第4章第2講免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及在食品中的應(yīng)用

1、第第4章章 第第2講講 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及在食品安全中的應(yīng)用在食品安全中的應(yīng)用熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)o利用免疫學(xué)技術(shù)可以檢測(cè)細(xì)菌、真菌、病毒、利用免疫學(xué)技術(shù)可以檢測(cè)細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)、各種毒素、蛋白寄生蟲(chóng)、各種毒素、蛋白o(hù)還可檢測(cè)激素、藥物殘留、抗生素及其他生還可檢測(cè)激素、藥物殘留、抗生素及其他生理活性物質(zhì)理活性物質(zhì)1酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)ELISA檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)技術(shù)ELISAo全稱(chēng)：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immuno sorbent assay） p 將抗原抗體

2、的特異性與酶反應(yīng)的敏感性相結(jié)將抗原抗體的特異性與酶反應(yīng)的敏感性相結(jié)合，使得食品在未經(jīng)分離提取的前提下，即合，使得食品在未經(jīng)分離提取的前提下，即能進(jìn)行定性或定量檢測(cè)能進(jìn)行定性或定量檢測(cè)p 廣泛用于細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)、各種廣泛用于細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)、各種毒素等大分子蛋白，以及激素、農(nóng)獸藥殘留、毒素等大分子蛋白，以及激素、農(nóng)獸藥殘留、抗生素能小分子物質(zhì)的檢測(cè)抗生素能小分子物質(zhì)的檢測(cè)可檢測(cè)標(biāo)本類(lèi)型廣泛可檢測(cè)標(biāo)本類(lèi)型廣泛體液：體液：血清、血漿、胸腹水、灌洗液、腦脊液血清、血漿、胸腹水、灌洗液、腦脊液分泌物：分泌物：唾液唾液排泄物：排泄物：尿液、糞便等尿液、糞便等細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞培養(yǎng)上清組織勻

3、漿組織勻漿1.1 ELISA 的發(fā)展歷程的發(fā)展歷程o免疫酶標(biāo)記技術(shù)是繼免疫熒光抗體技術(shù)和放射免疫分免疫酶標(biāo)記技術(shù)是繼免疫熒光抗體技術(shù)和放射免疫分析之后發(fā)展起來(lái)的一大新型的血清學(xué)技術(shù)。析之后發(fā)展起來(lái)的一大新型的血清學(xué)技術(shù)。o1966年，年，Nakane和和Avrameas等分別報(bào)道用酶等分別報(bào)道用酶代替熒光素標(biāo)記抗體，建立了酶標(biāo)抗體技術(shù)用于生物代替熒光素標(biāo)記抗體，建立了酶標(biāo)抗體技術(shù)用于生物組織中抗原的定位和鑒定。組織中抗原的定位和鑒定。o1971年，年，Engvall ，Van Weemen 等報(bào)道了酶等報(bào)道了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，從而建立了酶標(biāo)抗體的定量檢測(cè)技聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，從而建立了酶標(biāo)抗體的定

4、量檢測(cè)技術(shù)術(shù)o目前，免疫酶標(biāo)記技術(shù)已成為免疫診斷、檢測(cè)和分子目前，免疫酶標(biāo)記技術(shù)已成為免疫診斷、檢測(cè)和分子生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法之一。生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)方法之一。ELISA板板酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀測(cè)吸光度測(cè)吸光度ELISAELISA是一種是一種免疫免疫測(cè)定技術(shù)：基于抗原抗體反應(yīng)測(cè)定技術(shù)：基于抗原抗體反應(yīng)酶聯(lián)酶聯(lián)：抗原或抗體的：抗原或抗體的酶標(biāo)記酶標(biāo)記吸附吸附：抗原或抗體的：抗原或抗體的固相化固相化測(cè)定測(cè)定：加入酶反應(yīng)的底物后，被酶催化成為加入酶反應(yīng)的底物后，被酶催化成為有色產(chǎn)物有色產(chǎn)物，產(chǎn)物產(chǎn)物的量的量與標(biāo)本中與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定直接相關(guān)

5、，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定1.2 解釋?zhuān)好嘎?lián)免疫吸附測(cè)定解釋?zhuān)好嘎?lián)免疫吸附測(cè)定間接法間接法夾心法夾心法競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法捕獲法1.3 類(lèi)類(lèi) 型型酶酶抗抗抗抗體體酶標(biāo)記酶標(biāo)記抗抗體抗抗體抗體抗體抗原抗原固相載體固相載體1.將抗原包被在固相載體上。將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié)再加入酶標(biāo)記抗抗體，則結(jié)合為抗原合為抗原-抗體抗體-酶標(biāo)記抗抗體酶標(biāo)記抗抗體復(fù)合物。復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。酶催化底物并顯色。（1）間接法）間接法間接法間接法測(cè)抗體測(cè)抗體洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌洗滌待測(cè)抗體待測(cè)抗體酶標(biāo)抗

6、抗體酶標(biāo)抗抗體病原體病原體抗體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷（2）雙抗體夾心法雙抗體夾心法固相載體固相載體抗體抗體抗原抗原酶酶抗體抗體酶標(biāo)記抗體酶標(biāo)記抗體1.將抗體包被在固相載體上。將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結(jié)合如樣品中含有抗原，則結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。為抗原抗體復(fù)合物。3.再加入酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合再加入酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗體為抗體-抗原抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。物。4.酶催化底物并顯色。酶催化底物并顯色。夾心法夾心法測(cè)抗原測(cè)抗原 洗洗滌滌洗洗滌滌洗洗滌滌待測(cè)抗原待測(cè)抗原在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種在臨床檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋

7、白質(zhì)等大分子抗原蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP、hCGhCG等等產(chǎn)品舉例產(chǎn)品舉例o氟苯尼考（氟苯尼考（FF）ELISA快速檢測(cè)試劑盒快速檢測(cè)試劑盒 （Green Spring ）o可用于動(dòng)物組織（肌肉、肝臟）、尿液、血可用于動(dòng)物組織（肌肉、肝臟）、尿液、血清、蜂蜜、腸衣、牛奶以及水產(chǎn)品等樣品中清、蜂蜜、腸衣、牛奶以及水產(chǎn)品等樣品中氟苯尼考藥物殘留的檢測(cè)。氟苯尼考藥物殘留的檢測(cè)。 o人金黃色葡萄球菌腸毒素人金黃色葡萄球菌腸毒素(SE) ELISA 檢檢測(cè)試劑盒測(cè)試劑盒（3）酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法）酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)法固相載體固相載體抗體抗體抗原抗原酶酶酶標(biāo)

8、記抗原酶標(biāo)記抗原1.將抗體包被在固相載體上。將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則優(yōu)先如樣品中含有抗原，則優(yōu)先競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物。為抗原抗體復(fù)合物。3.同時(shí)加入酶標(biāo)記抗原，抗原同時(shí)加入酶標(biāo)記抗原，抗原沒(méi)有結(jié)合的位點(diǎn)酶標(biāo)記抗原沒(méi)有結(jié)合的位點(diǎn)酶標(biāo)記抗原去占據(jù)，則結(jié)合為酶標(biāo)記抗去占據(jù)，則結(jié)合為酶標(biāo)記抗原原-抗體復(fù)合物?？贵w復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。酶催化底物并顯色?？乖乖?jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)小分子抗原測(cè)小分子抗原洗滌洗滌洗滌洗滌待測(cè)抗原待測(cè)抗原酶標(biāo)抗原酶標(biāo)抗原小分子激素、藥物等小分子激素、藥物等ELISAELISA測(cè)定多用此法。測(cè)定多用此法。4 捕獲法示意

9、圖捕獲法示意圖酶酶抗體抗體酶標(biāo)記酶標(biāo)記 抗體抗體抗原抗原抗抗體抗抗體固相載體固相載體抗體抗體1.將抗抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體復(fù)合物。3. 加入抗原及酶標(biāo)記抗體，則結(jié)合為抗抗體-抗體-抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。4.酶催化底物并顯色。固相抗固相抗IgM特異特異IgM非特異非特異IgM標(biāo)本標(biāo)本特異抗原特異抗原抗原特異酶標(biāo)抗體抗原特異酶標(biāo)抗體底物底物此法常用于病毒性感染的早期診斷。此法常用于病毒性感染的早期診斷。捕獲法捕獲法1.4 操作流程操作流程o將抗原或抗體固定在固相載體上的過(guò)程稱(chēng)為包將抗原或抗體固定在固相載體上的過(guò)程稱(chēng)為包被被(coating)(coatin

10、g)。o 蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附物理吸附結(jié)結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。o大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。 （1 1） 包被包被包被的條件包被的條件 pH9.6 pH9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液 pH7.2pH7.2的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液 pH7-8pH7-8的的Tris-HCLTris-HCL緩沖液。緩沖液

11、。o 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置過(guò)夜，冰箱中放置過(guò)夜，3737中保溫中保溫2 2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度一般蛋白質(zhì)的包被濃度為為10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。（2 2）封）封 閉閉o封閉封閉(blocking)(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不

12、相關(guān)大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISAELISA后的步后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。驟中干擾物質(zhì)的再吸附。o常用封閉劑：常用封閉劑：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清的小牛血清或或1%1%明膠明膠; ;脫脂奶粉脫脂奶粉, ,比較價(jià)廉，可以高濃度使用比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%5%）。）。o 所有的所有的ELISAELISA固相均需封閉。固相均需封閉。（3 3）加樣）加樣o在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加樣步聚次加樣步聚o即加樣本，加酶結(jié)合物，加底物。即加樣本，加酶結(jié)合物，加底物。

13、o加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避免板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。泡。（4 4）保）保 溫溫o抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育o應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。于兩塊板同時(shí)測(cè)定。（5 5）洗滌）洗滌o洗滌在洗滌在ELISAELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)

14、的成敗。著實(shí)驗(yàn)的成敗。oELSIAELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。o清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。來(lái)。o可以說(shuō)在可以說(shuō)在ELISAELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。(6)(6)顯色顯色o顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫顯色

15、是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。 酶酶o在在ELISAELISA中，可以采用的有中，可以采用的有HRPHRP，APAP，葡萄糖，葡萄糖氧化酶，氧化酶，-D-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。oHRPHRP（辣根過(guò)氧化物酶）（辣根過(guò)氧化物酶）是一種糖蛋白，含糖是一種糖蛋白，含糖量約為量約為18%18%，分

16、子量為，分子量為4400044000，是一種復(fù)合酶，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。底物底物oHRPHRP的底物的底物o DH2+ H2O2 D+ 2H2OoDH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。的產(chǎn)物。oDH2如：鄰苯二胺如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等。等。oOPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色橙紅色，用酸終止酶反，用酸終止酶反應(yīng)后，在應(yīng)后，在492nm492nm處有最高吸收峰，靈敏度高處有最高

17、吸收峰，靈敏度高oTMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后共產(chǎn)物顯作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色藍(lán)色。TMBTMB性質(zhì)較性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H H2 2O O2 2溶液溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMBTMB產(chǎn)物產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為吸收波長(zhǎng)為450nm450nm。1.5ELISA 影響因素影響因素 固相載體：固相載體：ELISA ELISA 中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板。中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反應(yīng)板。 抗原：可溶性、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原

18、性要高。抗原：可溶性、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的制劑，純度和免疫原性要高。 試驗(yàn)樣品：血清、血漿或其他體液，均可作為試驗(yàn)樣品：血清、血漿或其他體液，均可作為 ELISA ELISA 的試驗(yàn)樣品。的試驗(yàn)樣品。 結(jié)合物：酶結(jié)合物要求穩(wěn)定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，結(jié)合物：酶結(jié)合物要求穩(wěn)定，具有很高的酶活性，抗原或抗體的特異性，產(chǎn)量高及成本低。產(chǎn)量高及成本低。 底物：各種酶都有對(duì)底物的底物：各種酶都有對(duì)底物的特異性特異性，不同種類(lèi)的酶要求有不同的底物。，不同種類(lèi)的酶要求有不同的底物。 作用時(shí)間：加底物后終止時(shí)間？作用時(shí)間：加底物后終止時(shí)間？ 結(jié)果判斷結(jié)果判斷:ELISA :ELISA 的試驗(yàn)結(jié)果可用肉

19、眼觀察顏色反應(yīng)的深淺作出判斷，也的試驗(yàn)結(jié)果可用肉眼觀察顏色反應(yīng)的深淺作出判斷，也可用可用分光光度計(jì)分光光度計(jì)作精確測(cè)定。作精確測(cè)定。 試驗(yàn)的重復(fù)性（精確度）試驗(yàn)的重復(fù)性（精確度） ：通常用：通常用變異系數(shù)變異系數(shù)來(lái)表示。來(lái)表示。思考：如何研發(fā)商品化的思考：如何研發(fā)商品化的ELISA試劑盒？試劑盒？需要什么原料，得到哪些組分，需要什么原料，得到哪些組分，摸清哪些條件，才能夠進(jìn)行組摸清哪些條件，才能夠進(jìn)行組裝？裝？2 2免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)（膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)、膠體金層析）（膠體金試紙條檢測(cè)技術(shù)、膠體金層析）大腸桿菌大腸桿菌O157:H7快速檢測(cè)快速檢測(cè)試紙（膠體金）試紙（膠體金）2.1

20、 2.1 簡(jiǎn)簡(jiǎn) 介介 膠體金試紙條診斷是采用膠體金免疫層膠體金試紙條診斷是采用膠體金免疫層析技術(shù)研制而成，該技術(shù)是析技術(shù)研制而成，該技術(shù)是9090年代初在免疫年代初在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡(jiǎn)易快速的免滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡(jiǎn)易快速的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，最先用于人絨毛膜促性腺激疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，最先用于人絨毛膜促性腺激素（素（HCGHCG）的測(cè)定和乙型肝炎病毒表面抗原的測(cè)定和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAgHBsAg）等檢測(cè)。等檢測(cè)。p膠體金膠體金（Colloidal goldColloidal gold）是氯金酸是氯金酸（HAuClHAuCl4 4）的水溶膠，氯金酸在還原劑的作的水溶膠，氯

21、金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。故稱(chēng)膠體電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。故稱(chēng)膠體金金用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、用還原法可以方便地從氯金酸制備各種不同粒徑、也就是不同顏色的膠體金顆粒也就是不同顏色的膠體金顆粒質(zhì)量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球質(zhì)量好的膠體金：溶液呈紅色，膠體金顆粒為球形，大小均一，無(wú)棱角。形，大小均一，無(wú)棱角。質(zhì)量差的膠體金：溶液呈紫色，大小不一，形狀質(zhì)量差的膠體金：溶液呈紫色，大小不一，形狀各異。各異。膠體金的質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)膠體金的質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)p膠體金標(biāo)記的原理：膠體

22、金標(biāo)記的原理：p膠體金在堿性條件下帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)分膠體金在堿性條件下帶負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)靜電吸引而形成牢固結(jié)合。子的正電荷基團(tuán)靜電吸引而形成牢固結(jié)合。p膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。p標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中 2.22.2膠體金試紙條診斷技術(shù)的原理膠體金試紙條診斷技術(shù)的原理 以硝酸纖維素膜為載體，利用了

23、微孔膜以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細(xì)血管作用，滴加在膜條一端的液體慢的毛細(xì)血管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，通過(guò)抗原抗體結(jié)合，并利慢向另一端滲移，通過(guò)抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測(cè)抗原用膠體金呈現(xiàn)顏色（紅色）反應(yīng)，檢測(cè)抗原/ /抗體?？贵w。檢測(cè)線(xiàn)檢測(cè)線(xiàn)質(zhì)控線(xiàn)質(zhì)控線(xiàn)吸收墊吸收墊樣品墊樣品墊硝酸纖維素膜硝酸纖維素膜膠體金墊膠體金墊背襯背襯（底板）（底板）膠體金試紙條示意圖膠體金試紙條示意圖 2.3 分類(lèi)分類(lèi)o間接法間接法-測(cè)抗體測(cè)抗體o雙抗夾心法雙抗夾心法-測(cè)大分子抗原測(cè)大分子抗原-食品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)o競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法-測(cè)小分子抗原測(cè)

24、小分子抗原-食品中瘦肉精、黃曲霉毒素的檢測(cè)食品中瘦肉精、黃曲霉毒素的檢測(cè)沙門(mén)氏菌單克隆抗體沙門(mén)氏菌單克隆抗體可能含有可能含有沙門(mén)氏菌沙門(mén)氏菌的樣品的樣品（1）雙抗夾心法檢測(cè)抗原）雙抗夾心法檢測(cè)抗原測(cè)大分子抗原測(cè)大分子抗原沙門(mén)氏菌多沙門(mén)氏菌多克隆抗體克隆抗體抗抗體抗抗體（2）思考）思考o(jì)競(jìng)爭(zhēng)法的原理？競(jìng)爭(zhēng)法的原理？o檢測(cè)線(xiàn)噴的是純化的抗原，與待檢測(cè)線(xiàn)噴的是純化的抗原，與待檢測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)o這種情況下的結(jié)果判定？這種情況下的結(jié)果判定？2.4 2.4 膠體金快速診斷技術(shù)的特點(diǎn)膠體金快速診斷技術(shù)的特點(diǎn) p簡(jiǎn)捷快速：簡(jiǎn)捷快速：操作簡(jiǎn)單，一般只要操作簡(jiǎn)單，一般只要5 5-10min -10min

25、就會(huì)就會(huì)出結(jié)果，而其它方法如出結(jié)果，而其它方法如ELISAELISA需要需要1 1-2h-2h，PCR PCR 需要時(shí)間更長(zhǎng)。需要時(shí)間更長(zhǎng)。p結(jié)果易于判定：結(jié)果易于判定：陰、陽(yáng)性呈色很明顯，肉眼很陰、陽(yáng)性呈色很明顯，肉眼很容易判斷。容易判斷。p特異性好：特異性好：因?yàn)樵摷夹g(shù)大多用單克隆抗體標(biāo)記，因?yàn)樵摷夹g(shù)大多用單克隆抗體標(biāo)記，這決定了它具有很好的特異性。這決定了它具有很好的特異性。2.5 技術(shù)分項(xiàng)技術(shù)分項(xiàng) 樣品墊樣品墊 吸水墊吸水墊 粘性底板粘性底板 NCNC膜膜 膠體金墊膠體金墊 干燥方法干燥方法 抗原抗體生物原料抗原抗體生物原料 膠體金制備膠體金制備 標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記技術(shù) 溶液噴點(diǎn)溶液噴點(diǎn) 溶

26、液體系分析溶液體系分析 裝配裝配 切條切條 包裝包裝（1）金標(biāo)墊與樣品墊的處理）金標(biāo)墊與樣品墊的處理o1，金標(biāo)墊裁剪成長(zhǎng)，金標(biāo)墊裁剪成長(zhǎng)10，寬，寬8長(zhǎng)條長(zhǎng)條o2，樣品墊裁剪成長(zhǎng)，樣品墊裁剪成長(zhǎng)30，寬，寬2.5長(zhǎng)條長(zhǎng)條o3，將裁剪好的金標(biāo)墊與樣品墊，分別用金標(biāo)墊，將裁剪好的金標(biāo)墊與樣品墊，分別用金標(biāo)墊處理液與樣品墊處理液浸潤(rùn)，放入處理液與樣品墊處理液浸潤(rùn)，放入37溫箱中烘溫箱中烘干儲(chǔ)存在干燥器中置干儲(chǔ)存在干燥器中置4冷庫(kù)中備用。冷庫(kù)中備用?？贵w抗體 Antibody 來(lái)源差異來(lái)源差異: 鼠抗鼠抗,兔抗和羊抗兔抗和羊抗 種類(lèi)差異種類(lèi)差異: 單抗單抗,多抗多抗 腹水的處理腹水的處理: 飽和硫酸銨

27、沉淀法飽和硫酸銨沉淀法 特異性特異性:親和層析柱親和層析柱 濃度濃度: 濃縮濃縮 溶解液溶解液:不含鹽不含鹽,例如例如PB（2）抗原抗體生物原料）抗原抗體生物原料抗原抗原 Antigen 偶聯(lián)抗原物質(zhì)偶聯(lián)抗原物質(zhì): BSA, OVA等等 毒品檢測(cè)來(lái)源毒品檢測(cè)來(lái)源: 合成抗原合成抗原（3）標(biāo)記技術(shù)）標(biāo)記技術(shù) Conjugate 容器硅化處理容器硅化處理 金顆粒制備金顆粒制備 (負(fù)電負(fù)電) 顏色與顆粒的關(guān)系顏色與顆粒的關(guān)系.最佳標(biāo)記顆粒大小最佳標(biāo)記顆粒大小40nm. 蛋白質(zhì)最適用量測(cè)定蛋白質(zhì)最適用量測(cè)定:鹽析法鹽析法（4）膠體金制作流程 1，向硅化過(guò)的三角瓶中加入向硅化過(guò)的三角瓶中加入100ml去

28、離子水，再加入去離子水，再加入1ml濃度濃度為為1%的氯金酸的氯金酸 2,將三角瓶放入微波爐中加熱，沸騰時(shí)取出，一次性迅速加將三角瓶放入微波爐中加熱，沸騰時(shí)取出，一次性迅速加入入1850l濃度濃度1%檸檬酸三鈉，搖動(dòng)約檸檬酸三鈉，搖動(dòng)約20s（檸檬酸三鈉經(jīng)（檸檬酸三鈉經(jīng)0.22濾濾膜過(guò)濾）膜過(guò)濾） 3,再將三角瓶放入微波爐中大火再將三角瓶放入微波爐中大火1分鐘，調(diào)中火繼續(xù)加熱五分分鐘，調(diào)中火繼續(xù)加熱五分鐘。鐘。 4，拿出來(lái)冷卻，待溫度降至室溫時(shí)用去離子水補(bǔ)足到，拿出來(lái)冷卻，待溫度降至室溫時(shí)用去離子水補(bǔ)足到100ml,用用0.1M的碳酸鉀調(diào)節(jié)的碳酸鉀調(diào)節(jié)PH至略高于待標(biāo)記蛋白的等電點(diǎn)，至略高于待標(biāo)記蛋白的等電點(diǎn)，0.22過(guò)過(guò)濾轉(zhuǎn)移至硅化過(guò)的平底藍(lán)蓋瓶中。濾轉(zhuǎn)移至硅化過(guò)的平底藍(lán)蓋瓶中。 5，藍(lán)蓋瓶中放入攪拌子，攪拌，向金溶液中加入蛋，藍(lán)蓋瓶中放入攪拌子，攪拌，向金溶液中加入蛋白白,標(biāo)記量為標(biāo)記量為2g/ml，緩慢加入標(biāo)記蛋白。，緩慢加入標(biāo)記蛋白。6,攪拌攪拌,半小時(shí)后加入濃度為半小時(shí)后加入濃度為10%的的BSA至終濃度為至終濃度為0.2%，繼續(xù)攪拌一小時(shí)。，繼續(xù)攪拌一小時(shí)。7，將標(biāo)記好的溶液轉(zhuǎn)至，將標(biāo)記好的溶液轉(zhuǎn)至50ml離心管中，離心管中，3500rpm/min，4離心