基因的克隆與表達(dá)-2005

1、基因的克隆與表達(dá)基因的克隆與表達(dá)山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所 馬春紅基因工程（基因工程（Genetic engineering,Ge)Genetic engineering,Ge): :通通過體外重組技術(shù)過體外重組技術(shù), ,人為操作基因、改造基人為操作基因、改造基因，改變生物遺傳性狀的過程。因，改變生物遺傳性狀的過程。 基本手段基本手段：分子生物學(xué)技術(shù)：分子生物學(xué)技術(shù) （體外重組、雜交、電泳等）（體外重組、雜交、電泳等） 目的目的：基因克?。夯蚩寺?基因表達(dá)基因表達(dá)主要內(nèi)容基因工程的克隆載體基因工程的克隆載體(genetic cloning vector)基因克隆基因克隆(gene clong

2、ing)基因表達(dá)基因表達(dá)(gene expression) -原核基因表達(dá)原核基因表達(dá) -真核基因表達(dá)真核基因表達(dá) 第五章第五章 基因工程的克隆載體基因工程的克隆載體Genetic Cloning VectorGenetic Cloning Vector基因工程的目的基因克隆基因克隆-獲得目的基因基因表達(dá)基因表達(dá)-使受體的新性狀表現(xiàn)，獲得大量目的蛋白In vivo expressionIn vitro expression。載體載體-基因工程中的重要工具基因工程中的重要工具載體載體(vector)(vector)：攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的工具載體的功能載體的功能 1.運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受

3、體細(xì)胞2.為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力3.為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供條件 載體的兩種擴(kuò)增方式載體的兩種擴(kuò)增方式-自主復(fù)制型載自主復(fù)制型載體和附加載體體和附加載體克隆載體（克隆載體（cloning vector) 定義定義 特點(diǎn)特點(diǎn) 常用載體介紹常用載體介紹第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、概念一、概念克隆載體（克隆載體（cloning vector)cloning vector)：用于攜：用于攜帶目的基因（外源基因）進(jìn)入受體帶目的基因（外源基因）進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增的工具。細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制、擴(kuò)增的工具。二、特點(diǎn)二、特點(diǎn)1、能獨(dú)立復(fù)制，具有復(fù)制子（、能獨(dú)立復(fù)制，具有復(fù)制子（replican)rep

4、lican：基因組中能獨(dú)立復(fù)制的最小單：基因組中能獨(dú)立復(fù)制的最小單位，含復(fù)制起始點(diǎn)（位，含復(fù)制起始點(diǎn)（ ori)和復(fù)制終點(diǎn)。和復(fù)制終點(diǎn)。 DNA的復(fù)制由的復(fù)制由ori控制控制原核細(xì)胞的染色體和質(zhì)粒有固定的原核細(xì)胞的染色體和質(zhì)粒有固定的ori真核細(xì)胞的染色體有多個(gè)真核細(xì)胞的染色體有多個(gè)ori2 2、屬于松弛型復(fù)制子、屬于松弛型復(fù)制子3 3、具有、具有復(fù)制非必需區(qū)復(fù)制非必需區(qū)4 4、有一個(gè)或多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)、有一個(gè)或多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，即多克隆位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)（Multiple cloning site,MCSMultiple cloning site,MCS）：一段人工合成

5、的一段人工合成的DNADNA序列，其上含有密集排列序列，其上含有密集排列的多種單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于不同來的多種單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于不同來源的外源源的外源DNADNA插入載體。插入載體。5、具有篩選標(biāo)記、具有篩選標(biāo)記6、分子量合適（、分子量合適（3-10kb)7、高拷貝數(shù)、高拷貝數(shù) 拷貝數(shù)（拷貝數(shù)（copy):一個(gè)細(xì)胞內(nèi)存在的一個(gè)細(xì)胞內(nèi)存在的 分子數(shù)分子數(shù)8、生物安全性好、生物安全性好三、常用克隆載體種類三、常用克隆載體種類質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid)plasmid) 噬菌體（噬菌體（bacteriophage bacteriophage ) )粘粒（粘粒（cosmidcosmi

6、d）M13M13噬菌體（噬菌體（bateriophage M13bateriophage M13）人工染色體人工染色體第二節(jié)第二節(jié) 常用克隆載體介紹常用克隆載體介紹一、質(zhì)粒（一、質(zhì)粒（plasmid)（一）（一） 一般特性一般特性Plasmid：染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位。染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位。 包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸(DNA)(DNA)分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNADNA分分子。

7、在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體 多為環(huán)狀雙鏈多為環(huán)狀雙鏈DNA 可自我獨(dú)立復(fù)制可自我獨(dú)立復(fù)制 天然存在：天然存在：F質(zhì)粒、質(zhì)粒、R質(zhì)粒等質(zhì)粒等（二）分類（二）分類 大?。盒⌒唾|(zhì)粒大?。盒⌒唾|(zhì)粒( 15kb ) 大型質(zhì)粒大型質(zhì)粒( 60kb) 功能：功能：F質(zhì)粒、質(zhì)粒、R質(zhì)粒質(zhì)粒 宿主：窄宿主范圍質(zhì)粒：宿主：窄宿主范圍質(zhì)粒：ori特異，僅能特異，僅能在一種宿主中復(fù)制在一種宿主中復(fù)制 寬宿主范圍質(zhì)粒：寬宿主范圍質(zhì)粒：ori不特異，可不特異，可在多種宿主中復(fù)制在多種宿主中復(fù)制 復(fù)制類型復(fù)制類型： 嚴(yán)緊型質(zhì)粒：復(fù)制受宿主細(xì)胞的嚴(yán)格控制嚴(yán)緊型質(zhì)粒：復(fù)制受宿主細(xì)胞

8、的嚴(yán)格控制 低拷貝數(shù)（低拷貝數(shù)（1-2copies/cell)松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒：拷貝數(shù)高：拷貝數(shù)高(10-200 copies/cell) 復(fù)制僅需復(fù)制僅需DNA聚合酶聚合酶I，不，不 需蛋白質(zhì)合成需蛋白質(zhì)合成 宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成及染色宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成及染色體復(fù)制停止時(shí)，可大量擴(kuò)增至上千份體復(fù)制停止時(shí)，可大量擴(kuò)增至上千份（氯霉素氯霉素） 構(gòu)型構(gòu)型： 超螺旋型（超螺旋型（supercoiled circle,SC)supercoiled circle,SC)or or 共價(jià)閉環(huán)雙股共價(jià)閉環(huán)雙股DNA( covalently DNA( covalently closed circle,CCC

9、)closed circle,CCC) 開環(huán)型（開環(huán)型（opened circle,OCopened circle,OC） 線形（線形（linear circle,LC)linear circle,LC)（三）克隆質(zhì)粒的構(gòu)建（三）克隆質(zhì)粒的構(gòu)建1 1、構(gòu)建質(zhì)粒的目的、構(gòu)建質(zhì)粒的目的調(diào)整質(zhì)粒結(jié)構(gòu)、提高轉(zhuǎn)化率調(diào)整質(zhì)粒結(jié)構(gòu)、提高轉(zhuǎn)化率2 2、常用手段、常用手段：減小分子量減小分子量引入引入MCSMCS引入具有多種用途的輔助序列引入具有多種用途的輔助序列向天然質(zhì)粒中引入選擇標(biāo)記向天然質(zhì)粒中引入選擇標(biāo)記, pSC101多個(gè)質(zhì)粒重組，增強(qiáng)選擇標(biāo)記，過大，多個(gè)質(zhì)粒重組，增強(qiáng)選擇標(biāo)記，過大，pBR313減小復(fù)

10、制非必需區(qū)，減小復(fù)制非必需區(qū)，縮小分子量縮小分子量，pBR322調(diào)整質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，提高載體序列調(diào)整質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，提高載體序列（減小分子量、引入（減小分子量、引入MCS及輔助序列）及輔助序列）3 3、克隆質(zhì)粒的發(fā)展趨勢、克隆質(zhì)粒的發(fā)展趨勢單標(biāo)記、復(fù)制效單標(biāo)記、復(fù)制效率低率低雙標(biāo)記，雙標(biāo)記，50%以上以上的復(fù)制非必需區(qū)的復(fù)制非必需區(qū) 物理圖譜物理圖譜（phisical map) 物理圖譜（物理圖譜（physical physical map): map): 在在DNADNA分子上標(biāo)分子上標(biāo)明限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、明限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、數(shù)目、排列順序及特?cái)?shù)目、排列順序及特征性功能標(biāo)記的圖形。征性功能標(biāo)記的圖形。又

11、稱為限制圖譜又稱為限制圖譜（restriction map)restriction map)載體物理圖譜識圖要求載體物理圖譜識圖要求1 1、載體大小、載體大小2 2、載體類型、載體類型3 3、載體組成、載體組成4 4、載體主要元件（特點(diǎn)）、載體主要元件（特點(diǎn)）及其應(yīng)用及其應(yīng)用（四）常見人工構(gòu)建質(zhì)粒的分類（四）常見人工構(gòu)建質(zhì)粒的分類: :人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為: :1.1.多拷貝質(zhì)粒多拷貝質(zhì)粒 復(fù)制子經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)復(fù)制子經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)負(fù)調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)?？截悢?shù)達(dá)到每個(gè)細(xì)胞數(shù)千，用于負(fù)調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)粒拷貝數(shù)達(dá)到每個(gè)細(xì)胞數(shù)千，用

12、于擴(kuò)增外源基因。擴(kuò)增外源基因。2.2.測序質(zhì)粒測序質(zhì)粒3.3.整合質(zhì)粒整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及整合特異序列，便于裝有整合促進(jìn)基因及整合特異序列，便于外源基因準(zhǔn)確重組整合入受體細(xì)胞的染色體上外源基因準(zhǔn)確重組整合入受體細(xì)胞的染色體上4.4.穿梭質(zhì)粒穿梭質(zhì)粒 含有兩個(gè)不同的復(fù)制子，能在兩種不同的含有兩個(gè)不同的復(fù)制子，能在兩種不同的受體細(xì)胞中復(fù)制受體細(xì)胞中復(fù)制5.5.表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)的啟動(dòng)基因，合適的順序以及有效裝有強(qiáng)的啟動(dòng)基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的高效表的終止子，以便任何外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)達(dá)（五）常用質(zhì)粒介紹五）常用質(zhì)粒介紹質(zhì)粒命名原則質(zhì)

13、粒命名原則4.36kb雙標(biāo)記雙標(biāo)記分散的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)分散的多個(gè)單一酶切位點(diǎn)插入滅活插入滅活雙抗菌素對照實(shí)驗(yàn)雙抗菌素對照實(shí)驗(yàn)1 1、 pBR32277pBR32277年年BoliverBoliver構(gòu)建構(gòu)建插入失活、雙抗菌素對照實(shí)驗(yàn)插入失活、雙抗菌素對照實(shí)驗(yàn)pBR322衍生質(zhì)粒衍生質(zhì)粒2 2、 pUC18/19pBR322pUC18/19pBR322的重要衍生質(zhì)粒的重要衍生質(zhì)粒1983年構(gòu)建：年構(gòu)建：pBR322+M13基本元件：基本元件：ori Ampr MCS 輔助序列：輔助序列： lacZ基因編碼基因編碼 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶lacI基因編碼阻遏蛋白基因編碼阻遏蛋白,使使lacZ不能

14、表達(dá)不能表達(dá) 誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,lacZ表達(dá)表達(dá)乳糖操縱子乳糖操縱子乳糖操縱子的表達(dá)調(diào)控乳糖操縱子的表達(dá)調(diào)控pUC載體載體(含含lacZ、lacI基因）基因）誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物(IPTG)lacZ表達(dá)表達(dá) -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端片段（端片段（ -肽）肽）宿主細(xì)胞宿主細(xì)胞lacZ M15缺陷型缺陷型 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶X-gal變蘭色變蘭色pUCpUC載體藍(lán)白斑篩選的原理載體藍(lán)白斑篩選的原理-插入失活插入失活1 1pUC載體載體(含含lacZ、lacI基因）基因）外源基因插入外源基因插入lacZ失活失活不產(chǎn)生不產(chǎn)生 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端端片

15、段（片段（ -肽）肽）X-gal不變色，呈白色不變色，呈白色pUCpUC載體藍(lán)白斑篩選的原理載體藍(lán)白斑篩選的原理-插入失活插入失活2 23 3、 pGEMpGEM系列系列pGEM-1pGEM-1MCSMCS兩側(cè)有兩側(cè)有SP6SP6、T7RNAT7RNA聚合聚合酶啟動(dòng)子酶啟動(dòng)子pGEM-1MCSpGEM-1MCS兩側(cè)有兩側(cè)有SP6SP6、T7RNAT7RNA聚合酶啟動(dòng)子聚合酶啟動(dòng)子1 1、可進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄、可進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄具有特異性轉(zhuǎn)錄具有特異性可分別轉(zhuǎn)錄插入片段的兩條鏈可分別轉(zhuǎn)錄插入片段的兩條鏈轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可制備轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可制備體外翻譯的模板、體外翻譯的模板、探針及反義探針及反義RNARNA2 2、

16、為插入片段的測序提供特異引物位、為插入片段的測序提供特異引物位點(diǎn)點(diǎn)pGEM-3/4Z-MCS位于位于lacZ基因內(nèi)部基因內(nèi)部插入失活插入失活藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選具有具有SP6、T7啟動(dòng)子啟動(dòng)子pGEM-3Zf(+)/(-)-引入絲狀噬菌體引入絲狀噬菌體f1(+)/(-)復(fù)制起始點(diǎn)復(fù)制起始點(diǎn) 可以產(chǎn)生單鏈可以產(chǎn)生單鏈DNA，并，并分泌至上清中，便于對分泌至上清中，便于對插入片段進(jìn)行測序插入片段進(jìn)行測序 F1的方向的方向(+/-)決定復(fù)制決定復(fù)制哪一條鏈哪一條鏈4 4、 T-vectorT-vector用于用于PCRPCR產(chǎn)物的直接克隆產(chǎn)物的直接克隆載體DNA兩條鏈的5端有一個(gè)游離的T：PCR產(chǎn)物

17、的直接克隆SP6、T7啟動(dòng)子：體外轉(zhuǎn)錄、為克隆產(chǎn)物的測序提供特異性引物插入位點(diǎn)兩側(cè)的酶切位點(diǎn)：為回收克隆片段進(jìn)行亞克隆提供便利的酶切位點(diǎn)5 5、pCDNA3-pCDNA3-穿梭載體穿梭載體穿梭載體（穿梭載體（shuttle vector)shuttle vector) 即可以攜帶外源基因在原核細(xì)即可以攜帶外源基因在原核細(xì)胞中復(fù)制，又可以使其在真核細(xì)胞胞中復(fù)制，又可以使其在真核細(xì)胞中表達(dá)的載體中表達(dá)的載體。小小 結(jié)結(jié)質(zhì)粒的發(fā)展趨勢：質(zhì)粒的發(fā)展趨勢：調(diào)整質(zhì)粒結(jié)構(gòu)、提高載體效率：減小分子調(diào)整質(zhì)粒結(jié)構(gòu)、提高載體效率：減小分子量、引入量、引入MCSMCS引入多種用途的輔助序列引入多種用途的輔助序列: :

18、lacZlacZ、lacIlacI基因：基因：藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選SP6SP6、T7RNAT7RNA聚合酶啟動(dòng)子：聚合酶啟動(dòng)子：體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄F1F1復(fù)制起始點(diǎn)：復(fù)制起始點(diǎn)：產(chǎn)生單鏈產(chǎn)生單鏈DNADNA真核啟動(dòng)子：真核啟動(dòng)子：穿梭載體穿梭載體二、二、 噬菌體載體噬菌體載體（一）（一）噬菌體的分子生物學(xué)噬菌體的分子生物學(xué)1 1、噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋噬菌體是大腸桿菌的噬菌體，它由外殼蛋白和白和-DNA-DNA組成組成2 2、-DNA-DNA：線狀雙鏈線狀雙鏈DNADNA分子，全長分子，全長48.5kb48.5kb兩端各有一個(gè)兩端各有一個(gè)1212核苷酸的互補(bǔ)單鏈（粘性末核苷酸的互補(bǔ)

19、單鏈（粘性末端，端，GGGCGGCGACCT, CCCGCCGCTGGAGGGCGGCGACCT, CCCGCCGCTGGA，稱為，稱為 CosCos位點(diǎn)（位點(diǎn)（cohesive endcohesive end）或或coscos區(qū)。區(qū)。功能相近的基因在基因組中聚集在一起。功能相近的基因在基因組中聚集在一起。 噬菌體生物學(xué)性狀介紹噬菌體生物學(xué)性狀介紹3 3、基因組成：、基因組成： CosCos位點(diǎn)（位點(diǎn)（cohesive end)cohesive end)： DNA DNA分子兩端各有一個(gè)分子兩端各有一個(gè)1212堿基長的互補(bǔ)單鏈順序，是天然的粘性末端，稱堿基長的互補(bǔ)單鏈順序，是天然的粘性末端，稱

20、 coscos位點(diǎn)位點(diǎn) 左臂（左臂（編碼外殼蛋白編碼外殼蛋白）：頭部基因（）：頭部基因（7 7個(gè)）、尾部基因個(gè)）、尾部基因（1111個(gè)）個(gè)） 右臂（右臂（負(fù)責(zé)裂解宿主細(xì)胞、負(fù)責(zé)裂解宿主細(xì)胞、DNADNA自主復(fù)制以及調(diào)控自主復(fù)制以及調(diào)控) )：裂：裂解基因（解基因（2 2個(gè)）個(gè)） 中間段中間段( (控制基因組整合到寄主基因的基因控制基因組整合到寄主基因的基因) )：DNADNA復(fù)制復(fù)制及溶菌生長非必需區(qū)及溶菌生長非必需區(qū)（重組基因、正調(diào)控基因、負(fù)調(diào)控（重組基因、正調(diào)控基因、負(fù)調(diào)控基因）、基因）、DNADNA合成基因合成基因coscos位點(diǎn)的作用位點(diǎn)的作用4 4、生活周期、生活周期溫和性噬菌體溫和

21、性噬菌體（二）（二）DNADNA載體的構(gòu)建載體的構(gòu)建建立建立克隆載體前需要解決克隆載體前需要解決2 2個(gè)問題：個(gè)問題：1 1）包裝容量有限）包裝容量有限：DNADNA分子只能增加分子只能增加5%5%的大小，意味著只能插入的大小，意味著只能插入3kb3kb的的DNADNA分子。分子。2 2）酶切位點(diǎn)復(fù)雜）酶切位點(diǎn)復(fù)雜： 基因組非常大，基因組非常大，對于每一種酶來講都含有超過對于每一種酶來講都含有超過1 1個(gè)的識別序個(gè)的識別序列，酶切后產(chǎn)生多個(gè)片段，連接不能形成列，酶切后產(chǎn)生多個(gè)片段，連接不能形成基因組?；蚪M。 兩種解決方案：兩種解決方案：1 1）縮短長度）縮短長度：DNADNA上約有上約有40

22、-50%40-50%的的DNADNA片段是片段是復(fù)制，裂解所不必需的，將之切除便可提高載量。復(fù)制，裂解所不必需的，將之切除便可提高載量。2 2）修飾酶切識別位點(diǎn)：）修飾酶切識別位點(diǎn)：利用自然選擇法獲得限制利用自然選擇法獲得限制性位點(diǎn)缺失的性位點(diǎn)缺失的品系。品系。天然的天然的-DNA-DNA上有多個(gè)酶切位點(diǎn)，如：上有多個(gè)酶切位點(diǎn)，如：EcoRI 5EcoRI 5個(gè)，個(gè)，HindIII 7HindIII 7個(gè)，這些多余的酶切位點(diǎn)必須被修飾。個(gè)，這些多余的酶切位點(diǎn)必須被修飾。自然選擇法：利用一個(gè)產(chǎn)生EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細(xì)胞的 DNA分子會(huì)被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬

23、菌體，其EcoRI位點(diǎn)缺失了。（三）（三） 噬菌體載體噬菌體載體1 1、基本組成元件、基本組成元件 CosCos位點(diǎn)位點(diǎn) 左臂（頭尾基因）左臂（頭尾基因） 右臂（裂解基因）右臂（裂解基因） 酶切位點(diǎn)酶切位點(diǎn)噬菌體載體噬菌體載體2 2、類型：、類型：插入型載體：插入型載體：含有單個(gè)或多個(gè)單一酶切含有單個(gè)或多個(gè)單一酶切位點(diǎn)供外源基因插位點(diǎn)供外源基因插替換型載體：替換型載體：含有一對或多對酶切位點(diǎn)含有一對或多對酶切位點(diǎn)便于外源基因替換便于外源基因替換插入型載體插入型載體(insertion vector)(insertion vector) 該類載體經(jīng)改造后的長度為該類載體經(jīng)改造后的長度為37kb3

24、7kb，為包裝，為包裝的下限，它本身也能被包裝，其允許的插入片段的下限，它本身也能被包裝，其允許的插入片段最大為最大為13.9kb13.9kb（54.9-37kb54.9-37kb）。）。 由于該類載體重組與否均可包裝，因而為由于該類載體重組與否均可包裝，因而為區(qū)分重組子與非重組子必須攜帶標(biāo)記基因。（區(qū)分重組子與非重組子必須攜帶標(biāo)記基因。（0-0-13.9kb13.9kb）gt10gt10：可以攜帶可以攜帶8kb8kb的的DNADNA分子，插入位于分子，插入位于cIcI基基因內(nèi)的單一的酶切位點(diǎn)因內(nèi)的單一的酶切位點(diǎn)EcoRIEcoRI。插入失活導(dǎo)致。插入失活導(dǎo)致裂解循環(huán)，從而很容易識別重組子。裂

25、解循環(huán)，從而很容易識別重組子。ZAPIIZAPII：含有多聚接頭，可以使用六種不同的含有多聚接頭，可以使用六種不同的限制性內(nèi)切酶插入約限制性內(nèi)切酶插入約10kb10kb的新的的新的DNADNA分子，通分子，通過過lacZlacZ基因的插入失活鑒定重組子，不能形基因的插入失活鑒定重組子，不能形成藍(lán)色的噬菌斑。成藍(lán)色的噬菌斑。 替換型載體替換型載體(replacement vector)(replacement vector)該類載體經(jīng)改造后的長度約為該類載體經(jīng)改造后的長度約為40kb40kb，在非必需，在非必需區(qū)域內(nèi)含有兩個(gè)相同的酶切口，兩者間的距離為區(qū)域內(nèi)含有兩個(gè)相同的酶切口，兩者間的距離為1

26、4kb14kb長，使用時(shí)用酶切開，分離去除這個(gè)長，使用時(shí)用酶切開，分離去除這個(gè)14kb14kb長的長的DNADNA片片段，然后用外源段，然后用外源DNADNA片段取代之。片段取代之。特點(diǎn)：特點(diǎn)：容量大，且有一個(gè)下限容量大，且有一個(gè)下限：40-14kb=26kb40-14kb=26kb包裝下限包裝下限為為36.4kb36.4kb，因此其載裝下限為，因此其載裝下限為10.410.4而上限為而上限為25.5kb25.5kb。 不再需要標(biāo)記基因不再需要標(biāo)記基因，因?yàn)榭蛰d的載體，因?yàn)榭蛰d的載體DNADNA只有只有26kb26kb，不可能被包裝，因而無法進(jìn)入受體細(xì)胞中去。，不可能被包裝，因而無法進(jìn)入受體細(xì)

27、胞中去。WES. BWES. B：兩個(gè)兩個(gè) EcoRIEcoRI位點(diǎn)跨越替換位點(diǎn)跨越替換區(qū)域，根據(jù)分子大小篩選重組子。區(qū)域，根據(jù)分子大小篩選重組子。 EMBL3EMBL4EMBL4：可以插入可以插入20kb20kb的的DNADNA分子，可利用分子，可利用EcoRIEcoRI、BamHIBamHI、SalISalI替換填充片段，因此替換填充片段，因此可以插入不同粘端的可以插入不同粘端的DNADNA片斷。片斷。噬菌體載體噬菌體載體3 3、體外包裝、體外包裝將重組的噬菌體將重組的噬菌體DNADNA分子與噬菌體頭、分子與噬菌體頭、尾部蛋白混合，通過自動(dòng)包裝，體尾部蛋白混合，通過自動(dòng)包裝，體外組成完整的

28、具有極強(qiáng)感染性噬菌外組成完整的具有極強(qiáng)感染性噬菌體顆粒的過程。體顆粒的過程。噬菌體載體噬菌體載體 外源基因外源基因重組噬菌體重組噬菌體DNADNA替換替換/ /插入插入噬菌體頭、尾蛋白噬菌體頭、尾蛋白子代病毒顆粒子代病毒顆粒體外包裝體外包裝宿主宿主轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染大量擴(kuò)增目的大量擴(kuò)增目的DNA DNA 感染力較低感染力較低感染力極強(qiáng)感染力極強(qiáng)噬菌體載體噬菌體載體4 4、用途：、用途： 構(gòu)建文庫，容量大構(gòu)建文庫，容量大5.-DNA5.-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)作為載體的優(yōu)點(diǎn) 1) -DNA1) -DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌能高效感染大腸桿菌2) -DNA2)

29、 -DNA作為載體，其裝載外源作為載體，其裝載外源DNADNA的的能力為能力為25kb25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量3) 3) 重組重組-DNA-DNA的篩選較為方便的篩選較為方便4) 4) 重組重組-DNA-DNA分子的提取比質(zhì)粒容易分子的提取比質(zhì)粒容易 三、三、 粘粒（粘粒（cosmid)cosmid)19781978年構(gòu)建年構(gòu)建（一）考斯質(zhì)粒（一）考斯質(zhì)粒( (粘粒，粘粒，cosmid)cosmid) ：即含有：即含有-DNA-DNA兩端兩端coscos區(qū)的質(zhì)粒。區(qū)的質(zhì)粒。-DNA包裝時(shí)，其包裝蛋白只識別粘性末端附近的一小段順序，約1.5kb長將此DNA片段與質(zhì)粒連

30、在一起，即cosmid,就可裝載更大的外源DNA片段，同時(shí)它仍可象-DNA一樣，被包裝成有感染活性的噬菌體顆粒，并高效感染大腸桿菌考斯質(zhì)粒不能在體內(nèi)被包裝，更不能裂解細(xì)胞，它的制備與質(zhì)粒相同。進(jìn)入細(xì)胞后，質(zhì)粒上的復(fù)制子進(jìn)行復(fù)制。由質(zhì)粒和噬菌體構(gòu)建而成，同時(shí)具備二者的特點(diǎn)：質(zhì)粒ori-環(huán)狀復(fù)制單一酶切位點(diǎn)選擇標(biāo)記Cos位點(diǎn)體外包裝構(gòu)建DNA文庫，容量為2945kb（二）（二） 考斯質(zhì)粒的優(yōu)越性考斯質(zhì)粒的優(yōu)越性1) 1) 能象能象-DNA-DNA一樣體外包裝，并高效導(dǎo)一樣體外包裝，并高效導(dǎo)入受體細(xì)胞入受體細(xì)胞2) 2) 容量大，如容量大，如coscos區(qū)及附近順序長為區(qū)及附近順序長為1.7 1.7

31、 kbkb，質(zhì)粒長為，質(zhì)粒長為3.3kb3.3kb，則該考斯質(zhì)粒最大可，則該考斯質(zhì)粒最大可裝載裝載46.5kb46.5kb的外源的外源DNADNA3) 3) 由于攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選由于攜帶質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，便于篩選4) 4) 由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點(diǎn)，便由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點(diǎn)，便于克隆。于克隆。以以cosmidcosmid為載體克隆為載體克隆DNADNA的技術(shù)路線的技術(shù)路線 四、四、 M13M13噬菌體載體噬菌體載體M13M13噬菌體：噬菌體：E.coliE.coli的絲狀噬菌體的絲狀噬菌體 閉環(huán)正鏈閉環(huán)正鏈ssDNAssDNA，6.4kb6.4kbM13 M13 生殖周期生殖周期向胞外分泌單鏈向胞外分泌單鏈DNADNAM13M13噬菌體載體的構(gòu)建：噬菌體載體的構(gòu)建：主要是插入標(biāo)記基主要是插入標(biāo)記基因如，因如，lacZlacZ、多克隆位點(diǎn)，消除多余的、多克隆位點(diǎn)，消除多余的酶切位點(diǎn)。酶切位點(diǎn)。M13M13噬菌體載體：用于制備單鏈?zhǔn)删w載體：用于制備單鏈DNADNA、測序、測序噬菌粒（噬菌粒（Phagemid