PCR、RTPCR常見問題及分析

1、PCR、RTPCR常見問題及常見問題及分析分析PCRPCR、RTPCRRTPCR常見問題及分析常見問題及分析PCR技術(shù)的發(fā)明技術(shù)的發(fā)明p1983 Kary Mullis 發(fā)明發(fā)明p1985 開始有文章發(fā)表開始有文章發(fā)表p1993 獲諾貝爾獎獲諾貝爾獎p廣泛用于分子生物學(xué)研究廣泛用于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域領(lǐng)域ppcr動畫.exePCRPCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理q 模板模板DNA的變性：的變性：93-95左右，左右，q 模板模板DNA與引物的退火與引物的退火(復(fù)性復(fù)性)：Ta=Tm-35 q 引物的延伸：引物的延伸：Taq DNA聚合酶之聚合酶之5-3DNA聚合酶活性聚合酶活性變性變性-退火退

2、火-延伸三個步驟延伸三個步驟 1234522557294時間（min）溫度（）PCRPCR的基本原理的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCRPCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系pDNA模板p引物p反應(yīng)緩沖液pMg 2pdNTP p耐熱聚合酶pddH2O反應(yīng)體系對反應(yīng)體系對PCR擴增的影響擴增的影響pDNADNA模板模板純度純度 蛋白、多糖、酚類等抑制PCR反應(yīng)完整性完整性 模板降解會導(dǎo)致PCR擴增無產(chǎn)物濃度濃度 濃度適當(dāng)p 引物引物 設(shè)計設(shè)計 長度適當(dāng)、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚

3、體 合成質(zhì)量合成質(zhì)量 濃度濃度 50uL體系引物加量為10-20 pmol反應(yīng)體系對反應(yīng)體系對PCR擴增的影響擴增的影響p反應(yīng)pH、鹽離子、穩(wěn)定劑、增強劑提供緩沖環(huán)境pMg 2濃度過高非特異性嚴(yán)重過低無擴增產(chǎn)物濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融pddH2OpH值適當(dāng)，避免污染p反應(yīng)pH、鹽離子、穩(wěn)定劑、增強劑提供緩沖環(huán)境pMg 2濃度過高非特異性嚴(yán)重過低無擴增產(chǎn)物濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融pddH2OpH值適當(dāng)，避免污染p反應(yīng)pH、鹽離子、穩(wěn)定劑、增強劑提供緩沖環(huán)境pMg 2濃度過高非特異性嚴(yán)重過低無擴增產(chǎn)物濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融pddH2OpH值適當(dāng)，避免污染如何選擇最合適的如何選擇最合適的DNADNA聚合

4、酶聚合酶pPCR用耐熱用耐熱DNA聚合酶聚合酶（ PCR 實驗的不同需求）實驗的不同需求）1 Taq酶酶2 pfu酶酶3 Hotstart Taq酶酶Taq plusLong TaqTaq platinum4 混合酶混合酶1 Taq酶酶擴增效率最高擴增效率最高p發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)1969年，美國黃石國家公園溫泉年，美國黃石國家公園溫泉p活性活性5-3 DNA聚合酶活性聚合酶活性 強強5-3 DNA外切酶活性外切酶活性 弱弱 熒光探針（定量熒光探針（定量PCR方法）方法）3-5 DNA外切酶活性外切酶活性 無無 錯配率每個循環(huán)約錯配率每個循環(huán)約1/6000 3末端加末端加“A” 能能 產(chǎn)物可直接進行產(chǎn)物可

5、直接進行“TA”克隆克隆p生產(chǎn)質(zhì)檢生產(chǎn)質(zhì)檢誘導(dǎo)大腸桿菌表達、三次柱純化，分離獲得誘導(dǎo)大腸桿菌表達、三次柱純化，分離獲得94kD重組蛋白。重組蛋白。無核酸酶和無核酸酶和 細菌細菌DNA污染污染能有效擴增人基因組單拷貝基因能有效擴增人基因組單拷貝基因室溫放置一周，無明顯活性改變。室溫放置一周，無明顯活性改變。2 pfu酶酶保真度高保真度高 p 原理原理具具35核酸外切酶活性，即校正功能。核酸外切酶活性，即校正功能。效率相對較低效率相對較低3末端不加末端不加“A”，加，加A后才可進行后才可進行TA克隆。克隆。p 用途用途表達基因的克隆表達基因的克隆基因的定點突變基因的定點突變細胞內(nèi)基因點突變分析（細

6、胞內(nèi)基因點突變分析（SNP）3 HotStart Taq酶酶特異性高特異性高熱啟動熱啟動Taq酶酶p原原 理理蠟封蠟封抗體抑制抗體抑制化學(xué)修飾化學(xué)修飾p提高提高PCR特異性，減少甚至避免非特異性，減少甚至避免非特異性擴增特異性擴增p3加加“A”，可直接做，可直接做“TA”克隆克隆p用用 途途混雜模板混雜模板半定量、定量半定量、定量PCR4 混合酶混合酶高擴增效率高保真度高擴增效率高保真度pTaq plusTaq+pfu用于復(fù)雜模板用于復(fù)雜模板（GC rich, 二級結(jié)構(gòu)）二級結(jié)構(gòu)）擴增擴增大多數(shù)情況下可替代大多數(shù)情況下可替代Taq, 特別是產(chǎn)物在特別是產(chǎn)物在6Kb以上時，以上時，可擴可擴10-

7、20kb。pLong TaqTaq+pfu超長片斷擴增，超長片斷擴增，15-40kb.pTaq platinumHotStart+pfu高擴增效率高保真度高擴增效率高保真度根據(jù)根據(jù)PCR實驗的不同需求實驗的不同需求p基因組擴增、RT-PCR 特特 異異 性性p基因突變、測序、 表達克隆 保保 真真 性性p構(gòu)建基因圖譜、測序等 長片段擴增長片段擴增p復(fù)雜模板擴增 (GC含量高、二級結(jié)構(gòu)) 擴增效率擴增效率預(yù)配的預(yù)配的PCRPCR反應(yīng)液反應(yīng)液 DNA聚合酶 反應(yīng)緩沖液 dNTP PCR增強劑 PCR MasterMixPCR MasterMix特特 點點 快速簡便 減少加樣誤差和污染 靈敏度高 可

8、擴增低至2個拷貝的目的模板 特異性強 降低PCR反應(yīng)的要求，增強特異性 穩(wěn)定性好 -20一年以上，反復(fù)凍融不影響活性。適用范圍適用范圍 大規(guī)模基因檢測 目的基因拷貝數(shù)極低的樣本 GC含量高,有二級結(jié)構(gòu)的模板 復(fù)雜基因組樣本PCR Master Mix PCR Master Mix 產(chǎn)品特點產(chǎn)品特點升博生物升博生物 專業(yè)服務(wù)專業(yè)服務(wù)PCR常見問題分析常見問題分析PCRPCR常見問題常見問題p無擴增產(chǎn)物p非特異性擴增或拖尾p假陽性問題問題1 1：無：無擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無M樣品樣品A 樣品樣品B 正對照正對照純度：含有抑制物純度：含有抑制物濃度：含量低濃度：含量低質(zhì)量：全

9、長質(zhì)量：全長結(jié)構(gòu)：二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)：二級結(jié)構(gòu) 原原因因?qū)Σ卟呒兓０寤蛘呤褂脙?yōu)質(zhì)純化模板或者使用優(yōu)質(zhì)試劑盒提取模板試劑盒提取模板DNADNA加大模板的用量加大模板的用量用好的反轉(zhuǎn)錄酶用好的反轉(zhuǎn)錄酶用溫度高的反轉(zhuǎn)錄酶用溫度高的反轉(zhuǎn)錄酶無無擴增產(chǎn)物之模板原因擴增產(chǎn)物之模板原因引物錯誤引物錯誤引物設(shè)計不好引物設(shè)計不好引物降解引物降解引物合成、純化不好引物合成、純化不好 原原因因?qū)Σ卟吆铣汕皺z查合成前檢查評價、重新設(shè)計引物評價、重新設(shè)計引物換一管新引物換一管新引物免費重新合成免費重新合成無無擴增產(chǎn)物之引物原因擴增產(chǎn)物之引物原因退火溫度退火溫度延伸時間延伸時間循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 原原因因?qū)Σ卟哌f度遞度P

10、CRPCR聚合酶的延伸速度聚合酶的延伸速度適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)無無擴增產(chǎn)物之?dāng)U增產(chǎn)物之PCRPCR條件原因條件原因 現(xiàn)象：條帶與預(yù)計的大小不一致或者非特異性擴增帶問題問題2 2：非特異性擴增：非特異性擴增 M 1 2引物特異性差引物特異性差模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高酶量過多酶量過多MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高退火溫度偏低退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原原因因?qū)Σ卟咧匦略O(shè)計引物或者使用巢重新設(shè)計引物或者使用巢式式PCRPCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用適當(dāng)提高退火溫度或使用二

11、階段溫度法二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 非特異性擴增非特異性擴增靶序列或擴增產(chǎn)物靶序列或擴增產(chǎn)物 的交叉污染的交叉污染 原原因因開管輕柔，防止形成氣溶膠開管輕柔，防止形成氣溶膠；防止靶序列吸入加樣槍內(nèi)；防止靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外或濺出離心管外更換試劑、耗材更換試劑、耗材試劑分裝，貯存適當(dāng)。試劑分裝，貯存適當(dāng)。更換實驗室和所有試劑耗材更換實驗室和所有試劑耗材。問題問題3 3：假陽性：假陽性現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物對策對策升博生物升博生物 專業(yè)服務(wù)專業(yè)服務(wù)提高提高PCR特異性特異性的策略的策略 q 巢式巢式PCRPCR（Nest-PCRNest-PC

12、R）q 遞減遞減PCRPCR（TouchDown PCRTouchDown PCR）q 熱啟動熱啟動PCRPCR（HotStart PCRHotStart PCR）q 使用使用PCRPCR增強劑增強劑策略之一策略之一 巢式巢式PCRPCR（Nest-PCRNest-PCR）P1P2P3P4增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度降低了擴增多個靶位點的可能性提高困難PCR（如5 RACE）特異性 前幾個循環(huán)使用嚴(yán)謹?shù)耐嘶饤l件提高特異性。 循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1-2,直到退火溫度低于Tm 5。 特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)

13、擴增占據(jù)優(yōu)勢。 遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。策略之二策略之二 遞減遞減PCRPCR（TouchDown PCRTouchDown PCR） p熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR 儀達到變性溫度p通常選擇熱啟動Taq酶p熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一策略之三策略之三 熱啟動熱啟動PCRPCRq甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等q可能的機理：降低熔解溫度，有助于引物退火，輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)q增強劑濃度要適當(dāng) 策略之四策略之四 使用使用PCRPCR增強劑增強劑

14、升博生物升博生物 專業(yè)服務(wù)專業(yè)服務(wù)RT-PCR簡介簡介 主要內(nèi)容主要內(nèi)容pRT-PCR原理pRT-PCR步驟p常見問題分析兩步法兩步法RT-PCRmRNA53AAAAAAAAPoly(A)*尾T T T TOligo(dT)Super RnaseH-Reverse TranscriptaseT T T TAAAAAAAAmRNAcDNAT T T TcDNA3553PCR擴增Super RnaseH-Reverse Transcriptase35T T T TcDNAT T T TcDNAPCR擴增53mRNAAAAAAAAAPoly(A)*尾3535一步法一步法RT-PCR兩步法與一步法兩步

15、法與一步法RT-PCRRT-PCR比較比較兩步法一步法引物Oligo dT，隨機引物，GSPGSP優(yōu)點PCR擴增失敗時便于分析原因特異性和靈敏度高適用p檢測多種目的基因p半定量RT-PCRp大量樣品分析p定性p 分析基因的轉(zhuǎn)錄水平p 獲取目的基因p 合成cDNA探針RT-PCRRT-PCR主要用途主要用途逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇pAMVAMV：禽成髓細胞瘤病毒，逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶H活性。最適42，最新版本可達60 （Bioflux公司）。pMMLVMMLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶H活性較弱。最適37，最新版本42 （賽百盛）pSuper RNaseHSuper R

16、NaseH- - Reverse Transcriptase Reverse TranscriptaseMMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體，它能將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，最適42。（Tiangen天根生化）RNase HRNase H的作用的作用p水解水解RNA-DNA雜合鏈中的雜合鏈中的RNASuper RNaseH- Reverse TranscriptaseMMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體逆轉(zhuǎn)錄效率高RT-PCR引物的選擇引物的選擇p隨機引物隨機引物：適用于長的或具有發(fā)卡 結(jié)構(gòu)的RNA,特異性最低。起始濃度范圍為20l體系50-250g。p Oligo(dT15-1

17、8)：適用于具有PolyA尾巴的RNA。起始濃度范圍為20l體系。p特異性引物：特異性引物：與目的序列互補，是反義寡核苷酸，適用于目的序列已知的情況。起始濃度范圍為20l體系1pmol。提高提高RT-PCRRT-PCR靈敏度靈敏度p分離高質(zhì)量分離高質(zhì)量RNA p使用無使用無RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶提高提高RT-PCRRT-PCR特異性特異性p提高逆轉(zhuǎn)錄酶保溫溫度提高逆轉(zhuǎn)錄酶保溫溫度 p減少基因組減少基因組DNA污染污染升博生物升博生物 專業(yè)服務(wù)專業(yè)服務(wù)RT常見問題常見問題 RNARNA降解或起始量少降解或起始量少RNARNA含抑制成分含抑制成分cDNA 5cDNA 5端不全端不

18、全目的基因在組織中不目的基因在組織中不 表達或表達量太低表達或表達量太低 原因原因?qū)Σ卟叻蛛x高質(zhì)量的分離高質(zhì)量的RNARNA使用高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如使用高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如RT007RT007（BioFluxBioFlux）使用隨機引物或使用隨機引物或GSPGSP嘗試其它組織嘗試其它組織問題問題1 1：RT-PCRRT-PCR沒有產(chǎn)物沒有產(chǎn)物PCRRT-PCR六種六種TaqTaq和和MasterMixMasterMix：T a qT a q 、 P f uP f u 、HotStart TaqHotStart Taq、Taq Taq plusplus、Long TaqLong Taq、Taq Pla

19、tinumTaq PlatinumdNTPdNTP引物 SP6,Tn7,M13SP6,Tn7,M13S u p e r R N a s e HS u p e r R N a s e H- - Reverse TranscriptaseReverse TranscriptaseTA TA 克隆系統(tǒng)：克隆系統(tǒng)：pBS-T pBS-T 載體、連接和克隆試劑盒載體、連接和克隆試劑盒pGM-T pGM-T 載體、連接和克隆試劑盒載體、連接和克隆試劑盒pCF-T pCF-T 、pCF-Blunt pCF-Blunt 載體、快速連接試劑盒載體、快速連接試劑盒感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞DNA MarkerDNA M

20、arker：22種不同大小的分子量標(biāo)準(zhǔn)TIANGEN相關(guān)產(chǎn)品相關(guān)產(chǎn)品升博生物升博生物 專業(yè)服務(wù)專業(yè)服務(wù)引物的重要性引物的重要性p引物設(shè)計是PCR成功的關(guān)鍵。pPCR引物設(shè)計大都通過計算機軟件進行。可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁，得到設(shè)計好的引物，也可以在本地計算機上運行引物設(shè)計專業(yè)軟件。p引物設(shè)計需要一定的經(jīng)驗，不能單純依賴軟件。引物設(shè)計一般原則：長度引物設(shè)計一般原則：長度p引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-24 bp，但長片段擴增時，引物長度30-35 bp。p引物過短易引起錯配現(xiàn)象。例：一個12bp的引物在人類基因組上存在200個潛在的退火位點，而20bp的引物在人基因組上存在的退火位點只有1/400個.p較長的引物（28-35bp)，還常用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者用于產(chǎn)生一些突變位點。引物設(shè)計一般原則：結(jié)構(gòu)引物設(shè)計一般原則：結(jié)構(gòu)p盡量避免引物序列形成發(fā)夾，特別是3端。p盡量避免引物間形成二聚體、特別是3端前3個堿基間不能有二聚體。p避開局部富含GC或AT，3端避開連續(xù)同樣的堿基，如GGG，CCC和AT rich.引物設(shè)計一般原則：錯配引物設(shè)計一般原則：錯配p盡量避免引物在模板上有錯配位點p3端尤其不要形成非特異性結(jié)合。p無法避免錯配時，