姜油酮在太平洋白對蝦幼體(南美白對蝦)的膳食管理上有促增長、增強非特異性免疫應(yīng)答和抵抗溶藻弧菌的作用

1、姜油酮在太平洋白對蝦幼體（南美白對蝦）的膳食管理上有促增長、增強非特異性免疫應(yīng)答和抵抗溶藻弧菌的作用摘要11.引言12材料和方法42.1飼料的準(zhǔn)備42.2蝦的飼養(yǎng)52.3 蝦的增長和存活情況52.4 蝦對溶藻弧菌的敏感性62.5非特異性免疫應(yīng)到實驗62.5.1總血細(xì)胞的測定72.5.2 酚氧化酶（PO）活性的測定72.5.3呼吸爆發(fā)的測定72.5.4 超氧化物歧化酶SOD的測定82.5.5 吞噬活性的測定82.5.6溶菌酶活性的測定92.6 統(tǒng)計分析93 結(jié)果103.1 蝦生長和存活的情況103.2 面對溶藻弧菌時含姜油酮的飼料對南美白對蝦的存活所起的作用103.3喂了含姜油酮飼料蝦的免疫參數(shù)

2、114 討論16參考文獻(xiàn)：18摘要姜油酮是姜的一種活性成分，它是一種酚醛樹脂烷酮有著抗氧化和抗炎癥的特性。主要研究了姜油酮在太平洋白對蝦幼體的生長、免疫和抵抗疾病上的作用。四種實驗飲食，包括一個空白對照（沒有姜油酮）和分別使用了含有1、2.5、5mg姜油酮。56天的培養(yǎng)之后，喂了補充1、2.5、5mg姜油酮飲食的蝦與空白對照相比在體重和飼料轉(zhuǎn)化率上有明顯的增加。而且，培養(yǎng)了56天，通過24-72小時的病菌和溶藻弧菌的挑戰(zhàn)之后得知，喂了所有劑量姜油酮食物的蝦與空白對照比有更高的存活率。重要的是喂了所有劑量的姜油酮的飼料的蝦酚氧化酶水平明顯增加，并且喂了2.5、5mg姜油酮蝦的呼吸爆發(fā)、溶菌酶和吞

3、噬活性也有顯著增加。并且不同的劑量和空白對照，不管是總的血細(xì)胞數(shù)還是超氧化物歧化酶的活性都有明顯的增加。結(jié)果表明姜油酮可以被認(rèn)為是使蝦飼料的補充物，從而使蝦的生長、免疫、和抵抗病原體和溶藻弧菌的抗病性增加。使用姜油酮作為開胃物和免疫刺激劑是有希望的。1.引言 水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的飼料產(chǎn)品經(jīng)常消耗大部分的野生漁業(yè)產(chǎn)品。既然許多來自植物的混合物有許多活性被人們所熟知，比如抗應(yīng)激、促生長、開胃、滋補、免疫刺激劑和抗菌的特性，決定了怎樣從植物中來發(fā)展經(jīng)濟(jì)健康的飼料產(chǎn)品已經(jīng)成為水產(chǎn)業(yè)感興趣的話題。因此，為了預(yù)防和控制蝦疾病，與病理學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)相比，對營養(yǎng)、環(huán)境和生態(tài)毒理學(xué)的研究對于探索蝦免疫力的了解同樣很

4、重要。 姜，最長時間被人們使用的一種草本植物，已經(jīng)廣泛的用于傳統(tǒng)的中國、印度和日本的醫(yī)藥方面已超過25世紀(jì)。之前的研究表明姜在抗氧化、抗炎癥、降血脂、抗癌、防暈、抗血栓形成、心血管疾病和抗菌過程中扮演多種角色。許多研究也表明姜對于許多水生動物的生長和免疫系統(tǒng)是有利的。比如，姜的使用可以使斑節(jié)對蝦幼體后期有顯著的體重的增加和特定的生長速率，并且增加了羅非魚抵抗病原體的能力。 姜的主要成分有姜油酮、姜酮酚、姜酚和姜烯酚。其中一個由Z. officinale分離出的活性成分是姜油酮，一種酚醛樹脂烷酮包括一個辣椒素結(jié)構(gòu)（3-甲基-4-羥基苯），它是使姜有辛辣味道的主要有機(jī)化合物。在早期的研究中表明姜油

5、酮在哺乳動物的幾個功能反應(yīng)中起重要的左右，比如提高抗炎、抗氧化效果、清除輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基，保護(hù)輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用。除此之外，姜油酮在大鼠模型中，可以通過廢除過多的胃腸蠕動來有效的治療胃腸過度蠕動而產(chǎn)生的腹瀉。 太平洋白對蝦，南美白對蝦天然生長在中南美洲的太平洋沿岸，并且在許多國家普遍作為食物被捕撈和養(yǎng)殖。2008年在臺灣南美白對蝦的水產(chǎn)品達(dá)到了10361公噸。作為主要的養(yǎng)殖蝦的物種，蝦的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)由于感染了病毒和細(xì)菌經(jīng)常遭到了重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，提高太平洋白對蝦的免疫力和抗病力，對于蝦的養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展是非常重要的。 之前的研究表明總血細(xì)胞計數(shù)、微分血細(xì)胞計數(shù)、酚氧化酶活性、呼吸爆發(fā)

6、、超氧化物歧化酶活性通常作為評估免疫特性的功能參數(shù)。甲殼綱的血細(xì)胞包括透明細(xì)胞、半顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞都屬于吞噬細(xì)胞并且黑色素產(chǎn)物是由酚氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的。吞噬細(xì)胞是抵抗反映的常見細(xì)胞，并普遍被認(rèn)為是清楚微生物和外源顆粒的主要的途徑。在病原體進(jìn)入血淋巴后，宿主細(xì)胞的NADPH氧化酶被激活，它將依次降低氧原子，隨后產(chǎn)生幾種反應(yīng)氧中介物，如超氧陰離子、羥基、單態(tài)氧和過氧化氫。 超氧陰離子的釋放被認(rèn)為是呼吸爆發(fā)，并在殺菌劑的活性中起著重要的作用。超氧化物歧化酶也被認(rèn)為能催化歧化作用快速的兩步，通過減少和氧化金屬離子的活性位點來使有毒的超氧化物陰離子變成氧分子和過氧化氫。而且，溶菌酶是抗菌多肽家族的一員。

7、它通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的-1,4糖苷鍵，并作為天然免疫重要的生物反應(yīng)器。這些參數(shù)已經(jīng)在南美白對蝦上有報道。 這項研究的目的是決定在太平洋白對蝦上使用姜油酮是否能夠增加生長速率、提高免疫力、和對弧菌的疾病抵抗力。被檢測的免疫參數(shù)包括總南美白對蝦的血細(xì)胞數(shù)、酚氧化酶活性、呼吸爆發(fā)、超氧化物歧化酶活性、吞噬活性和溶菌酶活性，和喂了含姜油酮飼料的蝦對溶藻弧菌的敏感性。2材料和方法2.1飼料的準(zhǔn)備表1是實驗飼料的設(shè)計，實驗飼料中姜油酮的水平隨著總的纖維素含量的下降分別為1，2.5，5mg。材料在錘式粉碎機(jī)上研磨直到能通過60網(wǎng)篩，實驗飼料是準(zhǔn)備好的混合的干的組分加魚油，再加水直到硬的面團(tuán)形成。每種飼

8、料都要經(jīng)過碎肉機(jī)，形成意大利細(xì)面條式的短的鏈型，并在干燥箱中35使用鼓風(fēng)機(jī)使?jié)穸冗_(dá)到10%。干燥后的小球放在4的小盒中直到被使用。實驗飼料的常規(guī)分析表明濕度(6.78%-7.63%)、灰(16.33%-16.76%), 粗蛋白(46.25%-46.73%), 或醚提取物(15.59%-15.87%)水平在實驗飼料上沒有明顯的不同。2.2蝦的飼養(yǎng)南美白對蝦的幼體由國際屏東科技學(xué)校的水產(chǎn)部門提供.到達(dá)以后把他們放在玻璃纖維強化塑料箱適應(yīng)實驗室的環(huán)境7天，并喂一種商業(yè)飼料。實驗條件在試驗階段要與實驗開始時相似。 總共有五個實驗組。480只蝦隨機(jī)分成四個實驗組，分別為一組空白對照（喂沒有添加姜油酮的飼

9、料），另外三組飼料分別添加了1，2.5，5mg的姜油酮。每組有三個重復(fù)，每個重復(fù)有四十只蝦放在放在1噸的可循環(huán)利用的玻璃纖維強化塑料箱內(nèi)，里面裝有0.8噸的水 ，水的鹽度是32：其中10只蝦用于敏感實驗，30只蝦作為免疫應(yīng)答實驗。對于敏感實驗，另外30只作為空白對照組喂不含姜油酮的飼料，之后再注射20ml的生理鹽水。一個單獨的通氧石塊使溶解氧維持在6 mg L-1。在08：00和17：00時，蝦按體重的8%來喂食兩次。這個總量接近于蝦在適應(yīng)環(huán)境階段每天最大的消耗量。沒有被吃的食物在喂食1小時后收集起來，立即放在80的烘箱烘干?？偟膶嶒灥氖澄锪康扔跍p去沒有被吃的部分，數(shù)據(jù)每天記錄一次。在實驗階段

10、，水的溫度維持在281，ph在7.8-8.0，鹽度是32。2.3 蝦的增長和存活情況在56天飼養(yǎng)實驗之后，在每一個水族箱中的蝦進(jìn)行批量稱重。蝦的增長是通過測量在水族箱中存活的的蝦的體重增長百分比，計算公式是100（最后的體重-最初的體重）/最初的體重，飼養(yǎng)率=（最后的體重-最初的體重）/采食量。2.4 蝦對溶藻弧菌的敏感性溶藻弧菌是從患病的南美白對蝦中分離出來的。一個被用于研究的是已知的南美白對蝦的病原種系，它是從臺灣屏東被感染的南美白對蝦中分離得到。在胰胨大豆瓊脂斜面在28培養(yǎng)24個小時，在轉(zhuǎn)接到胰化蛋白大豆液體培養(yǎng)基在28培養(yǎng)24個小時。液體培養(yǎng)基在47155g離心20分鐘。倒掉上清液，沉

11、淀用0.85%的鹽溶液重懸沉淀，107CFUml-1用于敏感實驗。 56天的飼養(yǎng)實驗最后時期，從5個實驗組中數(shù)150只蝦進(jìn)行稱重，每組選30只。2.5非特異性免疫應(yīng)到實驗 這里有4個實驗組，每一組包括三個重復(fù)。對于每個重復(fù)，每個實驗組有30只蝦，隨即取樣來評估免疫參數(shù)包括：總的血細(xì)胞數(shù)、酚氧化酶活性、呼吸爆發(fā)、超氧化物歧化酶活性、吞噬活性和溶菌酶活性。最后總的稱重之后，把每只蝦的污漬弄干，并用一個帶有25標(biāo)準(zhǔn)尺寸針頭的1ml的注射器從每只蝦的腹血竇抽取血淋巴，針頭要用抗凝劑（包括30mM的檸檬酸三鈉、0.34mM氯化鈉、10mM乙二胺四乙酸EDTA、0.12M葡萄糖、ph7.55并用葡萄糖使?jié)B

12、透壓調(diào)到780mOsmkg-1）潤洗。血淋巴放在實驗管中，并立即用等體積的抗凝劑來稀釋防止凝結(jié)并使血淋巴保持完整。2.5.1總血細(xì)胞的測定 100ul的血淋巴用900的抗凝劑溶液包括30mM的檸檬酸三鈉、0.34mM氯化鈉、10mM乙二胺四乙酸EDTA、0.12M葡萄糖、ph7.55并用葡萄糖使?jié)B透壓調(diào)到780mOsmkg-1）混合。一滴稀釋的血淋巴放在血細(xì)胞計數(shù)器上用倒置相差顯微鏡(奧林巴斯 IX 71，日本東京)測量THC。2.5.2 酚氧化酶（PO）活性的測定PO活性是用分光光度計來測量由苯丙氨酸形成的多巴色素，這是根據(jù)之前的研究過程。蝦PO活性的光密度是用50ul的血淋巴形成的多巴色素

13、來表示的。2.5.3呼吸爆發(fā)的測定 血淋巴O2-的活性是根據(jù)之前的描述用氮藍(lán)四唑的減少生成甲瓚的方法來進(jìn)行測量超氧化物陰離子的含量。簡言之，100ul含有抗凝劑溶液的血淋巴放在多空板上，之前涂油L型多聚賴氨酸的用以提高細(xì)胞的粘著力。這個多空板在700g離心20分鐘。血漿被除去后，添加100ul酵母聚糖(0.1%改進(jìn)的完全漢克平衡鹽溶液HBSS：10mM氯化鈣、3mM氯化鎂、5mM的硫酸鎂)并在室溫反應(yīng)30min。丟掉酵母聚糖，血細(xì)胞用100ul的改進(jìn)的完全的HBSS洗三次，并用100ul的NBT溶液（0.3%）在室溫下浸染30min。移去NBT溶液并用100%的甲醇混合，再用70%的乙醇洗三次

14、，風(fēng)干。甲瓚通過添加120ul的2M KOH和140ul二甲亞砜DMSO來溶解.在630nm的光密度用酶標(biāo)儀來測定。呼吸爆發(fā)用50ul血細(xì)胞的NTB的減少來表示。2.5.4 超氧化物歧化酶SOD的測定 細(xì)胞超氧化物歧化酶的活性是用一個工具包（英國郎道，克拉姆林，英國）通過抑制超氧游離基的獨立反應(yīng)來測量的。簡言之，1.7ml的反應(yīng)混合物包括0.05mM黃嘌呤和0.025mM的2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑氯溶解在50mM丙磺酸和0.94Mmedta.在250ul有80ul的黃嘌呤氧化酶、超氧化物、和尿酸，它們是由黃嘌呤產(chǎn)生的。超氧游離基然后和INT反應(yīng)產(chǎn)生紅色的甲瓚染料。

15、在505nm，37測OD值。反應(yīng)速率是加入黃嘌呤氧化酶3min后吸光值為0.5時來進(jìn)行測定。Ransod kit提供一個SOD的參考標(biāo)準(zhǔn)。特殊的活性是用SOD U（g蛋白）來表達(dá)。2.5.5 吞噬活性的測定 吞噬活性是根據(jù)之前研究的方法來進(jìn)行分析的。對于吞噬活性和清除效率的測定，20ul含蝦的2107CFU的細(xì)菌懸液注射到腹血竇。注射之后，把蝦放在含有40L水的分離池養(yǎng)殖3h。之后2從腹血竇中吸取200ul的血淋巴并與200ul的無菌抗凝劑混合?；旌虾蟮臉悠菲骄譃閮煞荩渲幸环萦糜跍y量吞噬活性。 吞噬活性是用Liu和 Chen描述的方法來分析的。吞噬活性被定義為對溶藻弧菌的吞噬速率（PR）如

16、：PR=吞噬血細(xì)胞數(shù)/總的血細(xì)胞數(shù)100%。2.5.6溶菌酶活性的測定溶菌酶活性是根據(jù)之前描述的方法來進(jìn)行測定的。離心500ul的稀釋的血細(xì)胞，沉淀物混有1ml的（0.02%）溶壁微球菌。這個反應(yīng)是在室溫下進(jìn)行，并測量為30s和4.5分鐘的吸光值。一個溶菌酶活性單位被定義為每分鐘使吸光值降低0.01的樣品總量。2.6 統(tǒng)計分析 Tukey的多重比較實驗是利用SAS電腦軟件來比較實驗組的顯著差異。所有的數(shù)據(jù)(敏感性的研究)在分析之前要使用反正弦變換使其標(biāo)準(zhǔn)化。要求數(shù)據(jù)的顯著差異p0.05.3 結(jié)果3.1 蝦生長和存活的情況在56天的飼養(yǎng)實驗之后，分別喂了1，2.5，和5mg的姜油酮的蝦體重增加的

17、多，沒喂含姜油酮添加物飼料的蝦增長最少（p0.05）(Table 2).在處理的過程中蝦的存活率是96.7%93.3%，在研究條件下養(yǎng)殖，蝦的生長是標(biāo)準(zhǔn)的。3.2 面對溶藻弧菌時含姜油酮的飼料對南美白對蝦的存活所起的作用養(yǎng)殖56天之后，隨機(jī)選取蝦來進(jìn)行病原菌實驗（溶藻弧菌）。所有的空白對照組的蝦都存活。在空白對照組，致死率發(fā)生在注射溶藻弧菌12h之后。在24-60小時挑戰(zhàn)后，喂了含1，2.5，和5mg的姜油酮飼料的下的存活率明顯明顯高于空白對照組（p 0.05）(Table 3).最后72小時，空白對照組和喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg飼料的實驗組的存活率分別是50%, 56.7%,

18、83.3%, 和86.7%。而且喂了2.5，和5mg的姜油酮/kg飼料的蝦的存活率比喂了1mg姜油酮/kg飼料的實驗組和空白對照組的存活率高。3.3喂了含姜油酮飼料蝦的免疫參數(shù) 圖1中展示了喂了含姜油酮飼料和空白對照后，養(yǎng)殖56天蝦的血細(xì)胞總數(shù)THCs和酚氧化酶活性PO。根據(jù)記錄蝦的總血細(xì)胞數(shù)沒有顯著差異，空白對照組和喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg飼料的實驗組的總血細(xì)胞分別為(11.4 1.52) 108,(12.11.01) 108, (13.5 1.03) 108, 和 (14.21.53) 108細(xì)胞ml_1。（表1A）蝦在所有含姜油酮的實驗組與空白對照相比更高的酚氧化酶活性?？?/p>

19、白對照組和喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg飼料的實驗組的酚氧化酶活性分別為0.150.02, 0.320.01, 0.350.03,和 0.360.03。（表1B） 喂了2.5，和5mg的姜油酮/kg飼料的蝦與空白對照和喂了1mg的姜油酮/kg飼料的實驗組相比有更高的呼吸爆發(fā)?？瞻讓φ战M和喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg飼料的實驗組的呼吸爆發(fā)分別為0.120.02, 0.130.01, 0.160.03,和 0.170.01。(圖 2A).培養(yǎng)56天后，對照組和實驗組的超氧化物歧化酶沒有顯著差異。對照組和實驗組SOD的活性的范圍是1.56-1.71U/g蛋白。 (圖 2B).含姜油

20、酮的飼料對溶藻弧菌的噬菌作用和溶菌酶活性的效應(yīng)在表3中表示。喂了2.5，和5mg的姜油酮/kg飼料的蝦與空白對照和喂了1mg的姜油酮/kg飼料的實驗組（p 0.05）相比噬菌作用和溶菌酶活性有顯著的增加?？瞻讓φ蘸臀沽?，2.5，和5mg的姜油酮/kg飼料的蝦吞噬活性分別是10.5%1.13%, 11.3%0.95%,14.2% 1.52%, 和 14.6%1.27%,(圖 3A). 空白對照和喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg飼料的蝦溶菌酶活性分別是2.02 0.23 Units mL_1, 2.15 0.18 Units mL_1, 2.74 0.22 Units mL_1 and 2

21、.960.23 Units mL_1, ,(圖 2B).4 討論姜是一種很強的抗氧化物質(zhì)，并被認(rèn)為是一種只有很少不明顯副作用的安全的草本藥物。盡管已經(jīng)有很多研究表明姜有利于動物的增長，但很少研究調(diào)查它對蝦的免疫應(yīng)答和疾病的抵抗。除此之外，之前在姜上的研究主要在它的提取物上，很少研究它成分的作用?，F(xiàn)在的研究表明姜油酮是一種藥用的活性成分，對提高太平洋白對蝦的生長率和對溶藻弧菌的疾病抵抗力上有顯著的成效。 為了發(fā)展可選擇的方法來提高水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)增長率，使用姜的提取物來提高硬骨魚和蝦生長。比如，喂了姜的虹鱒魚在生長、飼料轉(zhuǎn)化率、蛋白效率上有明顯的增長。在飼料里添加姜的丙酮提取物來提高羅非魚的增長已經(jīng)被

22、報道。在甲殼類，給一角鯨屬的后期幼體喂姜強化鹵蟲后在體重和單位生長速率有顯著的提高。姜比例的增加相應(yīng)的提高飼料的轉(zhuǎn)化率。而且隨著姜含量的增加消化酶活性也有顯著的提高。目前的研究是從姜里分離出來一種組分并進(jìn)一步分析它在太平洋白對蝦上的作用。喂了1，2.5，和5mg的姜油酮/kg飼料的蝦都表明在體重和FE與空白組相比都有明顯的增加。從表2得知，5mg的姜油酮/kg提高生長66%的結(jié)果是非有前景的。這些結(jié)果表示與之前研究的喂含姜提取物飼料的蝦相比，喂姜油酮的蝦長的更好。這表明姜里面的姜油酮在蝦的生長和FE上起著積極的作用。 對于蝦的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)決定怎樣提高疾病的抵抗力是非常重要的。藥草提取物在面對病原體的挑戰(zhàn)時可降低魚和蝦的致死率。既然免疫增強劑可以通過提高細(xì)胞的吞噬作用、殺菌活性、PO活性和呼吸爆發(fā)來提高非特異性免