實(shí)驗(yàn)3植物葉片活細(xì)胞和葉綠體的分離提取及觀察PPT優(yōu)秀課件

1、1實(shí)驗(yàn)四實(shí)驗(yàn)四 植物葉片活細(xì)胞和葉綠體的分植物葉片活細(xì)胞和葉綠體的分離提取及觀察離提取及觀察College of Life Science and Technology, XINJIANG Univercity2一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康膌初步掌握運(yùn)用機(jī)械法分離活細(xì)胞和細(xì)胞器初步掌握運(yùn)用機(jī)械法分離活細(xì)胞和細(xì)胞器的方法；的方法；l掌握運(yùn)用差速離心或密度梯度離心分離純掌握運(yùn)用差速離心或密度梯度離心分離純化葉肉細(xì)胞，細(xì)胞核，葉綠體的方法；化葉肉細(xì)胞，細(xì)胞核，葉綠體的方法；l掌握分離的細(xì)胞的活性鑒別方法；掌握分離的細(xì)胞的活性鑒別方法；l熟悉葉肉細(xì)胞或原生質(zhì)體、細(xì)胞核、葉綠熟悉葉肉細(xì)胞或原生質(zhì)體、細(xì)胞核、

2、葉綠體的形態(tài)大小。體的形態(tài)大小。3二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞器的分離是研究細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)、功能和化學(xué)細(xì)胞器的分離是研究細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)、功能和化學(xué)組成的技術(shù)基礎(chǔ)，保持分離的細(xì)胞器的純度、結(jié)組成的技術(shù)基礎(chǔ)，保持分離的細(xì)胞器的純度、結(jié)構(gòu)完整及其生理、生化活性是本實(shí)驗(yàn)的三大要素。構(gòu)完整及其生理、生化活性是本實(shí)驗(yàn)的三大要素。細(xì)胞核是植物細(xì)胞中最大、最重要的細(xì)胞器，使細(xì)胞核是植物細(xì)胞中最大、最重要的細(xì)胞器，使細(xì)胞各種生命活動(dòng)的指揮中心。細(xì)胞各種生命活動(dòng)的指揮中心。葉綠體是植物細(xì)葉綠體是植物細(xì)胞進(jìn)行光合作用，將光能轉(zhuǎn)變成化學(xué)能的重要細(xì)胞進(jìn)行光合作用，將光能轉(zhuǎn)變成化學(xué)能的重要細(xì)胞器。胞器。由于它們的重要功能，

3、所以它們一直是細(xì)由于它們的重要功能，所以它們一直是細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、和分子生物學(xué)研究的重要對胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、和分子生物學(xué)研究的重要對象。象。利用離心技術(shù)可分離、純化細(xì)胞、細(xì)胞核和利用離心技術(shù)可分離、純化細(xì)胞、細(xì)胞核和葉綠體。葉綠體。 4 將組織勻漿后懸浮在將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離中進(jìn)行差速離心，是分離各種細(xì)胞器的常用方法。顆粒在離心場中的沉降速率取決于各種細(xì)胞器的常用方法。顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也與離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度顆粒的大小、形狀和密度，也與離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。有關(guān)。在一給定的離心場中，一定時(shí)間內(nèi)，密度和大小

4、不同在一給定的離心場中，一定時(shí)間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同，依次增加離心力和離心時(shí)間，能使的顆粒其沉降速率不同，依次增加離心力和離心時(shí)間，能使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分，最先沉淀的是管底部，分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分，最先沉淀的是細(xì)胞，其次是細(xì)胞核，接下來是葉綠體。細(xì)胞，其次是細(xì)胞核，接下來是葉綠體。 懸浮介質(zhì)通常用懸浮介質(zhì)通常用緩沖的等滲溶液緩沖的等滲溶液，它，它與細(xì)胞質(zhì)的分散相與細(xì)胞質(zhì)的分散相接近接近，在一定程度上，在一定程度上能保持細(xì)胞器的真實(shí)結(jié)構(gòu)和酶的活性

5、能保持細(xì)胞器的真實(shí)結(jié)構(gòu)和酶的活性。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理567三、實(shí)驗(yàn)用具和試劑三、實(shí)驗(yàn)用具和試劑1 1儀器：儀器：組織搗碎機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、托盤天平、組織搗碎機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、托盤天平、 普通光學(xué)顯微鏡、剪刀、培養(yǎng)皿、普通光學(xué)顯微鏡、剪刀、培養(yǎng)皿、250ml250ml燒杯、量燒杯、量 筒、玻璃漏斗、移液管、離心管、滴管、濾紙、筒、玻璃漏斗、移液管、離心管、滴管、濾紙、 紗布一大塊或紗布一大塊或400400目尼龍網(wǎng)、載玻片、蓋玻片。目尼龍網(wǎng)、載玻片、蓋玻片。2 2試劑試劑： SNTSNT溶液溶液：0.4M0.4M蔗糖蔗糖、0.01M 0.01M NaClNaCl 0.05M 0.05M

6、Tris-HCLTris-HCL緩沖液緩沖液 ： 0.2M Tris0.2M Tris（三羥甲基氨基甲烷三羥甲基氨基甲烷） 50ml50ml 0.1N HCL 50-55ml 0.1N HCL 50-55ml 兩液混勻后，加蒸餾水至兩液混勻后，加蒸餾水至200ml200ml，pH7.6pH7.68 1/3000 1/3000中性紅染液中性紅染液: : 稱取稱取0.50.5中性紅溶于中性紅溶于50ml Ringer50ml Ringer溶液，溶液，稍加熱（稍加熱（30400C30400C）使之很快溶解，用濾紙過）使之很快溶解，用濾紙過濾，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，濾，裝入棕色瓶于暗處

7、保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。失去染色能力。 臨用前，取已配制的臨用前，取已配制的1%1%中性紅溶液中性紅溶液1ml1ml，加入加入29ml Ringer29ml Ringer溶液混勻，裝入棕色瓶備用。溶液混勻，裝入棕色瓶備用。 香柏油香柏油3 3材料：新鮮菠菜材料：新鮮菠菜三、實(shí)驗(yàn)用具和試劑三、實(shí)驗(yàn)用具和試劑9四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 1 1組織勻漿液的制備（組織搗碎法）。組織勻漿液的制備（組織搗碎法）。 2 2細(xì)胞及細(xì)胞器（細(xì)胞核、葉綠體等）的分細(xì)胞及細(xì)胞器（細(xì)胞核、葉綠體等）的分 離、純化（離心分離法）。離、純化（離心分離法）。 3 3細(xì)胞、細(xì)胞核、葉綠體的鏡檢（根據(jù)形態(tài)、細(xì)胞、細(xì)

8、胞核、葉綠體的鏡檢（根據(jù)形態(tài)、 大小、分布位置、數(shù)量識別法）。大小、分布位置、數(shù)量識別法）。 4 4分離細(xì)胞活性的鑒別（中性紅活體染色分離細(xì)胞活性的鑒別（中性紅活體染色 法）。法）。10五、實(shí)驗(yàn)方法和步驟五、實(shí)驗(yàn)方法和步驟1 1取材：取材：取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后，除取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后，除 葉梗及粗脈，剪成葉梗及粗脈，剪成0.5x0.5cm0.5x0.5cm小塊。小塊。2 2勻漿：勻漿：將稱取將稱取60g60g葉片小塊放入組織搗碎機(jī)葉片小塊放入組織搗碎機(jī)套套 筒內(nèi)，加入筒內(nèi)，加入200ml SNT200ml SNT溶液，勻漿溶液，勻漿2020秒秒( (最高最高 速度速度) )制成

9、勻漿液。制成勻漿液。3 3過濾：過濾：將勻漿液經(jīng)四層紗布過濾，或?qū)驖{液經(jīng)四層紗布過濾，或400400目目尼尼 龍網(wǎng)過濾，濾液分裝離心管，平衡。龍網(wǎng)過濾，濾液分裝離心管，平衡。11l4 4離心：離心： 濾液濾液l 200 200g g（1000rpm/1000rpm/分）分）1 1分分l _ _l 沉淀沉淀1 1 上清上清, ,平衡平衡, ,離心離心 （含葉肉細(xì)胞）（含葉肉細(xì)胞） 500500g g（1500rpm/1500rpm/分）分）1 1分分l 沉淀沉淀2 2（含細(xì)胞核）（含細(xì)胞核） 上清上清, ,平衡平衡, ,離心離心 1000 1000g g（3000rpm/3000rpm/分）分

10、）5 5分分 沉淀沉淀3 3 上清，棄上清，棄 （含大量葉綠體含大量葉綠體） 12 5 5懸?。簯腋。悍謩e收集沉淀，用少量的分別收集沉淀，用少量的SNTSNT溶液溶液 分別將沉淀分別將沉淀1 1、2 2、3 3懸浮。懸浮。 6 6鏡檢：鏡檢： 取懸浮液取懸浮液1 1、2 2分別做滴片鏡檢。分別做滴片鏡檢。 然后加幾滴中性紅染色然后加幾滴中性紅染色5-10min5-10min，蓋，蓋 上蓋玻片鏡檢。上蓋玻片鏡檢。 取懸浮液取懸浮液3 3做滴片蓋上蓋玻片，用油鏡做滴片蓋上蓋玻片，用油鏡 觀察。觀察。13六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1 1在普通光學(xué)顯微鏡下，在懸浮液在普通光學(xué)顯微鏡下，在懸浮液1 1滴

11、片中可以看到含細(xì)胞核滴片中可以看到含細(xì)胞核和大量葉綠體的葉肉細(xì)胞（形態(tài)為球形或橢圓形的原生質(zhì)和大量葉綠體的葉肉細(xì)胞（形態(tài)為球形或橢圓形的原生質(zhì)體）。體）。2 2在普通光學(xué)顯微鏡下，在懸浮液在普通光學(xué)顯微鏡下，在懸浮液2 2滴片中可以看到細(xì)胞核滴片中可以看到細(xì)胞核（形態(tài)為球形）。（形態(tài)為球形）。3 3在普通光學(xué)下，在懸浮液在普通光學(xué)下，在懸浮液1 1、2 2滴片中性紅染色可以鑒別活細(xì)滴片中性紅染色可以鑒別活細(xì)胞及細(xì)胞核（中性紅是液泡系特殊的活體染色劑，在細(xì)胞處胞及細(xì)胞核（中性紅是液泡系特殊的活體染色劑，在細(xì)胞處于生活狀態(tài)時(shí)，中性紅只將液泡染成紅色，而細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞于生活狀態(tài)時(shí)，中性紅只將液泡染成紅

12、色，而細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核不著色。如果細(xì)胞死亡，紅色會彌散在整個(gè)細(xì)胞中）。核不著色。如果細(xì)胞死亡，紅色會彌散在整個(gè)細(xì)胞中）。4 4在普通光學(xué)顯微鏡下，在懸浮液在普通光學(xué)顯微鏡下，在懸浮液3 3滴片中可以看到葉綠體滴片中可以看到葉綠體（葉綠體為綠色橢圓形，在高倍鏡下可以看到葉綠體內(nèi)部含（葉綠體為綠色橢圓形，在高倍鏡下可以看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒）。有較深的綠色小顆粒，即基粒）。14七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1 1細(xì)胞和各種細(xì)胞器的分離應(yīng)在等滲溶液中細(xì)胞和各種細(xì)胞器的分離應(yīng)在等滲溶液中進(jìn)行，以免滲透壓的改變使細(xì)胞和細(xì)胞器進(jìn)行，以免滲透壓的改變使細(xì)胞和細(xì)胞器的受到損傷。的受到損傷。

13、2 2要注意整個(gè)實(shí)驗(yàn)的分離過程必須在要注意整個(gè)實(shí)驗(yàn)的分離過程必須在0 055的條件下進(jìn)行，避免酶的失活；如果在室的條件下進(jìn)行，避免酶的失活；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。溫下，要迅速分離和觀察。3 3離心過程中要注意離心力和離心時(shí)間。離心過程中要注意離心力和離心時(shí)間。 得到結(jié)構(gòu)真實(shí)、完整并具生理、生化活性的細(xì)得到結(jié)構(gòu)真實(shí)、完整并具生理、生化活性的細(xì)胞器應(yīng)注意的問題？胞器應(yīng)注意的問題？15八、實(shí)驗(yàn)作業(yè)八、實(shí)驗(yàn)作業(yè)1.1.繪制出一個(gè)完整的葉肉細(xì)胞圖（內(nèi)含細(xì)胞核、葉綠體）。繪制出一個(gè)完整的葉肉細(xì)胞圖（內(nèi)含細(xì)胞核、葉綠體）。2.2.得到結(jié)構(gòu)真實(shí)、完整并具生理、生化活性的細(xì)胞器應(yīng)注得到結(jié)構(gòu)真實(shí)、完整并具生理、生化活性的細(xì)胞器應(yīng)注意哪些問題？談?wù)勔饽男﹩栴}？談?wù)凷NTSNT溶液中的各種成分的作用。溶液中的各種成分的作用。3.3.分離各種細(xì)胞器所需的相對離心力與哪些因素有關(guān)？分離各種細(xì)