溶酶體膜蛋白Sidt2對(duì)胰島素顆粒分泌的影響及機(jī)制

1、溶酶體膜蛋白Sidt2對(duì)胰島素顆粒分泌的影響及機(jī)制目的:前期研究發(fā)現(xiàn)溶酶體膜蛋白Sidt2剔出小鼠表現(xiàn)出糖代謝紊亂和胰島 素分泌受損，本研究在此基礎(chǔ)上圉繞朕島素分泌相關(guān)蛋白等的檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步探討 Sidt2影響胰島素分泌的具體機(jī)制，深化對(duì)溶爾體膜蛋白Sidt2與糖尿病發(fā)病相 關(guān)性的認(rèn)識(shí)，豐富糖尿病的發(fā)病機(jī)制理論。方法:1、將野生型小鼠與 Sidt2-/-小鼠合籠，基因型的鑒定采用鼠尾DNA,接著同籠交配子代 Sidt2+/-雜合*子小鼠，最后選取了代 Sidt2-/-雄鼠為 實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組是同窩或者同一個(gè)批次岀生的Sidt2+/+野生型雄鼠。進(jìn)行DMA鑒定后行胰島的光學(xué)顯微鏡和解剖顯微鏡觀察。2

2、、檢測(cè) Sidt2+/+和 Sidt2-/-小鼠的糖耐量。3、對(duì) Sidt2+/+和 Sidt2-/-小鼠的胰腺組織進(jìn)彳亍 insulin的免疫組化檢測(cè)。4、在離體水半通過(guò)Western blot檢測(cè)小鼠胰島中參 與胰島索分泌的關(guān)鍵蛋白:SNAP25 VAMP1 Syntaxin、Syntaxinl的表達(dá)。5、運(yùn)用小干擾RNA技術(shù)在INS1細(xì)胞水半敲降Sidt2,并通過(guò)western blot 檢測(cè)細(xì)胞水平中參與胰島素分泌關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。6、檢測(cè)高糖刺激下,Sidt2敲 降的INS1細(xì)胞的胰島素分泌情況。7、運(yùn)用過(guò)表達(dá)載體在INS1細(xì)胞水平過(guò)表達(dá)Sidt2,并通過(guò)western blot檢 測(cè)

3、細(xì)胞水半中參與胰島素分泌關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。8、Sidt2基因啟動(dòng)子字列設(shè)計(jì) 三對(duì)引物，分別以98例2型糖尿病患者和67例正常人血清DNA為模板，進(jìn)行PCR, 并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，尋找單核昔酸突變位點(diǎn)，并對(duì)找到的單核昔酸突變位點(diǎn) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果：1、從DA分子水半證明Sidt2-/-因剔除小鼠模型構(gòu)造 是成功的。2、Sidt2-/-小鼠在生長(zhǎng)發(fā)育、皮毛的光澤以及應(yīng)激反應(yīng) 等一般方面相較于野生型均是落后的。光學(xué)顯微鏡和解剖顯微鏡的觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的胰島體積較大、形態(tài)規(guī)則飽 滿、數(shù)最較多；而Sidt2-/-小鼠的胰島體積較小、形態(tài)多不規(guī)則、 數(shù)量較少。3、免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Sidt2-/-小鼠胰

4、腺組織的insulin 表達(dá)量相較于對(duì)照組的表達(dá)最是降低的(P<O. 05)4. Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)參與胰島素分泌的關(guān)鍵蛋白：SNAP25、VAMP1、 Syntaxin的表達(dá)在Sidt2sup-/Y/sup小鼠中相較于野生型小鼠是降低的 (P<0. 05)o 5、在大鼠胰島腫瘤細(xì)胞INS1水平上用質(zhì)粒干擾Sidt2的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)VAMP1的表達(dá)在Sidt2敲降的INS1細(xì)胞中相較于空白對(duì)照組的INS1是降低 的(P<0. 05)o6、在大鼠胰島腫瘤細(xì)胞INS1水半上用過(guò)表達(dá)載體過(guò)表達(dá)Sidt2,發(fā)現(xiàn)敲降 狀態(tài)下的SNAP25. VAMP1. Syntaxin的

5、表達(dá)的下降被糾正了。7、在動(dòng)物水平和 細(xì)胞水半兩方面證實(shí)了 Sidt2剔除可以導(dǎo)致糖代謝發(fā)生異常。8、發(fā)現(xiàn)三個(gè)單核苜酸突變位點(diǎn):A1521G, G1816A, C502A,其中C502A在2型糖 尿病患者和正常對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：1、Sidt2-/- 可影響小鼠胰島形態(tài)，主耍表現(xiàn)為胰島細(xì)胞的體積變小、形態(tài)不規(guī)則、胰島數(shù)量 減少。2、Sidt2作為多重跨膜溶酶體膜蛋白參與了胰島素顆粒的分泌過(guò)程。Sidt2 剔除導(dǎo)致糖代謝紊亂并抑制了胰島素分泌的關(guān)鍵囊泡蛋白SNAP25、VAMP1、 Syntaxin的表達(dá)進(jìn)而阻礙了咦島素分泌顆粒的正常胞吐，導(dǎo)致胰島細(xì)胞的胰島 素分泌障礙，最終進(jìn)入糖尿病階段。3、在細(xì)胞的水平進(jìn)一步驗(yàn)證了 Sidt2的缺失對(duì)于SNARE蛋白表達(dá)的下