RTqPCR技術(shù)的原理及應(yīng)用PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1RTqPCR技術(shù)的原理及應(yīng)用技術(shù)的原理及應(yīng)用PPT課件課件實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義定義第1頁/共18頁實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義定義 在在PCRPCR反應(yīng)體系中加入反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)，利用熒光，利用熒光信號(hào)累積信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)整個(gè)PCRPCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 第2頁/共18頁實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 應(yīng)用應(yīng)用 絕對定量(Absolute Quantification，AQ) 病原體檢測 轉(zhuǎn)基因食品檢測 基因表達(dá)研究相對定量(Relativ

2、e Quantification，RQ) 高通量基因檢測方法的驗(yàn)證 藥物療效考核 耐藥性研究第3頁/共18頁實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 應(yīng)用應(yīng)用 中國人終末期肝病組織中乙肝病毒轉(zhuǎn)錄體的檢測中國人終末期肝病組織中乙肝病毒轉(zhuǎn)錄體的檢測摘要目的摘要目的: 探討肝組織中HBV DNA 和病毒轉(zhuǎn)錄體與終末期肝病的關(guān)系. 方法方法: 用TRIzol 從肝組織中提取組織核酸,PCR 及RTPCR 擴(kuò)增HBV XDNA, XRNA, fRNA 和trRNA, 瓊脂糖凝膠電泳顯示產(chǎn)物, Southernblot 雜交驗(yàn)證PCR 擴(kuò)增的可靠性. 結(jié)果結(jié)果: 27 例HBsAg ( + ) 肝

3、組織, 19 例HBx DNA/ RNA 檢測均為陽性, 其中HBeAg ( + ) 者fRNA 檢出率較HBeAg( - ) 者高; 22 例HBsAg ( - ) 肝組織, 有16 例可檢測到HBx DNA 或RNA,HBsAg( - ) 的隱匿性感染在中國人終末期肝病中有較高的檢出率72. 7%; HBV 病毒轉(zhuǎn)錄體trRNA 在肝癌及肝硬化組織中的檢出率明顯高于其他肝臟疾病( P 0. 05) . 結(jié)論結(jié)論: HBV隱匿性感染與中國人終末期肝病的發(fā)生密切相關(guān), 肝組織中HBV trRNA 也與終末期肝病關(guān)系密切.第4頁/共18頁實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 應(yīng)用應(yīng)用

4、 第5頁/共18頁實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 應(yīng)用應(yīng)用 第6頁/共18頁實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 實(shí)時(shí)原理實(shí)時(shí)原理 常常 規(guī)規(guī) PCRPCR技術(shù)：技術(shù)： 對對PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析進(jìn)行定量和定性分析 無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCRPCR技術(shù)：技術(shù)： 利用利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增反應(yīng)中每每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過，通過CtCt值值和標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)

5、曲線的分析對的分析對起始模板起始模板進(jìn)行進(jìn)行定量分析定量分析第7頁/共18頁實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重現(xiàn)性橫軸：橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量縱軸：熒光信號(hào)量CtCt值的特點(diǎn)值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性第8頁/共18頁實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率第9頁/共18頁非特異性熒光標(biāo)記：非特異性熒

6、光標(biāo)記： 1、 SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記：特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 原理原理 - DNA - DNA 產(chǎn)物的熒光標(biāo)產(chǎn)物的熒光標(biāo)記記第10頁/共18頁實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR PCR 方法方法 1 -1 -SYBR Green 法SYBR Green 第11頁/共18頁SYBR Green 法 工作機(jī)理q SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位q SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光q 變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無熒光q 復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)

7、。SYBR Green 第12頁/共18頁5353SGNo EmissionSGSGSGExcitationExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitationExcitation第13頁/共18頁SYBR Green SYBR Green 法法 融解曲線分析融解曲線分析融解曲線分析，單一峰無非特異性熒光定量準(zhǔn)確融解曲線分析，出現(xiàn)雜峰其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確非特異性產(chǎn)非特異性產(chǎn)物物第14頁/共18頁SYBR Green 法 -PCR反應(yīng)的建立反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:1.SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱

8、，不易檢測2.Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)3.MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物4.反應(yīng)Buffer 體系的優(yōu)化5.反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定6.其他與常規(guī)PCR相同第15頁/共18頁SYBR Green SYBR Green 法法 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍q 起始模板的測定q 基因型的分析q 融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對primer的評價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。第16頁/共18頁實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR法法 標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)樣品相對定量中的內(nèi)標(biāo)相對定量中的內(nèi)標(biāo) 內(nèi)標(biāo)通常是內(nèi)標(biāo)通常是-actin、GAPDH、18S rRNA基因等看家基因基因等看家基因 在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影