核醫(yī)學(xué)教學(xué)課件：第六章 體外分析

1、 以放射性核素或其他非放射性物質(zhì)標(biāo)記以放射性核素或其他非放射性物質(zhì)標(biāo)記 的配體的配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結(jié)為示蹤劑，以配體和結(jié) 合體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進(jìn)行合體的結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，在試管內(nèi)進(jìn)行 的微量生物活性物質(zhì)的檢測技術(shù)。的微量生物活性物質(zhì)的檢測技術(shù)。 體外分析技術(shù)建立的基礎(chǔ)體外分析技術(shù)建立的基礎(chǔ): 配體配體-結(jié)合體結(jié)合體 抗原抗原-抗體的免疫結(jié)合反應(yīng)；抗體的免疫結(jié)合反應(yīng)； 配基配基-受體的結(jié)合反應(yīng)；受體的結(jié)合反應(yīng)； 底物底物-催化酶之間的酶促反應(yīng)；催化酶之間的酶促反應(yīng)； 激素激素-激素結(jié)合球蛋白的結(jié)合反應(yīng)。激素結(jié)合球蛋白的結(jié)合反應(yīng)。 方法學(xué)基礎(chǔ)：結(jié)合反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律方法學(xué)基

2、礎(chǔ)：結(jié)合反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律 體 外 分 析 技 術(shù) 體外放射分析體外放射分析 體外非放射分析體外非放射分析 放射性競爭放射性競爭 結(jié)合分析結(jié)合分析 放射性非競放射性非競 爭結(jié)合分析爭結(jié)合分析 radioimmunoassay, immunoradiometric assay, Dr. Yalow （一）競爭抑制結(jié)合反應(yīng)：（一）競爭抑制結(jié)合反應(yīng)： 放射免疫分析是在體外條件下，由足量的放射免疫分析是在體外條件下，由足量的 非標(biāo)記抗原（非標(biāo)記抗原（Ag）與定量的標(biāo)記抗原（與定量的標(biāo)記抗原（*Ag） 對限量的特異性抗體（對限量的特異性抗體（Ab）的競爭抑制結(jié)合的競爭抑制結(jié)合 反應(yīng)。反應(yīng)。 Ag-Ab +

3、Ag *Ag Ab Ag + + *Ag-Ab + *Ag (B)(F) 4*Ag與與Ag 免疫活性相同免疫活性相同 4*AgAg Ab Ag= * Ag , AgAb=*AgAb Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag(F) Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag (F) Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag + + + + + + + + + + + + + + + + +Ag 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法 用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原和一定量的標(biāo)記抗原在用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原和一定量的標(biāo)記抗原在 一定條件下同限量的特異性抗體進(jìn)行反應(yīng)；一定條件下同限量的特異性抗體進(jìn)

4、行反應(yīng)； 在反應(yīng)達(dá)到平衡后，利用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法分離在反應(yīng)達(dá)到平衡后，利用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法分離B和和F； 分別測量分別測量B和和F的放射性；的放射性； 用反應(yīng)變量（如用反應(yīng)變量（如B/F）作為縱坐標(biāo)，反應(yīng)劑量作為橫坐作為縱坐標(biāo)，反應(yīng)劑量作為橫坐 標(biāo)（即一系列標(biāo)準(zhǔn)抗原）作一條曲線，就得到不同濃標(biāo)（即一系列標(biāo)準(zhǔn)抗原）作一條曲線，就得到不同濃 度的標(biāo)準(zhǔn)抗原對反應(yīng)變量的競爭抑制曲線，這就是劑度的標(biāo)準(zhǔn)抗原對反應(yīng)變量的競爭抑制曲線，這就是劑 量反應(yīng)曲線。量反應(yīng)曲線。 Ag 2550100 200 400 800 *Ag Ab分離分離B、F B%=B/(B+F) F%=F/(B+F) R=B/F B1% B2%

5、 B3% B4% B5% B6% 123456 濃度濃度 B% 標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) 曲曲 線線 未知樣品的測量未知樣品的測量 Ag 2550100 200 400 800 *Ag Ab分離分離B、F B1% B2% B3% B4% B5% B6% 123456 B% ？ B% F% B/F Calibration Curve 60 I. 標(biāo)準(zhǔn)抗原與待測抗原、標(biāo)記抗原具有基本標(biāo)準(zhǔn)抗原與待測抗原、標(biāo)記抗原具有基本 相同的免疫活性，即質(zhì)同。相同的免疫活性，即質(zhì)同。 他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)要相同，對特他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)要相同，對特 異性抗體的親和力要相同。并且，標(biāo)準(zhǔn)抗異性抗體的親和力要相同。并且，標(biāo)準(zhǔn)

6、抗 原與待測抗原所處的介質(zhì)條件要相同。原與待測抗原所處的介質(zhì)條件要相同。 II.標(biāo)準(zhǔn)抗原的定量要準(zhǔn)確：標(biāo)準(zhǔn)抗原的定量要準(zhǔn)確： 整個整個RIA分析系統(tǒng)的定量基礎(chǔ)就是標(biāo)準(zhǔn)抗原的量，分析系統(tǒng)的定量基礎(chǔ)就是標(biāo)準(zhǔn)抗原的量， 因此標(biāo)準(zhǔn)抗原的定量一定要準(zhǔn)確，即與國家規(guī)定的因此標(biāo)準(zhǔn)抗原的定量一定要準(zhǔn)確，即與國家規(guī)定的 標(biāo)準(zhǔn)品相比有良好的可比性。標(biāo)準(zhǔn)品相比有良好的可比性。 只有保證標(biāo)準(zhǔn)抗原的準(zhǔn)確定量，才能保證只有保證標(biāo)準(zhǔn)抗原的準(zhǔn)確定量，才能保證RIA分析分析 系統(tǒng)的準(zhǔn)確度和精確度。系統(tǒng)的準(zhǔn)確度和精確度。 III.標(biāo)準(zhǔn)抗原必須高純度：標(biāo)準(zhǔn)抗原必須高純度： 標(biāo)準(zhǔn)抗原應(yīng)該含有盡可能少的化學(xué)雜質(zhì)，以避免標(biāo)準(zhǔn)抗原應(yīng)該含有

7、盡可能少的化學(xué)雜質(zhì)，以避免 雜質(zhì)對反應(yīng)和計(jì)量的影響。雜質(zhì)對反應(yīng)和計(jì)量的影響。 IV.標(biāo)準(zhǔn)抗原的穩(wěn)定性要好：標(biāo)準(zhǔn)抗原的穩(wěn)定性要好： 要保證在試劑盒的運(yùn)輸、儲存和在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)要保證在試劑盒的運(yùn)輸、儲存和在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng) 該不發(fā)生降解，分離、破壞等。該不發(fā)生降解，分離、破壞等。 標(biāo)記抗原的要求標(biāo)記抗原的要求 I. 質(zhì)同，即標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原、待測抗原的化學(xué)性質(zhì)同，即標(biāo)記抗原與標(biāo)準(zhǔn)抗原、待測抗原的化學(xué)性 質(zhì)和免疫活性要相同。質(zhì)和免疫活性要相同。 II. 標(biāo)記抗原要有適當(dāng)高的放射性比活度。標(biāo)記抗原要有適當(dāng)高的放射性比活度。 比活度高則在允許的相同的測量統(tǒng)計(jì)誤差的前提下，所使用比活度高則在允許的相同的測量

8、統(tǒng)計(jì)誤差的前提下，所使用 的標(biāo)記抗原的量必然減少，那么在反應(yīng)中與之競爭的待測抗的標(biāo)記抗原的量必然減少，那么在反應(yīng)中與之競爭的待測抗 原的量也相應(yīng)減少，方法的靈敏度就提高了。原的量也相應(yīng)減少，方法的靈敏度就提高了。 但過高的比活度，也會引起諸如輻射自分解和免疫活性受損但過高的比活度，也會引起諸如輻射自分解和免疫活性受損 的問題的問題。 III.標(biāo)記抗原要有足夠高的放射化學(xué)純度，一般要大于標(biāo)記抗原要有足夠高的放射化學(xué)純度，一般要大于95%。 放射化學(xué)純度不高，可能使一些放射性的雜質(zhì)對放射化學(xué)純度不高，可能使一些放射性的雜質(zhì)對RIA的免的免 疫反應(yīng)和動力學(xué)參數(shù)產(chǎn)生影響。疫反應(yīng)和動力學(xué)參數(shù)產(chǎn)生影響。

9、由于存在放射性核素的衰變，因此在長期儲存后的標(biāo)記抗由于存在放射性核素的衰變，因此在長期儲存后的標(biāo)記抗 原一般要經(jīng)過重新提純后才能再次使用。原一般要經(jīng)過重新提純后才能再次使用。 IV.標(biāo)記抗原的穩(wěn)定性要好：標(biāo)記抗原的穩(wěn)定性要好： 和標(biāo)準(zhǔn)抗原相比，標(biāo)記抗原由于有了放射性核素和標(biāo)準(zhǔn)抗原相比，標(biāo)記抗原由于有了放射性核素 射線的影響，更容易發(fā)生分解。射線的影響，更容易發(fā)生分解。 在標(biāo)記抗原的儲存上，應(yīng)遵循標(biāo)記化合物的保存在標(biāo)記抗原的儲存上，應(yīng)遵循標(biāo)記化合物的保存 原則即低溫、降低比放射性、清除自由基等。原則即低溫、降低比放射性、清除自由基等。 包括多克隆抗體和單克隆抗體。包括多克隆抗體和單克隆抗體。 抗

10、體的質(zhì)量之間關(guān)系到抗體的質(zhì)量之間關(guān)系到RIA分析方法的靈敏度分析方法的靈敏度 和特異性。和特異性。 多克隆抗體一般是用抗原免疫年輕、健康的純種多克隆抗體一般是用抗原免疫年輕、健康的純種 小動物（一般是羊或兔子）而誘發(fā)產(chǎn)生的抗血清。小動物（一般是羊或兔子）而誘發(fā)產(chǎn)生的抗血清。 制備的方法成熟、簡便、生產(chǎn)量大；但是里面成制備的方法成熟、簡便、生產(chǎn)量大；但是里面成 份復(fù)雜，免疫反應(yīng)的動力學(xué)規(guī)律復(fù)雜。份復(fù)雜，免疫反應(yīng)的動力學(xué)規(guī)律復(fù)雜。 單克隆抗體是通過雜交瘤技術(shù)篩選制備的，成份單克隆抗體是通過雜交瘤技術(shù)篩選制備的，成份 單一、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)；但成本較高。單一、穩(wěn)定、特異性強(qiáng)；但成本較高。 抗體的要求（

11、抗體的要求（三高三高） 2. 交叉反應(yīng)率：交叉反應(yīng)率： 指抗體識別相應(yīng)抗原類似物的能力，反應(yīng)了抗體的指抗體識別相應(yīng)抗原類似物的能力，反應(yīng)了抗體的 特異性。特異性。 在生物體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境中，許多生物活性物質(zhì)都有在生物體內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境中，許多生物活性物質(zhì)都有 很多相似的類似物，例如甲狀腺素中就有很多相似的類似物，例如甲狀腺素中就有T3、T4、 rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。 交叉反應(yīng)率越低，則說明抗體與抗原類似物的交叉交叉反應(yīng)率越低，則說明抗體與抗原類似物的交叉 反應(yīng)就越小，其識別抗原類似物的能力就越強(qiáng)，特反應(yīng)就越小，其識別抗原類似物的能力就越強(qiáng)，特 異性

12、就越強(qiáng)。異性就越強(qiáng)。 常用常用50%置換法來測定交叉反應(yīng)的百分率。置換法來測定交叉反應(yīng)的百分率。 即將被測物質(zhì)和其類似物，分別作競爭抑制曲線，即將被測物質(zhì)和其類似物，分別作競爭抑制曲線， 比較兩者在其結(jié)合率為零管結(jié)合率（比較兩者在其結(jié)合率為零管結(jié)合率（B/B0=50%） 時的劑量響應(yīng)濃度，其比值即為交叉反應(yīng)百分率，時的劑量響應(yīng)濃度，其比值即為交叉反應(yīng)百分率， 也就是該抗體對被測物某種類似物的相應(yīng)活力。也就是該抗體對被測物某種類似物的相應(yīng)活力。 （三）特異性分離方法（三）特異性分離方法 （一）誤差的分類和來源：（一）誤差的分類和來源： （二）質(zhì)量控制（二）質(zhì)量控制 質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢

13、查、表示和消除質(zhì)量控制就是使用合適的方法以檢查、表示和消除 來自試劑藥盒和測量體系的誤差，并使這種誤差來自試劑藥盒和測量體系的誤差，并使這種誤差 降低到某一允許水平。降低到某一允許水平。 具體作用有：具體作用有： 1檢查誤差的程度，決定測定結(jié)果的取舍。檢查誤差的程度，決定測定結(jié)果的取舍。 2識別誤差的來源并消除其原因。識別誤差的來源并消除其原因。 3改進(jìn)測定方法的設(shè)計(jì)以提高質(zhì)量。改進(jìn)測定方法的設(shè)計(jì)以提高質(zhì)量。 回收管內(nèi)加入的已知量 對照管測量值回收管測量值 回收率 （3）健全性評價(jià)：）健全性評價(jià)： 主要用于評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的免疫活性是否一主要用于評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的免疫活性是否一 致。致

14、。 用反應(yīng)緩沖液將樣品稀釋成不同的劑量，繪制樣品用反應(yīng)緩沖液將樣品稀釋成不同的劑量，繪制樣品 稀釋曲線，如果樣品與標(biāo)準(zhǔn)品免疫活性相同，得到稀釋曲線，如果樣品與標(biāo)準(zhǔn)品免疫活性相同，得到 的曲線應(yīng)該是一組平行的曲線，所以又稱為平行性的曲線應(yīng)該是一組平行的曲線，所以又稱為平行性 實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)。 3. 靈敏度（靈敏度（sensitivity）：）： 是指是指RIA方法剛能與不含有標(biāo)準(zhǔn)抗原的零標(biāo)準(zhǔn)管在方法剛能與不含有標(biāo)準(zhǔn)抗原的零標(biāo)準(zhǔn)管在 統(tǒng)計(jì)學(xué)上區(qū)別開來的抗原最低劑量，即該統(tǒng)計(jì)學(xué)上區(qū)別開來的抗原最低劑量，即該RIA方法方法 的最小可檢測量。的最小可檢測量。 確定靈敏度的方法主要有：確定靈敏度的方法主要有：

15、 同一樣品同一樣品10次測量結(jié)果的次測量結(jié)果的B/B090的劑量的平的劑量的平 均值作為最小可測量。均值作為最小可測量。 以以10次測量結(jié)果的次測量結(jié)果的B0管結(jié)合率均值減去管結(jié)合率均值減去2SD（標(biāo)（標(biāo) 準(zhǔn)差）的結(jié)合率的劑量對應(yīng)值為最小可測量。準(zhǔn)差）的結(jié)合率的劑量對應(yīng)值為最小可測量。 4. 特異性：特異性： 方法的特異性主要取決于抗體的特異性。方法的特異性主要取決于抗體的特異性。 用用 抗體的交叉反應(yīng)率來表示?？贵w的交叉反應(yīng)率來表示。 5. 穩(wěn)定性：穩(wěn)定性： 測量結(jié)果的穩(wěn)定性可以通過劑量反應(yīng)曲線的各測量結(jié)果的穩(wěn)定性可以通過劑量反應(yīng)曲線的各 個參數(shù)的穩(wěn)定性來間接反映。個參數(shù)的穩(wěn)定性來間接反映。

16、 如標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距，零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率的如標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率和截距，零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合率的 75%、50%、25%處的劑量值處的劑量值(ED75、ED50、ED25 等等)。 五、五、RIA的方法學(xué)的方法學(xué) （一）反應(yīng)方式：（一）反應(yīng)方式： 1. 平衡加樣法：也稱一步法，是將非標(biāo)記抗原、平衡加樣法：也稱一步法，是將非標(biāo)記抗原、 標(biāo)記抗原和抗體同時加入反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)。標(biāo)記抗原和抗體同時加入反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)。 優(yōu)點(diǎn)：使非標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗原兩者與抗體優(yōu)點(diǎn)：使非標(biāo)記抗原、標(biāo)記抗原兩者與抗體 有相同的反應(yīng)幾率，操作方便，精密度較好，有相同的反應(yīng)幾率，操作方便，精密度較好， 穩(wěn)定性好。穩(wěn)定性好。 缺點(diǎn)：反應(yīng)時間

17、長，靈敏度較差。缺點(diǎn)：反應(yīng)時間長，靈敏度較差。 2. 順序加樣法：先將非標(biāo)記抗原與抗體溫育反應(yīng)一定順序加樣法：先將非標(biāo)記抗原與抗體溫育反應(yīng)一定 時間（時間（624小時），形成抗原抗體復(fù)合物后，然后小時），形成抗原抗體復(fù)合物后，然后 再加入標(biāo)記抗原短時間（再加入標(biāo)記抗原短時間（14小時）溫育后中止反小時）溫育后中止反 應(yīng)。應(yīng)。 優(yōu)點(diǎn)：使非標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合的幾率比標(biāo)記抗原優(yōu)點(diǎn)：使非標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合的幾率比標(biāo)記抗原 高，提高了非標(biāo)記抗原的競爭能力，提高了方法的高，提高了非標(biāo)記抗原的競爭能力，提高了方法的 靈敏度。靈敏度。 3. 添加劑：添加劑： 0.5牛血清白蛋白：減少反應(yīng)試管對微量抗原、牛血清

18、白蛋白：減少反應(yīng)試管對微量抗原、 抗體的吸附。抗體的吸附。 0.01mol/l EDTA鈉鹽：多功能的螯合劑，可以去除鈉鹽：多功能的螯合劑，可以去除 樣品中的鈣鎂離子。樣品中的鈣鎂離子。 0.05疊氮鈉：防腐劑。疊氮鈉：防腐劑。 RIA的操作一般包括加樣、孵育、分離、測量和數(shù)據(jù)處的操作一般包括加樣、孵育、分離、測量和數(shù)據(jù)處 理理5個部分。個部分。 1. 加樣：注意所有的試管加樣總體積要保持一致，所加樣：注意所有的試管加樣總體積要保持一致，所 處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。處的介質(zhì)環(huán)境也要一致。 2. 孵育：根據(jù)不同的分析對象孵育的溫度和時間不同，孵育：根據(jù)不同的分析對象孵育的溫度和時間不同， 一般是一般是37。 3. 分離：選擇好的分離方法進(jìn)行分離。分離：選擇好的分離方法進(jìn)行分離。 4.