紅素的酵母菌株。這一結(jié)果標記著微生物類胡蘿卜素基因工程已從理論研究向商業(yè)化生產(chǎn)邁進40。 3.植物類胡蘿卜素生物合成的基因工程. 脊椎動物不能合成類胡蘿卜素，他們需要攝入外界的類胡蘿卜素才能合成視黃醛（主要的視覺色素）、維生素A、視黃酸（控制形態(tài)建成的物質(zhì)）等維生素。維生素A缺

23、乏是現(xiàn)今發(fā)展中國家普遍存在的嚴重問題，尤其是年老、嗜煙和酗酒的人群。胡蘿卜素是維生素的主要前體。據(jù)世界衛(wèi)生組織估測由于維生素A的營養(yǎng)水平不足導致每年至少200萬人死亡，其中主要是學齡前兒童41。因此，近年的類胡蘿卜素合成的代謝工程主要以提高作物中胡蘿卜素的含量為主要研究目標，并以在水稻、油菜、番茄等作物上取得重大突破。3.1水稻42水稻是主要糧食作物，然而，水稻胚乳雖然能夠合成并積累GGPP，但卻不能形成類胡蘿卜素。如果通過基因工程技術(shù)使其生產(chǎn)胡蘿卜素，則可望減輕在亞洲、非洲、南美洲等地區(qū)VA缺乏的狀況。根據(jù)類胡蘿卜素的生物合成途徑，若要將GGPP轉(zhuǎn)化成胡蘿卜素，在水稻中必須完成四步不同的生化

24、反應，為此必須將PSY、PDS、ZDS、LCY基因一起轉(zhuǎn)入水稻植株。由于細菌八氫胡蘿卜素脫氫酶（crtI）能夠完成兩個植物脫氫酶PDS、ZDS的共同作用，故可將基因減為PSY、crtI、LCY三個成員。研究人員將分別將黃水仙的PSY、LCY基因連接到胚乳特異表達的谷蛋白啟動子上，細菌八氫番茄紅素降解酶基因crtI連接到花椰菜斑點病毒35S啟動子上，然后一起構(gòu)成表達載體轉(zhuǎn)入到一個日本水稻品種。結(jié)果獲得了胚乳呈黃色的“金大米”，種子中含有胡蘿卜素，此外，還意外含有大量的玉米黃素、葉黃質(zhì)。這一結(jié)果表明胡蘿卜素羥化酶基因（BCH）可能和LCY一起在正常水稻胚中組成型表達，或者受番茄紅素形成的誘導表達。

25、轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中胡蘿卜素的含量最高達1.6g/g,，每天食用300g這種“金大米”能提供人類1020%的胡蘿卜素。如今，金大米已經(jīng)被捐贈給設在菲律賓的國際水稻研究所，用于開發(fā)富含胡蘿卜素的水稻新品種。3.2油菜43八氫番茄紅素合成酶的遺傳操作在油菜作物上獲得巨大成功。將歐氏桿菌八氫番茄紅素合成酶基因crtB與油菜napin基因啟動子構(gòu)建成種子特異表達載體轉(zhuǎn)入到油菜。結(jié)果轉(zhuǎn)基因油菜胚呈橙色，而對照呈綠色；種子中類胡蘿卜素含量增加50倍，達到1600g/gFW.，其主要類胡蘿卜素成分為胡蘿卜素和胡蘿卜素。這種金色菜油在抗拒VA的缺乏方面具有重要的應用前景，如今已被孟山多（Mnsanto）公司和設在

26、印度的Tata能源研究所合作開發(fā)。3.3番茄八氫番茄紅素是類胡蘿卜素的生物合成途徑中的第一步，故成為番茄基因操作中優(yōu)先考慮的目標。Bramley等44將番茄Psy基因反義導入番茄, GGPP積累,類胡蘿卜素含量大大下降, 表明Psy基因在番茄類胡蘿卜素生物合成中起限速作用。Fray和Grierson45等將番茄PYS基因正義導入番茄黃果突變體，果實成熟時重新積累番茄紅素；接著， Fray等46將番茄Psy基因正義導入番茄，結(jié)果Psy的cDNA在轉(zhuǎn)基因番茄中的組成型表達導致了離區(qū)和幼果類胡蘿卜素異常生成，植株矮化，這是由于將進入GA途徑的GGPP轉(zhuǎn)向了類胡蘿卜素的生物合成。這種植物的果實形成番茄

27、紅素的時間提早，但番茄紅素的含量卻比野生型低。Fray和Bramley的最新研究（未公開發(fā)表）顯示，將歐氏桿菌（Erwinia）八氫番茄紅素合成酶基因（crtB）以果實特異表達的方式轉(zhuǎn)入番茄，獲得了果實類胡蘿卜素總量增加兩倍的轉(zhuǎn)基因植株。為提高番茄果實的胡蘿卜素，Rosati等將從番茄自身克隆到的番茄紅素環(huán)化酶基因正義導入番茄植株，結(jié)果果實中胡蘿卜素含量增加3.8倍，但類胡蘿卜素總量基本不變47。番茄紅素是人體血液中的主要類胡蘿卜素，它在抗氧化和防癌的功能日益受到人們的關(guān)注。故許多研究人員試圖基因工程的方法提高番茄紅素含量。研究人員試圖讓類胡蘿卜素生物合成途徑中的早期酶（PYS、PDS）過度表

28、達，Rmer 和 Fraser等將細菌八氫番茄紅素脫氫酶基因（crtI）和花椰菜斑點病毒35S啟動子構(gòu)成組成型表達載體轉(zhuǎn)入番茄，結(jié)果令人失望，不僅番茄紅素的含量沒有增加，而且類胡蘿卜素的總量減半48。但好的是胡蘿卜素含量提高到原來的3倍，占總量的50%，約5mg/100g，從而使得這些番茄呈橙色。在crtI番茄的葉子中，環(huán)類胡蘿卜素種類稍微增加，但環(huán)化途徑的類胡蘿卜素減少，可能是因為35S啟動子組成型表達的結(jié)果。他們推測盡管葉黃質(zhì)是葉片中環(huán)化途徑的主要類胡蘿卜素，但在光合作用中并非必不可少，目前仍不清楚這些變化對光合作用的表現(xiàn)是否有細微的影響。研究者將crtI轉(zhuǎn)入番茄后LYC的mRNA水平增加

29、1.7倍41，這些結(jié)果足以解釋胡蘿卜素的增加不是偶然的。3.4煙草Misawa等49將細菌八氫番茄紅素基因正義導入煙草，b-胡蘿卜素合成增強,同時對除草劑norflurazon抗性增強。Kumagai等50將辣椒紅/辣椒玉紅素合成酶基因正義導入野生煙草, 植株呈橙色，葉片中積累辣椒紅素，含量占類胡蘿卜素總量的36%。 蝦青素是鮭魚、蝦等水生魚類肉色呈現(xiàn)粉紅色的重要色素。在自然界，蝦青素不能由植物合成，只能由水生細菌和微藻類合成，經(jīng)過魚進入食物鏈。然而，水生養(yǎng)殖的魚類與自然界的食物鏈分隔，因此必須在飼料中添加蝦青素才能使魚肉呈現(xiàn)粉紅色的特征。從海藻Haematoco-ccus中克隆出來的編碼-C

30、-4-氧化酶基因crtO，在酮類類胡蘿卜素生物合成中起關(guān)鍵作用51。將該基因與番茄Pds基因啟動子結(jié)合轉(zhuǎn)入煙草后，植株葉片中類胡蘿卜素成分及含量沒有改變，表明由Pds啟動子調(diào)控的組織特異表達的酮化酶可能在葉綠體中不表達；但在花的蜜腺有色體中積累高濃度的酮類類胡蘿卜素，類胡蘿卜素總量增加40%。其中主要成分為蝦青素，使花的顏色從黃變紅。結(jié)構(gòu)分析表明，轉(zhuǎn)基因煙草形成的蝦青素與水生生物形成的天然蝦青素具有相同的空間螺旋特性（3S3，S）52， 這一結(jié)果表明，通過基因操作利用植物生產(chǎn)特定的有商品價值的類胡蘿卜素也是切實可行的?；虿倏v類胡蘿卜素生物合成途徑已經(jīng)在微生物和作物上成功地用來增加和調(diào)整類胡蘿

31、卜素的積累。在微生物中，通過基因工程已能將類胡蘿卜素合成向設定的方向發(fā)展，同時能克服用于合成類胡蘿卜素的前體物質(zhì)，如IPP、GGPP等萜類化合物供應的瓶頸。但是，達到高產(chǎn)的主要問題是寄主對類胡蘿卜素的貯存能力。擺在人們面前的是如何在細菌和真菌中建立一個類胡蘿卜素區(qū)室化的系統(tǒng)。若是這一問題被解決，則通過異源寄主發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素將會進入商品成功。在作物上操縱類胡蘿卜素生物合成以增加類胡蘿卜素含量時，人們?nèi)晕醋⒁獾竭@將干擾其它的萜類化合物的合成途徑，但是利用器官特異性啟動子將其定位于原來代謝水平低的果實和種子的組織中可以避免這一問題?？赡苡懈嗟念惡}卜素生物合成與其它萜類化合物的合成途徑的聯(lián)系尚

32、未清楚，但類胡蘿卜素的代謝工程將會揭示這一點。通過引入轉(zhuǎn)基因精確調(diào)控類胡蘿卜素的生物代謝的主要障礙是我們對內(nèi)源類胡蘿卜素合成基因在高等植物中如何調(diào)控表達知之有限，我們?nèi)匀辉谠噲D理解在外源基因引入后內(nèi)源類胡蘿卜素合成基因為何并如何表達。一些研究者將提高食用植物中胡蘿卜素含量來解決VA缺乏的問題作為動力，將轉(zhuǎn)基因植物與其它本身含有胡蘿卜素的植物葉片和胡蘿卜根（6mg/gDW carotenoid,3 mg/gDW - carotenoid）相比，其生產(chǎn)類胡蘿卜素的含量是低的，上述的轉(zhuǎn)基因番茄中獲得的高胡蘿卜素含量也低于傳統(tǒng)育種選育的高胡蘿卜素含量的品種。然而在油菜上獲得高產(chǎn)胡蘿卜素植物油的巨大成功

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