鋅對(duì)鐵脅迫下小麥幼苗根抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性的影響

1、目 錄摘要.21 前言.22 材料方法.42.1 植物材料的培養(yǎng).42.2 酶活檢測(cè).42.2.1 APX活性的檢測(cè).42.2.2 GR活性的檢測(cè).42.2.3 蛋白含量的檢測(cè).52.3 數(shù)據(jù)分析.53 實(shí)驗(yàn)結(jié)果.53. 1鐵鋅復(fù)合脅迫對(duì)APX活性的影響.53. 2鐵鋅復(fù)合脅迫對(duì)GR活性的影響.54討論.6參考文獻(xiàn).7鋅對(duì)鐵脅迫下小麥幼苗根抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性的影響XXX（西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅，蘭州，730070）摘要：本文以“西旱三號(hào)”小麥幼苗為材料，探究了不同濃度Zn (50 mol L-1、250 mol L-1及2 mmol L-1)對(duì)300 mol L-

2、1Fe脅迫下小麥幼苗根中APX和GR活性的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)Fe脅迫誘導(dǎo)了小麥幼苗根系中APX活性的升高和GR活性的降低。與單獨(dú)Fe處理相比，50 mol L-1 Zn的加入降低了小麥根APX活性，而250 mol L-1和2 mmol L-1Zn的加入明顯增加了該酶的活性；不同濃度Zn的使用均明顯增加了單獨(dú)Fe處理下小麥幼苗根GR的活性。結(jié)果表明，Zn的加入誘導(dǎo)Fe脅迫下小麥幼苗根中APX和GR活性的升高，有助于緩解Fe對(duì)植物根的毒害作用。關(guān)鍵詞：鋅；鐵；小麥；APX；GREffect of Zn on ascorbate peroxidase and glutathione reduct

3、ase activities in wheat seedling roots under Fe stressXXX（College of Life Science, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, Gansu, China）Abstract：The study aimed to investigate the effects of different Zinc(Zn) concentrations (50 mol L-1、250 mol L-1 and 2 mmol L-1) on the activies of APX and GR

4、in Xihan wheat seedlings exposed to 300 mol L-1 iron(Fe) treatment. The results showed that single Fe stress induced the increase of APX activity and the decrease of GR activity in wheat seedling rootsCompared with the single Fe stress, the addition of 50 mol L-1 Zn reduced APX activity, while 250 m

5、ol L-1和2 mmol L-1Zn applied enhanced the activity of this enzyme in wheat roots. The application of different Zn concentrations significantly elevated GR activity in single Fe-treated seedling roots. The results suggested that the application of zinc induced the increases of APX and GR activities in

6、 Fe-treated wheat roots, which contributed to alleviating the toxic of Fe to plant roots.Keywords：zinc；iron；wheat；APX；GR1 前言隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，污水灌溉、農(nóng)藥、除草劑等的使用，大量重金屬如銅（Cu）、鋅（Zn）、鐵（Fe）、鎘（Cd）等被帶入到環(huán)境中，引起環(huán)境的污染。鋅是兼具營(yíng)養(yǎng)和毒害雙重效應(yīng)的重金屬元素，其一方面具有重要的生理功能和營(yíng)養(yǎng)作用，在高等植物體內(nèi)主要作為某些酶的專一性組份或作為某些酶的激活劑參與代謝的各種生化過程，影響DNA、RNA聚合酶進(jìn)而影響核酸和蛋白質(zhì)的合

7、成，維持和穩(wěn)定生物膜功能的完整性。另一方面，高濃度情況下則抑制種子萌發(fā)、植物的生長(zhǎng)、干物質(zhì)積累，降低光合色素含量和破壞光合作用等生理活動(dòng)，并最終導(dǎo)致植物死亡1。鐵是植物必需的微量元素，在植物體的光合作用、呼吸作用、固氮作用、蛋白質(zhì)和核酸的合成等生理代謝過程的電子傳遞或酶促反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。雖然在地殼中鐵元素豐度很高，但由于受土壤溶液中pH值和氧分壓的影響，幾乎都是以難溶于水的Fe3+形式存在，特別在石灰性土壤中（Ph7.48.5）中，植物常表現(xiàn)出缺鐵癥狀。而在熱帶低洼地區(qū)或酸性土壤中，F(xiàn)e2+又往往過量積累，使植物受到鐵毒脅迫，嚴(yán)重影響產(chǎn)量2。環(huán)境脅迫如低溫、高溫、干旱、重金屬以及鹽脅迫等

8、都會(huì)影響植物生長(zhǎng)代謝，使植物體內(nèi)發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，同時(shí)ROS作為副產(chǎn)物大量生成，如果不被及時(shí)清除，ROS將會(huì)對(duì)植物造成嚴(yán)重的傷害3。重金屬逆境脅迫可誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度的增加而導(dǎo)致氧化脅迫，因而植物的抗逆性的形成往往與抗氧化酶系統(tǒng)活性的增強(qiáng)相關(guān)?？箟难?谷胱甘肽循環(huán)（ascorbate-glutathione cycle）4在有效去除活性氧和維持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，其由三個(gè)相互依賴的氧化還原對(duì)組成，即抗壞血酸/脫氫抗壞血酸，還原型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽GSH/GSSG，以及NADPH/NADP。谷胱甘肽水平可感知環(huán)境的變化，且激發(fā)一種上行調(diào)節(jié)機(jī)制，從而保證抗壞血酸，谷

9、胱甘肽及NADPH庫在環(huán)境脅迫下緊密的共同調(diào)節(jié)作用。其中，抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一，尤其是葉綠體中清除H2O2的關(guān)鍵酶，又是維生素C代謝的主要酶類。H2O2是植物葉綠體中光合電子傳遞鏈和某些酶反應(yīng)的天然產(chǎn)物，是具有毒害作用的活性氧5。APX 可以快速清除細(xì)胞中產(chǎn)生的過量的H2O2，使細(xì)胞免受活性氧毒害6。APX 在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等生理過程中都發(fā)揮著非常重要的作用。谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase GR）是一種黃素蛋白氧化還原酶，它在真核生物和原核生物中都有發(fā)現(xiàn)，對(duì)植物來說，它

10、在氧化脅迫反應(yīng)中對(duì)清除活性氧起關(guān)鍵作用。谷胱甘肽水平的高低與植物對(duì)各種生物異源物質(zhì)及生物與非生物環(huán)境脅迫的忍耐密切相關(guān)7。GR參與植物逆境響應(yīng)代謝途徑，通過改變酶活性水平及基因轉(zhuǎn)錄水平，降低植物體內(nèi)ROS含量，從而保護(hù)植物不受氧化脅迫的危害，得以在逆境中存活8。小麥作為世界上最主要的糧食之一，對(duì)重金屬元素又具有一定的富集和生物轉(zhuǎn)化作用9，而目前，重金屬污染越來越嚴(yán)重，因而重金屬元素對(duì)小麥的影響將越來越值得人們關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)探究不同濃度Zn對(duì)單獨(dú)Fe脅迫下小麥幼苗根中APX和GR活性的影響。試圖探明鋅與鐵脅迫下小麥幼苗的抗逆機(jī)理，為深入了解和認(rèn)識(shí)小麥抗重金屬污染的生理生化機(jī)制提供依據(jù)。2 材料與方

11、法2.1 植物材料的培養(yǎng)供試小麥“西旱3號(hào)”購自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。挑選籽粒均勻、飽滿的種子用0.1% HgCl2表面消毒10 min，流水沖洗10 h后暗中萌發(fā)24 h。種子發(fā)芽后將其整齊排列于大小一致的培養(yǎng)皿中，并置于24 2，12 h/12 h（光照/黑暗）和300 mol m-2 s-1條件的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間分別用含有300 mol L-1 FeCl3（Fe）、50 mol L-1 ZnCl2（Zn）+ 300 mol L-1 Fe、250 mol L-1 Zn + 300 mol L-1 Fe和2 mmol L-1 Zn + 300 mol L-1 Fe的1/4 Hoagland

12、營(yíng)養(yǎng)液脅迫處理小麥幼苗，同時(shí)設(shè)置1/4 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照，每種處理3個(gè)重復(fù)，隔天更換處理液，待幼苗生長(zhǎng)6 d后取材測(cè)定各個(gè)生理指標(biāo)。2.2 酶活檢測(cè)2.2.1 APX活性的檢測(cè)APX活性檢測(cè)依據(jù)Nakano和Asada10的方法，稍有修改。將小麥根置于50 mmol L-1 PBS緩沖液（pH 7.0，內(nèi)含1 mmol L-1 EDTA-Na2 和 1 mmol L-1 ASA）中冰浴研磨，13，000 g離心20 min后，取適量上清液加入到50 mmol L-1 PBS（pH 7.0）和0.5 mmol L-1 ASA混合液中，于25水浴5 min后，加入0.05%（v/v）H

13、2O2啟動(dòng)反應(yīng)，在290 nm處以15 s為時(shí)間間隔作1 min掃描。酶活單位均為U mg-1 protein。2.2.2 GR活性的檢測(cè)小麥根組織置于50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.5）、0.1 mmol L-1 EDTA-Na2和0.1% （w/v）PVP中冰浴研磨，然后于13, 000 g 離心30 min并收集上清液。參考Schaedle和Bassham11的方法測(cè)定谷胱甘肽還原酶（GR）的活性。將適量上清加入到50 mmol L-1 Tris-HCl（pH 7.5, 內(nèi)含3 mmol L-1 MgCl2 0.5 mmol L-1 GSSG和0.15 mmol L-

14、1 NADPH)中，25水浴5 min后，于340 nm處以30 s為時(shí)間間隔掃描3 min，以每分鐘吸光值變化0.1為一個(gè)酶活單位, 酶活單位均為U mg-1 protein。2.2.3 蛋白含量的檢測(cè)蛋白含量的檢測(cè)參照Bradford12的方法，在波長(zhǎng)595nm處測(cè)定光吸收值，并以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算蛋白含量。2.3 數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，采用Excel2007軟件完成數(shù)據(jù)整理與制圖，結(jié)果用平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，P0.05表示有顯著性差異。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 不同濃度Zn對(duì)Fe脅迫下小麥幼苗根APX活性的影響 圖1 不同濃度Zn對(duì)Fe脅迫下小麥幼苗根APX活性

15、的影響Fig.1 Effect of zinc on APX activity in wheat seedlings root under iron treatment圖中不同小寫字母表示各處理間差異顯著（P0.05）.Different lowercase indicate significant difference at 0.05 level (the same as below) 由圖1可知，在300 mol L-1的Fe處理時(shí)，APX的活性略高于對(duì)照組。與單獨(dú)Fe脅迫相比，50 mol L-1 Zn的加入導(dǎo)致APX活性的降低；而250 mol L-1和2 mmol L-1Zn的使用明

16、顯增高了單獨(dú)Fe脅迫下APX的活性，并且與鐵單獨(dú)脅迫時(shí)相比分別升高約55%和42%。3.2 不同濃度Zn對(duì)Fe脅迫下小麥幼苗根GR活性的影響圖2 不同濃度Zn對(duì)Fe脅迫下小麥幼苗根GR活性的影響Fig.2 Effect of zinc on GR activity in wheat seedlings root under iron treatment由圖2可以看出，與未處理的小麥相比，單獨(dú)Fe處理明顯抑制了小麥幼苗根中GR的活性。與單獨(dú)Fe處理相比，不同濃度Zn(50 mol L-1、250 mol L-1及2 mmol L-1)的使用均明顯增加了小麥根GR活性。其中250 mol L-1Z

17、n + Fe處理下的根GR活性最高，與單獨(dú)Fe脅迫相比升高了約181%。4討論植物在受到重金屬脅迫時(shí)，其體內(nèi)的活性氧濃度會(huì)隨之增加，因而所受的重金屬脅迫主要是活性氧造成的氧化脅迫，而抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)在有效去除活性氧和維持細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。谷胱甘肽-抗壞血酸循環(huán)主要存在于植物葉綠體，其作用是除去光反應(yīng)中產(chǎn)生的大量過氧化氫。質(zhì)體谷胱甘肽-抗壞血酸循環(huán)中四種酶也具高的活性和廣泛作用?？梢姡入赘孰?抗壞血酸循環(huán)是光合細(xì)胞器中主要的過氧化氫代謝途徑13，在植物線粒體中也存在一完整的類似于葉綠體中的抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)14。有關(guān)其對(duì)非生物逆境脅迫的響應(yīng)，近幾十年來有不少學(xué)者進(jìn)行研

18、究且取得了一定的進(jìn)展。Hu等15研究?jī)煞N不同基因型的多年生黑麥草（Lolium perenne L.）對(duì)不同濃度鹽脅迫的響應(yīng)，用250 mmol/L的濃度分別處理鹽耐受型和敏感型的黑麥草植株12d。結(jié)果表明，鹽耐受型的植物在處理4d后，葉片中SOD和APX的活性都非常高。有研究表明，低濃度AI處理下，Scuot和“揚(yáng)麥9號(hào)”根系還原型抗壞血酸含量有所升高，表明Al敏感品種根系在較輕Al脅迫下抗壞血酸介導(dǎo)的抗氧化能力增加。而在高濃度Al處理下，Scuot和“揚(yáng)麥9號(hào)”根系還原型抗壞血酸含量有不同程度的降低，同時(shí)根系質(zhì)外體APX活性顯著降低16。這些都說明在非生物逆境脅迫下，APX活性增加對(duì)植物抵

19、抗不良環(huán)境起著積極的作用17。而 APX 被認(rèn)為是植物中清除過氧化氫非常重要的一種過氧化物酶。APX主要存在于葉綠體內(nèi)，依賴于抗壞血酸將葉綠體內(nèi)H2O2轉(zhuǎn)化為水，并產(chǎn)生脫氫抗壞血酸，脫氫抗壞血酸在DHAR與GR作用下重新轉(zhuǎn)化為抗壞血酸，這就是植物體內(nèi)一條重要的活性氧清除途徑18。本實(shí)驗(yàn)中，在鐵單獨(dú)脅迫時(shí)，APX的活性略高于對(duì)照組。與單獨(dú)Fe脅迫相比，50 mol L-1 Zn的加入導(dǎo)致APX活性的降低；而250 mol L-1和2 mmol L-1Zn的使用卻明顯導(dǎo)致了APX活性的增高，與鐵單獨(dú)脅迫時(shí)相比分別升高約55%和42%，這可能是由于250 mol L-1和2 mmol L-1濃度的鋅

20、在一定程度上緩解了鐵的脅迫作用。多種逆境條件均能誘導(dǎo)GR酶活性發(fā)生不同的變化。且GR酶活性的變化隨物種品種逆境條件的不同而不同。在抗性品種中，GR酶活性增加，且始終維持較敏感型植物中較高的酶活性，而在脅迫敏感型植物中GR酶活性則減小19。在植物已發(fā)現(xiàn)的抗氧化劑中，抗壞血酸含量最為豐富14，其維持細(xì)胞的氧化還原態(tài)。植物中的抗壞血酸濃度在10300 mmol的范圍內(nèi)。在對(duì)西紅柿葉的研究中也得到了相似的結(jié)論，低濃度Zn的添加緩解并增加了Cd脅迫下SOD、CAT、APX和GR的活性20。另有研究表明，在Zn脅迫處理下，田菁21和番茄22體內(nèi)抗氧化酶SOD和APX活性均升高。本實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)Fe處理時(shí)GR

21、的活性低于對(duì)照組，明顯抑制了小麥幼苗根中GR的活性。與單獨(dú)Fe處理相比，不同濃度Zn(50 mol L-1、250 mol L-1及2 mmol L-1)的使用均明顯增加了小麥根GR活性。其中250 mol L-1Zn + Fe處理下的根GR活性最高，與單獨(dú)Fe脅迫相比升高了約181%。植物重金屬傷害及抗性機(jī)理十分復(fù)雜，其耐性性狀可能是由多個(gè)基因控制的。前人認(rèn)為抗氧化酶活性的維持和提高是作物耐受鐵鋅脅迫的物質(zhì)基礎(chǔ)之一23,24。本實(shí)驗(yàn)僅從APX和GR活性方面分析了小麥幼苗根對(duì)抗逆性的原因，但其深入的毒害機(jī)制還需從細(xì)胞、分子水平上作進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1 劉家忠，龔明植物抗氧化系統(tǒng)研究進(jìn)展J云

22、南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，19(6):1-112 POTTERS G，HOREMANS NELE，BELLONE S，et alDehydroascorbate Influences the Plant Cell Cycle Through a Glutathione-independent reduction MechanismJPlant Physiology，2004，(134)：1479-14873 Ahmad P，Sarwat M，Sharma SReactive oxygen species，antioxidants and signaling in plantsJ Plant B

23、iol，2008，51(3):167-1734 BALL L，ACCOTTO G P，BECHTOLD U，et alEvidence for a Direct Link etween Glutathione Biosynthesis and Stress Defense GeneExpression in ArabidopsisJThe Plant Cell，2004，(16)：2448-24625 李光遠(yuǎn)，王鳳華植物維生素C過氧化物酶研究進(jìn)展J現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，08:66 李澤琴，李靜曉，張根發(fā)植物抗壞血酸過氧化物酶的表達(dá)調(diào)控以及對(duì)非生物脅迫的耐受作用J遺傳201301，35(1

24、): 45-547MAYM J，VERNOUX T，LEAVER C，MONTAGUM V，INZEDG lutathione homeostasis in plant：Implications for environment a sensing and plant developmentJJExpBot1998，49：649-6678 林源秀，顧欣昕，湯浩茹植物谷胱甘肽還原酶的生物學(xué)特性及功能J中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，20130629(6):534-5429 Nagajyotip C，Dinakar N，Prasadtnvk V，et alHeavy metal toxicity：Ind

25、ustrial effluent effects on groundnut seedlingsJJournal of Applied Sciences Research，2008，4(1)：110-121.10 Nakano Y，Asada KHydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplastsJPlant and Cell Physiology，1981，22(5):867-88011 Schaedle M，Bassham JAChloroplast glutathion

26、e reductaseJPlant Physiology1977，59(5):1011-101212 Bradford MMA rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye bindingJAnalytical biochemistry，1976，72：248-25413 杜琳，張荃植物谷胱甘肽與抗氧化脅迫J山東科學(xué)，2008.04,21（2）:27-3214 CHEW O。WHELAN J，MIL

27、LARAHMolecular Definition of the Ascorbate-Glutathione Cycle in Arabidopsis Mitochondria Reveals Dual Targeting of Antioxidant Defenses in PlantsJThe Journal Of Biological Chemistry，2003，278(47)：46869-4687715 Hu LX, Li HY, Pang HC, Fu JM. Responses of antioxidant gene, protein and enzymes to salinit

28、y stress in two geno-types of perennial ryegrass (Lolium perenne) differing in salt tolerance. J Plant Physiol, 2012, 169(2): 146156.16 Israr M，Jewell A，Kumar D，et alInteractive effects of lead，copper，nickel and zinc on growth，metal uptake and antioxidative metabolism of Sesbania drummondiiJJournal of Hazardous Materials，201