家兔尿生成的因素及腎缺血再灌注損傷初探

1、家兔尿生成的因素及腎缺血再灌注損傷初探 (南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院10級(jí)臨床醫(yī)學(xué))摘要： 目的：強(qiáng)化頸動(dòng)、靜脈，輸尿管插管技術(shù)和家兔腎缺血再灌注損傷模型的復(fù)制方法，加深理解尿生成的機(jī)理及腎排泄功能的重要意義，熟悉缺血再灌注損傷的機(jī)制及其基本實(shí)驗(yàn)方法。 方法：21組家兔麻醉后分別行頸靜、動(dòng)脈插管術(shù)和輸尿管插管術(shù)，在靜脈補(bǔ)充37的生理鹽水15min后、補(bǔ)充20%的高滲葡萄糖15min后、夾閉左腎動(dòng)脈15min并再灌注15min后，生理鹽水、生理鹽水+速尿、生理鹽水+高滲葡萄糖按組別分別搶救15min后，分別觀測(cè)平均動(dòng)脈壓，尿量。并測(cè)定再灌注及治療后尿肌酐、血肌酐濃度及內(nèi)生肌酐清除率（ccr）；結(jié)果

2、：補(bǔ)充生理鹽水和高滲葡萄糖后血壓，尿生成量均增加，夾閉左腎動(dòng)脈并再灌后各值均降低，生理鹽水治療可使血壓回升，尿生成量和ccr略回升，生理鹽水+速尿治療可使各項(xiàng)參數(shù)均回升，生理鹽水+高滲葡萄糖治療各項(xiàng)參數(shù)均回升但不顯著。結(jié)論：增加血容量和升高血漿滲透壓均可使血壓、尿生成量增加，缺血再灌注后血壓下降、腎排泄能力降低、內(nèi)生肌酐清除率降低，速尿治療后可糾正此變化，生理鹽水和高滲葡萄糖僅能糾正血壓及部分糾正恢復(fù)腎功能。關(guān)鍵詞：腎 尿生成 內(nèi)生肌酐清除率 缺血再灌注腎臟是機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使新陳代謝得以正常進(jìn)行的重要器官。腎功能探究實(shí)驗(yàn)一直是各大高校培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生過程中的重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)。其意義在于使醫(yī)學(xué)生通過實(shí)際操

3、作，了解各種因素下腎功能的改變及其機(jī)制。腎缺血再灌注損傷是指腎組織缺血時(shí)和其后恢復(fù)血液灌注時(shí)器官功能不能恢復(fù)正常，甚至發(fā)生更為嚴(yán)重的組織損傷或器官功能衰竭。腎臟由于其組織結(jié)構(gòu)和功能的特殊性，是對(duì)缺血再灌注損傷敏感的器官之一。腎缺血再灌注損傷是急性腎功能衰竭的主要原因之一，也是移植排斥反應(yīng)，尤其是慢性排斥反應(yīng)的重要原因1，探究它的機(jī)制對(duì)醫(yī)學(xué)生有重要意義。而對(duì)內(nèi)生肌酐清除率（ccr）的測(cè)定可了解腎小球的功能，因此，本實(shí)驗(yàn)通過給家兔生理鹽水、高滲葡萄糖、制造腎缺血再灌注模型并予以三種不同的搶救等，并對(duì)各情況下家兔腎功能情況進(jìn)行測(cè)定，以培養(yǎng)醫(yī)學(xué)生動(dòng)手能力及對(duì)腎功能、缺血再灌注機(jī)制和意義的理解。1 材料

4、與方法1.1材料：1.1.1主要試劑與儀器：20%烏拉坦，0.2%肝素，生理鹽水，20%葡萄糖溶液，蒸餾水，速尿劑，肌酐測(cè)定試劑（含試劑一、試劑三、試劑四）。醫(yī)用計(jì)算機(jī)記錄系統(tǒng)（pclab）及計(jì)算機(jī)，家兔手術(shù)臺(tái)，哺乳動(dòng)物手術(shù)器械，動(dòng)脈、靜脈及輸尿管插管，動(dòng)脈夾，壓力換能器，三通管，注射器，兔繩，紗布，剪刀，分光光度計(jì)，恒溫水浴箱，試管，微量加樣槍帶槍頭，稱重稱。1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物: 家兔，體重約2.2kg，由南方醫(yī)科大學(xué)提供。1.2 方法：（進(jìn)行21組實(shí)驗(yàn)，每組均按下述方法進(jìn)行）1.2.1 前期準(zhǔn)備家兔稱重2.2kg，用20%烏拉坦11ml(5ml/kg)耳緣靜脈麻醉，麻醉后將家兔仰臥位固定

5、于手術(shù)臺(tái)。家兔頸部、左腎區(qū)、恥骨聯(lián)合上部分別備皮。沿甲狀軟骨下正中依次剪開皮膚、淺筋膜，鈍性分離右側(cè)頸外靜脈并插管。沿胸鎖乳頭肌和胸骨舌骨肌間隙鈍性分離，并在氣管正中鈍性分離頸闊肌，游離左頸動(dòng)脈并插入肝素充盈的動(dòng)脈插管，連接壓力換能器以記錄平均動(dòng)脈壓abp。家兔恥骨下聯(lián)合上約三橫指處沿前正中線（腹白線）剪開皮膚、淺筋膜，于膀胱左側(cè)輸尿管并進(jìn)行輸尿管插管并用有刻度的試管收集尿液。1.2.2 研究尿生成過程影響因素靜脈推注37，30ml生理鹽水，用有刻度的試管收集尿液并計(jì)算注射后每分鐘尿量（ml/分鐘）；一段時(shí)間后靜脈輸入37，10ml 20%葡萄糖溶液，用有刻度的試管收集尿液并計(jì)算注射后每分鐘尿

6、量。收集的尿液待測(cè)尿肌酐含量。1.2.3 腎缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)于左腎區(qū)切開皮膚、淺筋膜，找出左腎并游離左腎動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉，夾閉15min后觀測(cè)平均動(dòng)脈壓和尿量變化。松開動(dòng)脈夾，再灌注，再次觀測(cè)平均動(dòng)脈壓和尿量變化。15min后，17組采取搶救方案一（于頸靜脈插管輸入37、20ml 生理鹽水），814組采取搶救方案二（于頸靜脈插管輸入37、19ml 生理鹽水及速尿1ml），1421組采取搶救方案三（于頸靜脈插管輸入37、10ml 生理鹽水及20%葡萄糖溶液10ml）分別進(jìn)行搶救，搶救15min后取尿測(cè)定尿肌酐濃度，記錄平均動(dòng)脈壓和尿量變化并收集尿液待測(cè)尿肌酐含量。1.2.4尿肌酐測(cè)定方法取

7、尿液10l與2ml蒸餾水按1：200比例稀釋，按下表分別加入樣品及不同試劑于各管，37 10min水浴，以蒸餾水調(diào)零， 測(cè)510 nm處分光光度值并按以下公式計(jì)算尿肌酐。尿肌酐(mmol/l) = （測(cè)定管od - 空白管od）/ （標(biāo)準(zhǔn)管od 空白管od ）x標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10umol/l） x 201倍表1 尿肌酐測(cè)定加樣量表試管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管調(diào)零管空白管稀釋后尿液（ml）01.600試劑一(cr標(biāo)準(zhǔn)品)（ml）1.6000蒸餾水（ml）002.61.6試劑三（ml）0.50.500.5試劑四（ml）0.50.500.5內(nèi)生肌酐清除率ccr =尿肌酐濃度/血肌酐濃度x 尿量(ml/min)2

8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1標(biāo)準(zhǔn)管及空白管od值見下表：表2 標(biāo)準(zhǔn)管及空白管od值標(biāo)準(zhǔn)管od空白管od10.0750.01220.0690.008平均值0.0720.012.2 各治療方案實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下（以各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中有效數(shù)據(jù)記錄，其中尿肌酐、血肌酐及內(nèi)生肌酐清除率為計(jì)算值）：正常狀態(tài)下，家兔平均動(dòng)脈壓7585mmhg，尿量34.5ml，血肌酐156.1163.2umol/l，尿肌酐62249369umol/l，ccr 11.617ml/min。輸入生理鹽水后各項(xiàng)指標(biāo)均上升但不明顯，輸入葡萄糖后尿量增加，但平均動(dòng)脈壓變化不明顯，再灌注后除血肌酐升高外，各指標(biāo)均明顯降低。方案一治療家兔后平均動(dòng)脈壓91mmhg

9、，尿量7.6ml，尿肌酐1458.9 umol/l，血肌酐161.5 umol/l，ccr 4.6，方案二治療后家兔平均動(dòng)脈壓83.4mmhg，尿量22.5ml，尿肌酐1231.9umol/l，血肌酐177.4umol/l，ccr 13.4，方案三治療后家兔平均動(dòng)脈壓72.7mmhg，尿量13.5ml，尿肌酐2042.4umol/l，血肌酐143.7umol/l，ccr 12.8（各時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)變化規(guī)律詳見討論部分）。表3 治療方案一各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸尿管插管后輸生理鹽水后輸入20%葡萄糖后再灌注15min后搶救方案一15min后平均動(dòng)脈壓（mmhg）76.776708191尿量（ml）4.556.

10、81.27.6尿肌酐（od值）0.2020.0510.055血肌酐（od值）0.0980.1090.101尿肌酐（umol/l）6224.51329.21458.9血肌酐（umol/l）156.1175.6161.5內(nèi)生肌酐清除率(ml/min)12.0064.6表4 治療方案二各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸尿管插管后輸生理鹽水后輸入20%葡萄糖后再灌注15min后搶救方案二15min后平均動(dòng)脈壓（mmhg）84.1689.395.180.883.4尿量（ml）33.45.21.322.5尿肌酐（od值）0.2990.0640.048血肌酐（od值）0.1010.1120.11尿肌酐（umol/l）9369.2

11、1750.61231.9血肌酐（umol/l）161.5181.0177.4內(nèi)生肌酐清除率(ml/min)11.60.913.4表5 治療方案三各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸尿管插管后輸生理鹽水后輸入20%葡萄糖后再灌注15min后搶救方案三15min后平均動(dòng)脈壓（mmhg）82.4100.288.673.772.7尿量（ml）4.55.68.81.513.5尿肌酐（od值）0.2950.0710.073血肌酐（od值）0.1020.1120.091尿肌酐（umol/l）9239.51977.62042.4血肌酐（umol/l）163.21810143.7內(nèi)生肌酐清除率(ml/min)17.01.112.83

12、討論：3.1尿生成的影響因素尿生成的過程包括腎小球?yàn)V過、腎小管和集合管的重吸收和分泌，機(jī)體對(duì)尿生成的調(diào)節(jié)就是通過這三個(gè)基本過程而實(shí)現(xiàn)的，具體為腎內(nèi)自身調(diào)節(jié)以及神經(jīng)和體液的調(diào)節(jié)1。腎小球?yàn)V過作用主要決定于有效濾過壓。 而有效濾過壓=（腎小球毛細(xì)血管靜水壓+囊內(nèi)液膠體滲透壓）（血漿膠體滲透壓+腎小囊內(nèi)壓）。毛細(xì)血管血壓主要決定于腎血流量及毛細(xì)血管橫截面積，腎血流量多而毛細(xì)血管橫截面積小時(shí)，毛細(xì)血管靜水壓高，故當(dāng)機(jī)體缺血時(shí)，腎血流量減少，毛細(xì)血管血壓下降，尿生成減少。膠體滲透壓主要決定于液體內(nèi)物質(zhì)，當(dāng)液體內(nèi)糖、蛋白質(zhì)及離子等物質(zhì)增多時(shí)，液體膠體滲透壓增高，故當(dāng)腎小球血管壁受損時(shí)，血液內(nèi)物質(zhì)進(jìn)入腎小球

13、，是膠體滲透壓差值降低，尿生成增加（但此時(shí)通常腎血流量會(huì)減少而導(dǎo)致尿生成減少）。腎囊內(nèi)壓通常較穩(wěn)定，對(duì)尿的生成影響小，僅在腎結(jié)石，腫瘤等疾病時(shí)機(jī)體會(huì)因囊內(nèi)壓升高而少尿。腎小管和集合管通過重吸收作用回收尿內(nèi)的小分子物質(zhì)如糖、一些離子物質(zhì)，而99%的水也會(huì)被重吸收，故原尿僅有1%會(huì)成為尿液。當(dāng)腎實(shí)質(zhì)受損時(shí)，腎小管重吸收功能減弱，尿量增加（但腎實(shí)質(zhì)受損時(shí)通常毛細(xì)血管靜水壓會(huì)下降而導(dǎo)致尿生成減少）。腎小管和集合管的分泌功能主要通過分泌一些小分子物質(zhì)進(jìn)入尿液而改變尿液膠體滲透壓而改變尿量。但由于其分泌量較少，對(duì)尿生成影響不大。機(jī)體對(duì)尿生成的調(diào)節(jié)主要依靠腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，該系統(tǒng)抑制時(shí)，尿量增加

14、。3.2尿肌酐及內(nèi)生肌酐清除率（ccr）圖1 腎小球?yàn)V過率的影響因素尿肌酐全部由腎小球?yàn)V過，不被腎小管重吸收，很少被腎小管排泌，而內(nèi)生肌酐清除率（ccr）指腎單位時(shí)間內(nèi)把若干毫升血液內(nèi)的肌酐全部排泄出去，是腎小球功能的極敏感指標(biāo)，當(dāng)腎小球功能受損時(shí)，ccr降低2。3.3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析圖3 各治療方案下ccr變化折線圖圖2各治療方案下尿量變化折線圖3.3.1 各情況下各指標(biāo)變化分析靜脈快速注射30ml生理鹽水后，家兔尿量及平均動(dòng)脈壓上升但不顯著（尿量上升不大于1ml，平均動(dòng)脈壓升高不大于10mmhg），其主要原因?yàn)椋红o脈注射ns后血漿膠體滲透壓降低但不顯著，腎小球?yàn)V過率增加不明顯，故尿量輕微增加。

15、ns注入后血容量上升（2.2kg家兔血容量約130ml），腎動(dòng)脈血壓上升，使腎小球?yàn)V過率增加，且血管壁受刺激使腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)興奮，機(jī)體保水功能抑制，尿量增加。靜脈注射20%葡萄糖后，家兔尿量顯著增加（均大于1.5ml），但平均動(dòng)脈壓變化趨勢(shì)不明顯。其主要原因?yàn)椋焊邼B葡萄糖的升膠體滲透壓作用較生理鹽水強(qiáng)，故尿量升高也更明顯。由于高滲葡萄糖在已經(jīng)注入30ml生理鹽水后注入，故家兔血容量增加更明顯，尿量也更顯著地增加。此時(shí)，實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行已久（超過1.5h），家兔由于各種手術(shù)而導(dǎo)致失血過多，且應(yīng)激狀態(tài)逐漸減弱，腎上腺素等釋放減少，是機(jī)體血壓下降，這種作用拮抗了高滲葡萄糖的升壓作用。但由于

16、各家兔生理狀況不同，故各組平均動(dòng)脈壓變化趨勢(shì)不明顯。夾閉左腎動(dòng)脈后，機(jī)體進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)，再灌注后，由于腎功能嚴(yán)重受損，機(jī)體進(jìn)入急性腎功能衰竭少尿期而嚴(yán)重少尿，可比正常值少0.2ml以上。尿肌酐、ccr急劇下降，反映腎小球壞死嚴(yán)重。目前，急性缺血再灌注腎損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，現(xiàn)有的研究資料表明它與atp 的減少、大量氧自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡基因的調(diào)控等介導(dǎo)的腎小管、腎小球細(xì)胞損傷具有密切關(guān)系1。在家兔接受第一種治療方案（20ml生理鹽水）后，家兔尿量上升，平均動(dòng)脈壓升高不明顯。平均動(dòng)脈壓變化趨勢(shì)分析同前（實(shí)驗(yàn)過久導(dǎo)致缺血而無法升高），尿肌酐、ccr回升但不明顯，可能因?yàn)樯睇}水

17、僅有增加血容量作用，對(duì)家兔解救效果不明顯。在家兔接受第二種治療方案（19ml生理鹽水+1ml速尿）后，家兔各項(xiàng)指標(biāo)回升明顯，其原因是呋塞米（速尿）能增加水、鈉、氯、鉀、鈣、鎂、磷等的排泄。呋塞米能抑制前列腺素分解酶的活性，使前列腺素e2 含量升高，從而具有擴(kuò)張血管作用。擴(kuò)張腎血管，降低腎血管阻力，使腎血流量尤其是腎皮質(zhì)深部血流量增加，從而預(yù)防急性腎功能衰竭。呋塞米等袢利尿藥存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。隨著劑量加大，利尿效果明顯增強(qiáng)，且藥物劑量范圍較大。在家兔接受第三種治療方案（10ml生理鹽水+10ml20%葡萄糖）后，家兔各項(xiàng)指標(biāo)回升比單純生理鹽水明顯，其原因可能為高滲葡萄糖使組織液更多地進(jìn)入血

18、液，從而使血容量增加更多，利尿作用更強(qiáng)而使治療作用更好。3.3.2 各治療方案數(shù)據(jù)對(duì)比分析如圖2，再灌注前，各尿量變化曲線均平坦，而治療后尿量明顯增加，以方案二增加最為顯著可見治療方案二的利尿作用最強(qiáng)?？赡芤?yàn)槟I缺血再灌后，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，各種生理功能亢進(jìn)，在藥物注入后機(jī)體新陳代謝加快，尿量增加。而速尿（呋塞米）具有極佳的利尿作用，且兼有擴(kuò)血管，擴(kuò)血容量作用，故治療效果最好。如圖3，盡管治療后二、三治療方案ccr相差不大，但二方案的家兔正常ccr較高，故仍然可以看出治療方案二的治療效果最佳，其次為方案三，方案一治療效果不佳，甚至治療無效（ccr較該家兔正常值低，但可能由于實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過長(zhǎng)（此時(shí)已

19、達(dá)3h），腎功能已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不可逆衰竭而治療無效）。3.4 實(shí)驗(yàn)中遇到的問題（1）實(shí)驗(yàn)過程家兔易死亡，分析原因有一下幾點(diǎn)：插管操作不熟悉導(dǎo)致家兔失血過多，而本此實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，家兔失血死亡；本次實(shí)驗(yàn)需有三個(gè)創(chuàng)口，需暴露頸部、胸腔和腹腔?？赡苡捎诓僮鞑划?dāng)使家兔器官衰竭而亡；腎是機(jī)體主要的排泄器官之一，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞外液容量和血流的滲透壓，排除體內(nèi)過剩的電解質(zhì)離子，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保證機(jī)體各種生命活動(dòng)的進(jìn)行，而且腎臟是一個(gè)高血流的器官，易發(fā)生缺血再灌注損傷，當(dāng)我們?cè)谌毖募彝迷龠M(jìn)行缺血灌注，導(dǎo)致死亡。（2）正確的插管技術(shù)是實(shí)驗(yàn)成果的先決條件。本組實(shí)驗(yàn)遇到的最大困難即輸尿管插管后無尿液，經(jīng)過分析，

20、可能有以下幾個(gè)原因：教室氣溫低、動(dòng)物麻醉和長(zhǎng)時(shí)手術(shù)創(chuàng)傷等應(yīng)急性刺激均可提高交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性,使腎血管收縮,導(dǎo)致腎血流量和腎小球血漿流量顯著減少,腎小球?yàn)V過率也因此而減少；交感神經(jīng)興奮也可調(diào)動(dòng)腎素一血管緊張素一醛固酮系統(tǒng),醛固酮通過保鈉保水作用而致尿量減少；長(zhǎng)時(shí)間手術(shù)如出血較多可致循環(huán)血量減少，反射性地引起抗利尿激素釋放增多，尿量減少；插管不成功，可能是未成功分離輸尿管、輸尿管插管過高或誤將輸尿管扎破等原因引起。實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)組的家兔盆腔有無色透明的液體溢出，猜測(cè)是由于輸尿管插管時(shí)用力過大，而使輸尿管破損，尿液從破損處流出，因而收集不到尿液。本實(shí)驗(yàn)小組經(jīng)過分析后，選取右腎輸尿管重新插管，成功收集到尿液。（3）在測(cè)量動(dòng)脈血壓時(shí)，本實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)計(jì)算機(jī)導(dǎo)出的數(shù)據(jù)為0