【doc】正交設(shè)計法優(yōu)選亞麻籽餅粕中亞麻木酚素的提取工藝

1、正交設(shè)計法優(yōu)選亞麻籽餅粕中亞麻木酚素的提取工藝天津農(nóng)業(yè)科學(xué)tianjinagriculturalsciences?生物技術(shù)正交設(shè)計法優(yōu)選亞麻籽餅粕中亞麻木酚素的提取工藝陳志強(qiáng)1.,高嵐,鄭躍,王昌祿(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津市食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實驗室,天津300222;2.天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司,天津300457)摘要:通過對亞麻籽餅粕中開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷的提取工藝進(jìn)行正交試驗,并結(jié)合tlc結(jié)果,確定了提取溶劑為0.1molkoh溶于1l70%乙醇,料液比為1:8,提取5h.然后利用大孔吸附樹脂與tlc相結(jié)合的方法,探討了亞麻籽中sdg的分離純化,并根

2、據(jù)hplc分析結(jié)果確定了最佳的分離純化工藝條件.結(jié)果表明:koh一乙醇一水提取與大孔吸附樹脂相結(jié)合制備sdg提取物的方法與傳統(tǒng)分離方法相比,得率高,工藝操作簡單且安全無毒.關(guān)鍵詞:亞麻籽餅粕;亞麻木酚素;正交試驗;薄層層析;高效液相中圖分類號:$563.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼:a文章編號:10066500(2008)02000103optimizationofextractiontechnologyofnaldesigndiglucosideinflaxseedcakebyorthogo-chenzhiqiang一,gaolan,zhengyue,wangchanglu(1.tianjinkeylabo

3、ratoryoffoodnutritionandsafety,facultyoffoodengineeringandbiotechnology,tianjinuniversityofscienceandtechnology,tianjin300222,china;2.jianfengnaturalproductresearchanddevelopmentco.,ltd,tianjin300457,china)abstract:extractionsolvent(o.1toolkohdissolvedin1l70%ethano1),the1:8ratioofmaterialtoliquid,an

4、d5hextractedtimewerefixed,accordingtothesdgextractionprocessoptimizedbyorthogonaldesignandtheresultsoftlc.then,suitablemacroporousadsorptionresin(dm-21)waschosentoseparatesdg.identificationofsdganddeterminationofpurityoftargetedfractionwascarriedoutwithhplc.itwasfoundthatthecombinationofkohethanol-w

5、aterandmaeroporousadsorptioncouldimprovetheyieldofsdg,andwasmoresimpleandsafecomparedwithconventionalextractionmethod.keywords:flaxseedcake;sdg;orthogonaldesign;tlc;hplc木酚素(也稱木脂素)是植物中含有的一類生理調(diào)節(jié)物質(zhì),可分為游離的脂溶性木酚素(1igans)和含糖基的水溶性木酚素flignanglucosides).亞麻(linumustitatissimumlinaceae1籽種皮中富含木酚素類物質(zhì),其中以異落葉松樹脂酚二

6、葡萄糖苷fsecoisolariciresinoldiglucoside,簡稱sdg)為最主要的活性成分.sdg具有抑制人體乳癌細(xì)胞生長【21,減輕婦女絕經(jīng)期癥狀【31,預(yù)防結(jié)腸癌,前列腺癌,增強(qiáng)自身免疫功能等作用.sdg的提取方法常見的是有機(jī)溶劑提取【4】,超臨界流體萃取5】,酶法提取【61,微波輔助提取法【7】等,但是這些提取方法,均沒有考慮到sdg在亞麻籽餅粕中是與某些不確定成分結(jié)合成絡(luò)合物而存在的,導(dǎo)致提取率很低或者根本提取不到sdg.本研究采用正交試驗法優(yōu)化koh一乙醇一水提取sdg工藝,并與大孔吸附樹脂相結(jié)合制備和純化sdg提取物,可望提高工藝安全性和經(jīng)濟(jì)性,并為工業(yè)化分離純化sd

7、g提供理論依據(jù).1材料和方法1.1材料與儀器原料:亞麻籽餅粕由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供.主要儀器:shimadzuscl一6a高效液相色譜儀(日本島津公司).化學(xué)試劑:sdg標(biāo)準(zhǔn)品由chromadexinc提供;dm一21型大孑l樹脂,山東魯抗樹脂廠提供;乙醇,氫氧化鉀為分析純,甲醇為色譜純.收稿日期:20071210:修訂日期:20080305基金項目:天津科技大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動基金(20060439,020o096)作者簡介:陳志強(qiáng)(1972一),男,天津人,副教授,博士,主要從事食品生物技術(shù)研究.天津農(nóng)業(yè)科學(xué)第l4卷1.2試驗方法1.2.1樹脂處理將dm一21型大孔吸附樹脂

8、濕態(tài)裝柱,用3bv的乙醇通柱處理,流速為2bv/h;水洗至無味或乙醇含量小于1%;然后用3bv的4%氫氧化鈉溶液浸泡2h,通柱,流速為2bv/h;水洗至ph為7;再用3bv的4%鹽酸或硫酸溶液浸泡2h,通柱處理;水洗至ph67,備用.1.2.2sdg薄層層析ftlc1方法的建立毛細(xì)管吸取樣品溶液于硅膠板(gf254)上點(diǎn)樣,吹干溶劑后,置于展開劑中展開完全.取出薄層層析板吹干,用硫酸乙醇溶液顯色,計算比移值rf.1.2.3正交試驗優(yōu)化koh一乙醇一水法提取sdg(1)配制醇堿溶液配制不同濃度的乙醇溶液(以酒精計),根據(jù)乙醇量加入一定量的氫氧化鉀,配成4%(w/v)濃度的氫氧化鉀醇溶液.(2)配

9、制硫酸醇溶液量取一定量濃硫酸,再加入一定量的無水乙醇,使其成為20%(v/v)的硫酸醇溶液.(3)sdg提取正交試驗每份試驗樣品準(zhǔn)確稱取50.0g亞麻籽餅粕放人容器,采用(3)做正交試驗,按亞麻籽餅粕與醇堿溶液的不同比例(w/v)加入醇堿溶液,攪拌一定時間后,緩慢加入20%硫酸醇溶液中和,邊加邊測定溶液的ph值,使提取液的ph為7.過濾,濾渣用70%乙醇反復(fù)洗至流出液點(diǎn)tlc無顯色為止,濾液濃縮(縮至無乙醇昧).試驗因素與水平如表1.表l試驗因素水平1.2.4sdg粗提液的分離純化將濃縮后的粗提液分別上樹脂柱,繼續(xù)用蒸餾水洗去雜質(zhì)直至流出液清澈.用60%的乙醇溶液洗脫柱子,洗至流出液tlc檢測

10、無亞麻木酚素時停止.合并乙醇洗脫液,濃縮干燥.再將樣品在100cc水浴中用無水乙醇反復(fù)回流,直至流出液tlc檢測無亞麻木酚素時停止.合并溶液,濃縮干燥得純化樣品.1.2.5hplc法測定sdg的含量色譜條件為kromasilc一18色譜柱(4.6mm250mm,5m);紫外檢測波長280nm;柱溫25oc;流速1.0ml/min;流動相,甲醇一水(20:80),梯度洗脫,020min;進(jìn)樣量l0l.準(zhǔn)確稱取一定量sdg標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配成濃度為1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以2,4,6,8,10i進(jìn)樣,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.精密吸取每組樣品溶液,進(jìn)行測定.1.2.6方法考察(1)精密度試驗精確吸取同一供試樣品

11、溶液,相同液相條件下重復(fù)進(jìn)樣6次,每次10l,進(jìn)行hplc分析.測得樣品峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd1為1.18%.(2)重復(fù)性試驗精確稱取同一批樣品,按樣品測定方法平行分析5次.平均含量為32.934%,rsd=1.67%(n=5).(3)穩(wěn)定性試驗同一濃度的樣品每天進(jìn)樣一次,連續(xù)6d測定樣品含量.平均含量為28.45%,rsd=1.02%(n=6),表明供試溶液穩(wěn)定.(4)加樣回收率試驗精確稱取sdg標(biāo)品0.03g,甲醇溶解至50ml備用.精確稱取已知sdg含量的樣品9份,每份0.1g,處理后加入相同量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,測定sdg含量.平均回收率為99.28%,rsd=1.22%(n=91.2結(jié)果

12、與分析2.1正交試驗結(jié)果由表2結(jié)果可知,各因素對sdg提取率影響依次為a>b>c,即乙醇濃度和物料比對sdg提取影響較大.結(jié)合生產(chǎn)實際中提取效果和時問,并根據(jù)tlc檢測結(jié)果,確定了a:b:c,提取條件較為合適,即提取溶劑為0.1too!koh溶于11.70%乙醇,料液比為1:8,提取5h時,sdg提取的較為完全.2.2樹脂型號及tlc條件吸附量和選擇性是衡量大孔樹脂分離天然產(chǎn)物的重要指標(biāo),雖然sdg是一個二糖苷,具有一定極性,但實際應(yīng)用中,樹脂的極性,比表面積和合適的孔徑都對目標(biāo)提取物的吸附和解吸率起一定作用.試驗結(jié)果顯示,dm一21型大孔吸附樹脂對sdg選擇性好,靜態(tài)飽和吸附量和

13、解吸率較高.當(dāng)展開體系為正丁醇一乙酸一水(4:1:5)或乙酸第2期陳志強(qiáng)等:正交設(shè)計法優(yōu)選亞麻籽餅粕中亞麻木酚素的提取工藝表2正交試驗及直觀分析結(jié)果乙酯一甲酸一水f8:1:11時,分離效果較好,sdg的rf值約為0.49.顯色劑為20%硫酸醇液,或在254ilm紫外熒光顯色,含sdg的點(diǎn)顯紫色.2.3sdg分離純化及hplc法含量測定將粗提物重新用dm一21大孔吸附樹脂吸附,水洗除雜質(zhì),60%乙醇洗脫,洗脫液經(jīng)濃縮干燥,再將樣品在100oc水浴中用無水乙醇反復(fù)回流,干燥后得純化樣品.與標(biāo)品色譜條件相同,采用甲醇水體系,梯度為甲醇20%100%,20min條件下hplc檢測,樣品出峰與標(biāo)品一致.

14、以峰面積(y)對進(jìn)樣量()進(jìn)行線性回歸,回歸方程及相關(guān)系數(shù)為:y=41278.2x+564,r=0.9996,色譜峰峰面積與進(jìn)樣t/rnint/mint/minabc圖1a.b,c樣品的高效液相色譜圖量關(guān)系良好.原亞麻籽餅粕含sdg為1.64%,純化后sdg的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.93%.圖1分別為a:sdg標(biāo)準(zhǔn)品,b:堿乙醇法sdg粗提濃縮物,c:大孔樹脂純化后的檢測譜圖.3結(jié)論通過koh一乙醇一水提取對sdg提取工藝的正交試驗,確定了在提取溶劑為0.1toolkoh溶于1l70%乙醇,固液比為1:8,提取5h的條件下,sdg提取的較為完全,粗提物產(chǎn)率達(dá)4.98%.測定表明,dm一21型大孔吸附樹

15、脂對sdg選擇性好,靜態(tài)飽和吸附量和解吸率較高.而且,提取過程中配合sdg薄層層析方法,可實現(xiàn)sdg的快速定性分析,適用于亞麻木脂素生產(chǎn)過程中的過程監(jiān)控.hplc檢測原亞麻籽餅粕含sdg為1.64%,經(jīng)大孔吸附樹脂分離及純化后獲得良好效果,使sdg質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到32.93%.koh乙醇一水提取與大孔吸附樹脂相結(jié)合制備sdg提取物的方法與傳統(tǒng)分離方法相比,得率高,工藝操作簡單且安全無毒.此方法可望提高工藝安全性和經(jīng)濟(jì)性,并為工業(yè)化分離純化sdg提供理論依據(jù).參考文獻(xiàn):【1】meagherl,beecherg.assessmentofdataontheligancontentoffoo0sj】.f

16、oodcompositionanal,2000,13:935-947.2】serrainom,thompsonlu.theeffectofflaxseedsupplementationonearlyriskmarkersformummarycarcinogenesis【j】.cancerlett,1991.60:135142.【3】thompsonlu,richardse,orchesonlj,eto1.flaxseedanditslignanandoilcomponentsreducemammarytumorgrowthatalatestageofcarcinogenesisj.carcinogenesis,1996,17:13731376.4】劉大川,龐美霞,吳波.亞麻籽木脂素一開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷提取工藝的研究【j1.中國油脂,2002,27(5):83-