553988401828豬細(xì)小病毒VP2與豬圓環(huán)病毒多肽p21基因

1、豬細(xì)小病毒vp2與豬圓環(huán)病毒多肽p21基因的克隆及聯(lián)合表達(dá)孫彥欣，左玉柱，李建輝，范京惠*（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001）摘要：從河北省部分地區(qū)病豬中分離豬細(xì)小病毒，通過(guò)rt-pcr技術(shù)獲得擴(kuò)增vp2蛋白的編碼基因，采用pcr技術(shù)對(duì)豬圓環(huán)病毒的多肽p21基因進(jìn)行擴(kuò)增。分別將其連入simple-t載體中，經(jīng)酶切，pcr及序列測(cè)定法進(jìn)行鑒定。測(cè)序正確后，將vp2基因與多肽p21基因插入到pet-32a（+）載體中構(gòu)建原核表達(dá)載體。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21感受態(tài)細(xì)胞中，并用iptg誘導(dǎo)，將誘導(dǎo)產(chǎn)物用sds-page和western-blot檢測(cè)到分子量大小為85kd

2、的目的蛋白，結(jié)果顯示vp2基因與p21基因可以在大腸桿菌中獲聯(lián)合表達(dá)。western-blot試驗(yàn)證明，該蛋白可以與豬細(xì)小病毒免疫血清產(chǎn)生特異性結(jié)合反應(yīng)，具有良好的抗原性，為構(gòu)建二聯(lián)基因工程疫苗提供重要物質(zhì)基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：豬細(xì)小病毒；vp2基因；p21基因；原核表達(dá)cloning and expression of procine parvovirus and p21 polypeptide of porcine cireovirus type2sun yanxin，zuo yu-zhu，li jianhui, fan jing-hui*（college of animal science a

3、nd technology, hebei agricultural university, baoding 071000,china）abstract:procine parvovirus derived from diseased swines in some areas of hebei province, the specific vp2 gene amplified by rt-pcr was cloned into simple-t vector.a pair of primers were designed according to dna fragment of p21 poly

4、peptide of porcine cireovirus type2 , subsequent p21 encoding gene was amplified through pcr and was cloned into simple-t vector.and identified it through digested with restriction endoucleases, pcr and sequence analysis methods. after sequencing exactly, the vp2/p21gene sequence was cloned into pro

5、karyotic expression vector pet-32a (+) and the recombinant transformed into e.coli cell bl21. sds-page and western-blot. indicated that the recombinant fusion protein was about 85kd, the results have shown that vp2 /p21gene was highly expressed in e. coli and protein was consistented with the expect

6、ed molecular weight. and the western-blot experiment has demonstrated that the protein can have specific binding reaction with procine parvovirus antiserum. this study can provide a basis for developing a genetically engineered vaccine candidate against ppv/pcv2.key words: procine parvovirus; vp2 ge

7、ne; porcine cireovirus type2;prokaryotic expression豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，ppv)是一種自我復(fù)制的細(xì)小病毒，主要引起初產(chǎn)母豬的繁殖障礙1。ppv單純感染豬以外，該病毒與豬圓環(huán)病毒(porcine circovius type2，pcv2)的混合感染更為普遍。目前這兩種傳染病在豬場(chǎng)并發(fā)或繼發(fā)感染現(xiàn)象較為普遍，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬細(xì)小病毒是一種自主復(fù)制性dna病毒，其基因組編碼2種結(jié)構(gòu)多肽（vp1和vp2）及3種非結(jié)構(gòu)蛋白ns1, ns2 和 ns3 ，其中vp2核衣殼蛋白是ppv的主要保護(hù)性抗原，而且具有很

8、高的保守性2。martinez等，于1992將ppv vp2基因克隆到桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，vp2基因不僅能在昆蟲(chóng)細(xì)胞中高效表達(dá)，而且表達(dá)的蛋白能自我裝配成類病毒粒子，用其免疫母豬后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生與豬細(xì)小病毒相似的免疫應(yīng)答。3vp2基因在體外表達(dá)的蛋白形成的類病毒粒子的高效免疫原性，以及vp2基因的高度保守性，都表明vp2基因所表達(dá)的類病毒粒子是作為診斷和預(yù)防此病的良好抗原物質(zhì)?；痦?xiàng)目：作者簡(jiǎn)介：孫彥欣（1983-）河北保定人，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)碩士研究生，主要從事豬傳染病病原學(xué)及防治研究，email:sunyanxin07；電話京惠為通訊

9、作者，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究，email:jinghui76.目前，學(xué)者們分別對(duì)pcv2基因組各開(kāi)放閱讀框（orfs）及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究，并對(duì)各蛋白的細(xì)胞表位進(jìn)行了測(cè)定， stevenson等研究表明，位于orf1內(nèi)201-220位氨基酸的多肽p21，為一免疫優(yōu)勢(shì)t細(xì)胞表位4，免疫動(dòng)物后，動(dòng)物體內(nèi)的淋巴細(xì)胞明顯增多，而且免疫動(dòng)物血清中pcv2特異的抗體水平亦明顯升高。mahe等研究結(jié)果顯示，位于orf1內(nèi)185-211位氨基酸的多肽p4(與p21共享201-211氨基酸)內(nèi)存在一個(gè)b細(xì)胞表位5。以上研究結(jié)果提示，多肽p21內(nèi)存在pcv2特異的優(yōu)勢(shì)抗原表位，是研制抗原表位

10、疫苗的首選目標(biāo)表位。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)vp2基因以及多肽p21基因進(jìn)行克隆并進(jìn)行了表達(dá)，為二聯(lián)基因工程疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。 1 材料與方法1.1材料：1.11菌株、病毒株及質(zhì)粒：pet-32a-vp2-p21質(zhì)粒，含有豬細(xì)小病毒vp2基因，5端插入豬圓環(huán)病免疫優(yōu)勢(shì)t細(xì)胞表位p21多肽基因，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；原核表達(dá)載體pet-32a(+)有本實(shí)驗(yàn)室保存；豬細(xì)小病毒株由本實(shí)驗(yàn)室從河北省部分地區(qū)患豬體內(nèi)分離獲得；感受態(tài)e.coli dh5、bl21； pmd18-tsimple載體購(gòu)自大連寶生物公司。1.12主要試劑和設(shè)備：taq dna聚合酶、t4 dna連接酶、限制性內(nèi)切酶bam

11、h、xho、sal購(gòu)自大連寶生物公司。trans 2k plus dna marker、低分子量蛋白marker、預(yù)染蛋白marker購(gòu)自北京全是金生物技術(shù)有限公司；dna膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，鼠源抗ppv高免血清、鼠抗pcv2血清由本實(shí)驗(yàn)室制備保存;hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg購(gòu)自promega公司。dab顯色液購(gòu)自北京solarbio公司。1.13引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)genbank發(fā)表的豬細(xì)小病毒參考毒株nadl-2 株vp2基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增vp2編碼區(qū)基因的一對(duì)引物： 上游引物yvp2: 5 tct gtc gac（sal） at

12、g agt gaa aat gtg gaa c 3下游引物zvp2: 5 agt ctc gag (xho） tga tta acc aag taa ctg a 3根據(jù)genbank發(fā)表的豬圓環(huán)病毒的基因核苷酸序列和位于orf1內(nèi)201-220位氨基酸的多肽p21序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)寡核苷酸引物進(jìn)行p21基因的擴(kuò)增。上游引物p1：5gga tcc （bamh） atg gat gga tat cat gga gaa gaa gtt gtt gtt gtt ttg gag ga 3下游引物p2：5 gtc gac（sal ） cca agg taa cca gcc ata aaa atc atc c

13、aa aac aac aa 31.2方法：1.2.1 vp2基因片段的擴(kuò)增應(yīng)用上述擴(kuò)增vp2編碼區(qū)基因的引物，采用pcr擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)條件為：95預(yù)變性5min；94變性1 min，52退火1min，72延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72終延伸10 min；反應(yīng)結(jié)束后,pcr產(chǎn)物用1瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增結(jié)果，得到大小為1740bp目的片段。用小量凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，并連接與pmd18-t載體，并進(jìn)行酶切鑒定。1.2.2 p21基因片段的擴(kuò)增應(yīng)用上述擴(kuò)增多肽p21基因的引物采用pcr擴(kuò)增目的片段。上游引物中還引入一個(gè)起始密碼子atg,并且上、下游引物之間互補(bǔ)重疊16bp，從而互為引物

14、和模板，進(jìn)行p21基因的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：70加熱5min；23或室溫）退火5min，37延伸30min，最后70加熱10 min；反應(yīng)結(jié)束后，pcr產(chǎn)物用2瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增結(jié)果，得到大小為60bp目的片段，用小量凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，并連接與pmd18-t載體，并進(jìn)行酶切鑒定。1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建用sal和xho對(duì)pmd18-t-vp2進(jìn)行雙酶切，用sal和xho對(duì)表達(dá)載體pet-32a（+）進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生相匹配的粘性末端，然后回收純化目的片段和載體片段，經(jīng)t4 dna連接酶連接，構(gòu)建重組體pet-32a（+）-vp2；然后用sal和bamh對(duì)pmd18-t-p21進(jìn)

15、行雙酶切，用sal和bamh對(duì)重組體pet-32a（+）-vp2進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生相匹配的粘性末端，然后回收純化目的片段和載體片段，經(jīng)t4 dna連接酶連接，構(gòu)建重組體pet-32a（+）-vp2-p21；并把重組體轉(zhuǎn)化直大腸桿菌bl21感受態(tài)細(xì)胞后，小量質(zhì)粒提取試劑盒提取重組體陽(yáng)性質(zhì)粒dna，并進(jìn)行pcr和酶切鑒定。1.2.4重組質(zhì)粒pet-32a（+）-vp2-p21的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的sds-page分析將轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21的pet-32a（+）-vp2-p21重組質(zhì)粒以及pet-32a（+）空載體，分別轉(zhuǎn)接于含amp(100g/ml)的lb培養(yǎng)基中，200r/min振搖培養(yǎng)過(guò)夜，次日按

16、1100轉(zhuǎn)接于含amp的50ml lb培養(yǎng)基中,37振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(d600 nm=0.61.0)，加入終濃度為0.6mmol/l的iptg，在28振搖誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)后0、1、2、3、4、5h取菌。菌液經(jīng)12000r/min離心1min棄上清，沉淀用50l ph7.3的pbs重懸后, 加入等體積的上樣緩沖液，煮沸變性5min后，12000r/min離心1min，靜置2min，取上清，進(jìn)行sds-page電泳。1.9重組蛋白的western-blot將重組蛋白進(jìn)行sds-page電泳，然后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜（nc膜）上，再轉(zhuǎn)移至bsa封閉液中，4過(guò)夜；利用鼠源抗ppv高免血清、鼠抗pc

17、v2血清 (一抗)和hrp標(biāo)記標(biāo)記羊抗小鼠抗體(二抗)先后分別雜交,最后通過(guò)dnb顯色液顯色, 待條帶清晰后迅速用蒸餾水終止顯色反應(yīng)，鑒定表達(dá)的重組蛋白。2 結(jié)果2.1 vp2基因與多肽p21基因的pcr擴(kuò)增圖1 pcr基因的擴(kuò)增1: p21基因的pcr產(chǎn)物2: vp2基因的pcr產(chǎn)物m: trans 2k plus dna marker; fig.1 amplification of p21 gene by pcr fig.2 amplification of vp2 gene by pcrm:trans 2k plus dna marker; 1 2 mbp5000300020001000

18、750500250100601740用dna提取試劑盒提取vp2基因的dna，以yvp2/zvp2 為引物，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，于1瓊脂糖凝膠中電泳觀察結(jié)果，在約1740bp處出現(xiàn)一條特異的dna帶，與預(yù)期擴(kuò)增的vp2基因大小相符（見(jiàn)圖2）。2.4 重組體pet-32a-vp2-p21的鑒定對(duì)重組質(zhì)粒pet-32a-vp2-p21進(jìn)行雙酶切及pcr鑒定，電泳結(jié)果顯示，與預(yù)期結(jié)果相符（見(jiàn)圖2-3），說(shuō)明目的重組的基因已經(jīng)正確插入表達(dá)載體的閱讀框中。50003000200010007505002501001 2 m bp1800bp圖3重組質(zhì)粒pet-32a-vp2-p21的pcr鑒定fig.1 id

19、entification for recombinant virus by pcrm:trans2k plus dna marker 1-2:重組vp2+p21基因的pcr產(chǎn)物;1-2: recombinant virus product of pcr.圖2重組質(zhì)粒pet-32a-vp2-p21的酶切鑒定fig.1 identification of the plasmid pet-32a-vp2-p21m:trans2k plus dna marker1:bamh和xho雙酶切產(chǎn)物;2: sal和xho雙酶切產(chǎn)物3.bamh和sal雙酶切產(chǎn)物1: double enzyme digestio

20、n by bamh和xho2: double enzyme digestion by sal和xho3: double enzyme digestion by bamh和sal1 2 3 m bp50003000200010007505002501001800_174060_2.5 表達(dá)產(chǎn)物的sds-page分析圖4 誘導(dǎo)不同時(shí)間重組菌的sds-page分析fig.4 identification of the amount of pet-32-vp2-p21 expressed from the recombinant protein in different time1: pet-32a空

21、載誘導(dǎo)前0h; 2:pet-32a空載誘導(dǎo)后3h; m:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn); 39: pet-32a-vp2-p21誘導(dǎo)1h,2h,3h,4h,5h,6h,7h1: uninduced plasmid in 0h; 2: uninduced plasmid in 5h; m:marker; 39: induced in 1h,2h,3h,4h,5h,6h,7h1 2 m 3 4 5 6 7 8 9 85kdkd10062403024將含有陽(yáng)性重組載體在iptg誘導(dǎo)下，不同誘導(dǎo)時(shí)間的產(chǎn)物經(jīng)sds-page檢測(cè)，結(jié)果在約85kd處可見(jiàn)表達(dá)條帶，與預(yù)期蛋白大小相一致（見(jiàn)圖4），而未誘導(dǎo)菌和空載體菌誘導(dǎo)后，均

22、沒(méi)有出現(xiàn)此蛋白條帶，與誘導(dǎo)前對(duì)照菌相比（用微波掃描儀分析），誘導(dǎo)5h時(shí)表達(dá)量最高，且表達(dá)量約占總體蛋白的30%。2.6重組蛋白 western-blot檢測(cè)100kd62kd40kd 30kd24kd85kdm 1 2 bm 1 2175kd80kd58kd46kd30kd23kda85kd858585858585kd圖5重組蛋白wester-blot檢測(cè)fig.5 identification for recombinant protein by wester-blota: 利用鼠源抗ppv高免血清為一抗的wester-blot檢測(cè)b: 利用鼠源抗pcv2高免血清為一抗的wester-blo

23、t檢測(cè)a: western-blot analysis of the recombinant protein reacted with anti-ppv antiserumb: western-blot analysis of the recombinant protein reacted with anti-pcv2 antiserum利用鼠源抗ppv高免血清、鼠抗pcv2血清(一抗)和hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg (二抗)先后分別雜交,最后通過(guò)dab顯色液顯色, 待條帶清晰后迅速用蒸餾水終止顯色反應(yīng)，鑒定表達(dá)的重組蛋白。3 討論基因工程亞單位疫苗(subunit vaccine) 不含感染性組

24、分,所以無(wú)需滅活,也無(wú)致病性。細(xì)小病毒的免疫方式主要是體液免疫,同時(shí)細(xì)小病毒的基因組較小,比較容易在載體上獲得表達(dá)。vp2蛋白是病毒粒子的主要結(jié)構(gòu)蛋白,占總衣殼蛋白的60%以上,是ppv的主要免疫原性抗原 6 。vp2蛋白在體外表達(dá)后可以自我裝配成病毒樣顆粒,且在其5端連接一小段基因不影響病毒樣顆粒形成,并且具有較好的免疫原性。sedlik等研究結(jié)果表明,ppv vp2蛋白具有獨(dú)特的生物學(xué)特性,其形成的病毒樣顆粒不僅穩(wěn)定性高、免疫原性好,而且可高效提高其他病原的免疫原性t細(xì)胞表位多肽,誘導(dǎo)機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)ppv的體液免疫和針對(duì)其他病原的細(xì)胞免疫7-8。因此,用基因工程的方法生產(chǎn)ppv亞單位疫苗

25、是一條較好的途徑。本研究擴(kuò)增并克隆了豬細(xì)小病毒vp2與豬圓環(huán)病毒多肽p21基因，構(gòu)建的pet-32a-vp2-p21重組體系統(tǒng)在iptg誘導(dǎo)下于大腸桿菌中成功表達(dá)了重組蛋白，本試驗(yàn)對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行了western blot檢測(cè)，檢測(cè)后確定所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小約為85ku,且具有天然蛋白的抗原特性,為構(gòu)建豬細(xì)小病毒與豬圓環(huán)病毒二聯(lián)基因工程疫苗提供重要物質(zhì)基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)（references）1 carwright,s.f.;and huck,r.a.1967.viruses isolated in association with herd infertility, abortions

26、 and stillbirths in pigs.vet rec 81:196-197.2 cotmore s f,tattersall p.1987.the autormously replicating parvoviruses of vertebrates. adv.virus res,33:91174.3martinez c, dalsgaard k, lopez de turiso j a, et al. production of porcine parvovirus empty capsids with high immunogenic activity j. vaccine 1992，10: 684-690.4stevenso