westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)及常見問題探討-珍藏版

1、western blot技術(shù)技術(shù) 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 周文杰周文杰 Western Blot即即蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡免疫印跡試驗(yàn)試驗(yàn))，它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。 蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認(rèn)為是美國斯坦蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者一般認(rèn)為是美國斯坦福大學(xué)的喬治福大學(xué)的喬治斯塔克斯塔克(George Stark)。在尼。在尼爾爾伯奈特伯奈特(Neal Burnette)于于1981年所著的年所著的分析生物化學(xué)分析生物化學(xué)(Analytical Biochemistry)中首次被稱為中首次被稱為W

2、estern Blot。 通過電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固通過電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質(zhì)進(jìn)行檢測。針，對靶物質(zhì)進(jìn)行檢測。p 高分辨率的電泳技術(shù)高分辨率的電泳技術(shù)p 特異敏感的抗原特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)抗體反應(yīng)p 1-5ng中等大小的靶蛋白中等大小的靶蛋白q目的蛋目的蛋白的表達(dá)白的表達(dá)特性分析特性分析1q目的蛋白目的蛋白與其它蛋白與其它蛋白的互作的互作2q目的蛋白目的蛋白的組織定位的組織定位3q目的蛋目的蛋白的表達(dá)白的表達(dá)量分析量分析4l蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備SDS-PAGESDS-PAGE轉(zhuǎn)膜

3、轉(zhuǎn)膜封閉封閉一抗雜交一抗雜交二抗雜交二抗雜交底物顯色底物顯色水溶液提取法水溶液提取法 針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑 。有機(jī)溶劑提取法有機(jī)溶劑提取法 對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Lowry法（法（Folin-酚試劑法

4、）、酚試劑法）、Bradford法法（考馬斯亮藍(lán)法）、（考馬斯亮藍(lán)法）、 BCA法等。但各有優(yōu)缺法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn)，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白點(diǎn)，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。 2SDS-PAGE上樣緩沖液：上樣緩沖液：100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS0.2%溴酚蘭溴酚蘭20%甘油甘油ddH2ODTT可臨用前以可臨用前以1：4比例混合加入，亦可全部比例混合加入，亦可全部配好分裝，配好分裝，-20凍存。按凍存。按1:1比例與蛋白質(zhì)樣比例與蛋白質(zhì)樣品混合，品混合，9

5、5100加熱加熱515min，冰上冷卻，冰上冷卻后再上樣，上樣量一般為后再上樣，上樣量一般為20-25l，總蛋白量，總蛋白量2050g。SDS-PAGE 是在蛋白質(zhì)樣品中加入是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含和含有巰基乙醇的樣品處理液，有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強(qiáng)是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，級結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇（或二硫蘇糖醇，DTT）可以斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。）可以斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。使蛋

6、白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。SDS-PAGE基本原理基本原理解聚后的側(cè)鏈與解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對分子質(zhì)量，而與其所帶要決定于亞基的相對分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)。電荷的性質(zhì)無關(guān)。M丙烯酰胺丙

7、烯酰胺和和N,N-亞亞甲雙丙烯酰甲雙丙烯酰胺胺 1MSDS2M配膠的配膠的Tris緩沖液緩沖液3MTEMED4M過硫酸銨過硫酸銨5MTris-甘甘氨酸電泳氨酸電泳緩沖液緩沖液6灌制分離膠灌制分離膠 隔絕空氣隔絕空氣灌好后一般室溫放置灌好后一般室溫放置3040分鐘分鐘灌制積層膠灌制積層膠 插入梳子插入梳子 上樣上樣 Staking gelSeparating gel過硫酸銨一般現(xiàn)配現(xiàn)用，如連續(xù)實(shí)驗(yàn)可在過硫酸銨一般現(xiàn)配現(xiàn)用，如連續(xù)實(shí)驗(yàn)可在4度度放置放置23天。配制天。配制30丙烯酰胺儲存液要過丙烯酰胺儲存液要過濾。濾。配制過程中每加入一種試劑要充分混勻，防配制過程中每加入一種試劑要充分混勻，防止膠

8、出現(xiàn)濃度不均的情況。止膠出現(xiàn)濃度不均的情況。要根據(jù)溫度調(diào)整要根據(jù)溫度調(diào)整TEMED的使用量。的使用量。水封的時候水要慢慢加入，太快會導(dǎo)致膠面水封的時候水要慢慢加入，太快會導(dǎo)致膠面不平。不平。插梳子的時候要用力均勻，一次成型。插梳子的時候要用力均勻，一次成型。在上樣前可在上樣前可20V恒壓預(yù)電泳恒壓預(yù)電泳20分鐘，可去分鐘，可去除泳道中的雜質(zhì)。除泳道中的雜質(zhì)。要將電泳后分離的要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（例移到固相載體（例如如NC膜）上，通常膜）上，通常有兩種方法：毛細(xì)有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印管印跡法和電泳印跡法。跡法。1常用的電泳轉(zhuǎn)移方常用的電泳轉(zhuǎn)移方法

9、有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相兩者的原理完全相同，只是用于固定同，只是用于固定膠膠/膜疊層和施加電膜疊層和施加電場的機(jī)械裝置不同。場的機(jī)械裝置不同。 2濕轉(zhuǎn)系統(tǒng) 濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠濕轉(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。另外用這種方法轉(zhuǎn)移雙向電泳中常規(guī)使用的大另外用這種方法轉(zhuǎn)移雙向電泳中常規(guī)使用的大膠比較困難。膠比較困難。濕轉(zhuǎn)操作步驟：濕轉(zhuǎn)操作步驟：1.起膠：將凝膠從玻璃板中取出，切除積起膠：將凝膠從

10、玻璃板中取出，切除積層膠及溴酚藍(lán)下部的分離膠，剩下的含有層膠及溴酚藍(lán)下部的分離膠，剩下的含有目的蛋白的分離膠浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，目的蛋白的分離膠浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，防止膠凝固、變形。防止膠凝固、變形。2.潤濕：準(zhǔn)備潤濕：準(zhǔn)備2張張Whatman 3#濾紙、濾紙、1張張NC膜，膜，尺寸與凝膠大小相仿（濾紙與膠一樣大，膜比尺寸與凝膠大小相仿（濾紙與膠一樣大，膜比膠大一些），膠大一些）， NC膜先放入水中膜先放入水中3分鐘，再放入分鐘，再放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中轉(zhuǎn)膜緩沖液中10分鐘。（若用分鐘。（若用PVDF膜，應(yīng)先膜，應(yīng)先在在100%甲醇中浸泡，否則很難潤濕。甲醇可反甲醇中浸泡，否則很難潤濕。甲醇可反復(fù)利

11、用。）復(fù)利用。）3.三明治的制作：按順序在轉(zhuǎn)移夾內(nèi)放置預(yù)先三明治的制作：按順序在轉(zhuǎn)移夾內(nèi)放置預(yù)先經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡的海綿、經(jīng)轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡的海綿、1層層Whatman 3#濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、1層層Whatman 3#濾紙、海綿，保證每層之間沒有氣泡。濾紙、海綿，保證每層之間沒有氣泡。 組裝順序：轉(zhuǎn)膜夾黑色面（負(fù)極）海綿墊組裝順序：轉(zhuǎn)膜夾黑色面（負(fù)極）海綿墊濾紙膠濾紙膠 膜濾紙海綿墊紅色面（正膜濾紙海綿墊紅色面（正極）極） 切記：每層之間用滴管切記：每層之間用滴管/玻棒將其中的氣泡全玻棒將其中的氣泡全部趕出，絕不允許氣泡存在！部趕出，絕不允許氣泡存在！ 4.轉(zhuǎn)膜：

12、將轉(zhuǎn)移夾放入轉(zhuǎn)移槽，加入轉(zhuǎn)膜：將轉(zhuǎn)移夾放入轉(zhuǎn)移槽，加入4 預(yù)冷預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，將凝膠面與負(fù)極相連，硝酸的轉(zhuǎn)膜緩沖液，將凝膠面與負(fù)極相連，硝酸纖維素膜與正極相連。纖維素膜與正極相連。轉(zhuǎn)膜電流和時間轉(zhuǎn)膜電流和時間: 一般轉(zhuǎn)膜的電流在一般轉(zhuǎn)膜的電流在200mA-400mA之間，之間，轉(zhuǎn)膜時間為轉(zhuǎn)膜時間為30-60分鐘。也可以在分鐘。也可以在15-20mA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜過夜。大片段的膜過夜。大片段的50KD的可以選用的可以選用350mA,小片段的可以用小片段的可以用250mA，上述電流均能很好上述電流均能很好的把大部分蛋白轉(zhuǎn)過去。具體的轉(zhuǎn)膜時間要的把大部分蛋白轉(zhuǎn)過去。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定，

13、目的蛋白的分子根據(jù)目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。分子量越小，需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。 膠在負(fù)極，膜靠近正極；膠在負(fù)極，膜靠近正極； 轉(zhuǎn)膜緩沖液一定要事先預(yù)冷，最好提前一天轉(zhuǎn)膜緩沖液一定要事先預(yù)冷，最好提前一天 配好放配好放4 冰箱；冰箱； 濾紙不要大過膜，防止短路；濾紙不要大過膜，防止短路； 夾好膜和凝膠后，確定在凝膠夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間膜和濾紙之間 沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全；沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全； 注意一定要戴手套或用塑料鑷子接觸膜，因注意一

14、定要戴手套或用塑料鑷子接觸膜，因 為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會污為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會污 染膜；染膜； 在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時，在轉(zhuǎn)膜過程中，特別是高電流快速轉(zhuǎn)膜時， 通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜通常會有非常嚴(yán)重的發(fā)熱現(xiàn)象，最好把轉(zhuǎn)膜 槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。槽放置在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。 半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 半干轉(zhuǎn)移用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖半干轉(zhuǎn)移用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。因?yàn)殡姌O板直接與濾紙接觸，使凝膠中液槽。因?yàn)殡姌O板直接與濾紙接觸，使凝膠中電場強(qiáng)度盡可能大以快速高效轉(zhuǎn)移。與濕轉(zhuǎn)相電場強(qiáng)度盡可能大以快速高效轉(zhuǎn)移。與濕轉(zhuǎn)相比，這種方法又快又

15、好（比，這種方法又快又好（15-45 分鐘）。多數(shù)半分鐘）。多數(shù)半干轉(zhuǎn)移方法使用一種以上的緩沖系統(tǒng)，可以同干轉(zhuǎn)移方法使用一種以上的緩沖系統(tǒng)，可以同時高效轉(zhuǎn)移大小不同的蛋白。然而，半干轉(zhuǎn)移時高效轉(zhuǎn)移大小不同的蛋白。然而，半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)因緩沖液較少不適于長時間轉(zhuǎn)移。系統(tǒng)因緩沖液較少不適于長時間轉(zhuǎn)移。 半干轉(zhuǎn)操作步驟與濕轉(zhuǎn)基本類似，區(qū)別在于半干轉(zhuǎn)操作步驟與濕轉(zhuǎn)基本類似，區(qū)別在于兩邊都是兩邊都是3層層Whatman 3#濾紙，轉(zhuǎn)移電壓和時濾紙，轉(zhuǎn)移電壓和時間也有所不同。間也有所不同。 半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，濾紙和膜切成與凝膠相半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，濾紙和膜切成與凝膠相同大小很重要，這樣電流必須通過凝膠。否則，同大小

16、很重要，這樣電流必須通過凝膠。否則，在凝膠邊緣處濾紙重疊將導(dǎo)致電流短路。在凝膠邊緣處濾紙重疊將導(dǎo)致電流短路。 兩種轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中都必須注意防止在濾紙、兩種轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中都必須注意防止在濾紙、凝膠和膜之間的任何地方存在氣泡，氣泡阻礙凝膠和膜之間的任何地方存在氣泡，氣泡阻礙轉(zhuǎn)移并在印跡膜上產(chǎn)生轉(zhuǎn)移并在印跡膜上產(chǎn)生“禿斑禿斑”（即非轉(zhuǎn)移（即非轉(zhuǎn)移區(qū)）。小分子量的蛋白半干轉(zhuǎn)效果比較好，大區(qū)）。小分子量的蛋白半干轉(zhuǎn)效果比較好，大分子量（分子量（100KD以上）建議濕轉(zhuǎn)。以上）建議濕轉(zhuǎn)。 最常用于最常用于Western Blot的轉(zhuǎn)移膜主要是的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素（硝酸纖維素（Nitrocellulose，NC

17、）膜和聚）膜和聚偏二氟乙烯偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龍膜、）膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和素膜做蛋白印跡。尼龍膜和NC膜的特點(diǎn)相似膜的特點(diǎn)相似,主要用于核酸雜交。主要用于核酸雜交。膜的選擇：膜的選擇：幾種膜的對比幾種膜的對比麗春紅染色麗春紅染色 蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝蛋白帶出現(xiàn)后，于室溫用去離子水漂洗硝 酸纖維素濾膜，換水幾次。酸纖維素濾膜，換水幾次。印度墨汁染色印度墨汁染色 只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記只用于放射性標(biāo)記抗體或放射性標(biāo)記A蛋蛋 白探針的白探針的Western印跡過程

18、。印跡過程。 轉(zhuǎn)膜后檢測（此步可以省略）轉(zhuǎn)膜后檢測（此步可以省略） 轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的備好的TBST（或（或PBST）中漂洗）中漂洗1-2分鐘，以分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。 從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。背景。 轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2條帶較難全條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以

19、用麗春紅染色部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也液對膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAGE膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。況。 印度墨汁不能和化學(xué)發(fā)光物合用，若是印度墨汁不能和化學(xué)發(fā)光物合用，若是使用呈色反應(yīng)的酶檢測法時，印度墨汁的黑使用呈色反應(yīng)的酶檢測法時，印度墨汁的黑色會使凝膠難于拍照。這時，可改用其他檢色會使凝膠難于拍照。這時，可改用其他檢測方法或換用麗春紅染色。測方法或換用麗春紅染色。 轉(zhuǎn)膜后檢測，多用麗春紅染色，可見多轉(zhuǎn)

20、膜后檢測，多用麗春紅染色，可見多條粉紅色條帶。條粉紅色條帶。 按照所檢測蛋白分子量大小切下膜條，按照所檢測蛋白分子量大小切下膜條，做好標(biāo)記。做好標(biāo)記。S為避免作為檢測試為避免作為檢測試劑的特異性第一抗體劑的特異性第一抗體與膜發(fā)生非特異性結(jié)與膜發(fā)生非特異性結(jié)合，使非特異性背景合，使非特異性背景提高，需對膜上的潛提高，需對膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行封閉處理。處理。1S5%脫脂奶粉或脫脂奶粉或BSA（室溫孵育（室溫孵育1h）24 封閉封閉SWestern Blot 膜膜封閉液（生物試劑封閉液（生物試劑公司）公司）3STween-20的作用：的作用：減少非特異性吸附，減少非特異性吸附，不

21、影響抗體與抗原不影響抗體與抗原的結(jié)合。的結(jié)合。4 雜交膜上有很多非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，雜交膜上有很多非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，為防止這些位點(diǎn)與抗體結(jié)合引起非特異的染色和為防止這些位點(diǎn)與抗體結(jié)合引起非特異的染色和背景，一般用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜背景，一般用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)來降低抗體的非特異性結(jié)合。封上的未結(jié)合位點(diǎn)來降低抗體的非特異性結(jié)合。封閉劑應(yīng)該封閉所有未結(jié)合位點(diǎn)而不替換膜上的靶閉劑應(yīng)該封閉所有未結(jié)合位點(diǎn)而不替換膜上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白的表位，也不與抗體或檢測蛋白、不結(jié)合靶蛋白的表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應(yīng)。試劑有交叉反應(yīng)。 常用的封閉試劑有

22、常用的封閉試劑有 5%的的 BSA 或者脫脂奶或者脫脂奶粉，緩沖液一般選擇粉，緩沖液一般選擇 PBST 或者或者TBST。將膜從。將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或或TBST稍加稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩1小時。必要時小時。必要時可先用麗春紅染色（可先用麗春紅染色（2%乙酸，乙酸，0.5%麗春紅的水麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TBST將將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略則可省略此步。此步。 一般封閉條件為：室溫或者一般封閉條件為：室溫或者 3

23、7緩慢搖蕩緩慢搖蕩12h，特殊情況也可，特殊情況也可 4過夜，根據(jù)結(jié)果情況過夜，根據(jù)結(jié)果情況調(diào)整封閉試劑的濃度和類型。比如有時調(diào)整封閉試劑的濃度和類型。比如有時 BSA 比比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。封閉完成后要進(jìn)行洗膜，以去除膜上未結(jié)合景。封閉完成后要進(jìn)行洗膜，以去除膜上未結(jié)合的封閉試劑。洗滌液使用的封閉試劑。洗滌液使用TBST 或者或者PBST。 把把NC膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據(jù)膜面積以據(jù)膜面積以0.1m

24、L/cm2的量加入一抗溶液，搖床的量加入一抗溶液，搖床上平緩搖動，于室溫孵育上平緩搖動，于室溫孵育1-2小時或小時或4過夜。回過夜?；厥找豢谷芤?，用收一抗溶液，用TBST漂洗膜漂洗膜3次，每次次，每次10min。加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，于加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動，于室溫孵育室溫孵育1-2小時或小時或4過夜。過夜。 5 一抗、二抗孵育一抗、二抗孵育 如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時間并增加洗滌次數(shù)。同時短時間多次的洗膜（如增加洗滌次數(shù)。同時短時間多次的洗膜（如 5-6次，每次次，每次 3分鐘）比長時間少次數(shù)的洗膜更有效。分鐘）

25、比長時間少次數(shù)的洗膜更有效。 一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇最適當(dāng)?shù)谋壤豢苟沟倪x擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)最適當(dāng)?shù)谋壤?，一抗二抗的選擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及背景的深淺。要嚴(yán)格保證反應(yīng)時間，洗膜果以及背景的深淺。要嚴(yán)格保證反應(yīng)時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；還要注意一抗二抗的匹配。景；還要注意一抗二抗的匹配。 辣根過氧化物酶法（辣根過氧化物酶法（HRP） 堿性磷酸酶法（堿性磷酸酶法（AP） 化學(xué)發(fā)光顯色法化學(xué)發(fā)光顯色法(HRP)6 反應(yīng)顯色反應(yīng)顯色 暗室操作！暗室操作！A液液B液液11:

26、 膜混合混合ECL工作工作液液滴加滴加ECL工作工作液液 顯影、定影顯影、定影 在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。堿性磷酸酶可以將無色的或辣根過氧化物酶。堿性磷酸酶可以將無色的底物底物5-溴溴-4-氯吲哚磷酸鹽氯吲哚磷酸鹽(BCIP)轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；而辣根過氧化物酶可以以產(chǎn)物；而辣根過氧化物酶可以以H2O2為底物，為底物，將將3-氨基氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)⒁一沁蜓趸珊稚a(chǎn)物或?qū)?-氯氯萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。 另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強(qiáng)另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)

27、光法，辣根過氧化物酶在化學(xué)發(fā)光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾(luminol，氨基苯二酰，氨基苯二酰一肼一肼)并發(fā)光，在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以并發(fā)光，在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以增大增大1000倍，通過將印跡放在照相底片上感光倍，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。 HRP標(biāo)記二抗用標(biāo)記二抗用DAB顯色，按順序依次將顯色，按順序依次將DAB三種劑各取三種劑各取3滴于滴于5ml蒸餾水中，避光混蒸餾水中，避光混勻，將膜加入顯色液中避光顯色勻，將膜加入顯色液中避光顯色5-15min終

28、止終止反應(yīng)，對照反應(yīng)，對照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將NC膜晾膜晾干掃描保存；干掃描保存； AKP標(biāo)記二抗用標(biāo)記二抗用AP顯色，在顯色，在10mlAKP緩沖緩沖液中加入液中加入66µ；lNBT溶液和溶液和33µ；lBCIP溶液混勻，室溫下將膜放入顯色（溶液混勻，室溫下將膜放入顯色（37可可加速反應(yīng)）加速反應(yīng)）5-15min。對照。對照Marker記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將果，將NC膜晾干掃描保存。膜晾干掃描保存。底物發(fā)光法：將兩種顯色底物底物發(fā)光法：將兩種顯色底物1：1等體積混等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻

29、璃膠片把膜包起來，馬上在暗室中將把膜包起來，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜光片覆蓋在膜的上面（時間根據(jù)光的亮度來衡量），顯影、的上面（時間根據(jù)光的亮度來衡量），顯影、定影。（熒光在一段時間后會越來越弱，要控定影。（熒光在一段時間后會越來越弱，要控制好時間）制好時間） 除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，比如：熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的二抗（可劑，比如：熒光素異硫氰酸鹽標(biāo)記的二抗（可通過紫外燈產(chǎn)生熒光）；生物素結(jié)合的二抗等通過紫外燈產(chǎn)生熒光）；生物素結(jié)合的二抗等等。等。 p通過加熱和去污劑進(jìn)行解吸通過加熱和去污劑進(jìn)行解吸 原理：組合使用去污劑和加熱使

30、抗體解離，適原理：組合使用去污劑和加熱使抗體解離，適 用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。用于任何化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。p酸解吸酸解吸 原理：使用低原理：使用低pH改變抗體結(jié)構(gòu)從而使結(jié)合位點(diǎn)改變抗體結(jié)構(gòu)從而使結(jié)合位點(diǎn) 失活，從而將抗體與抗原分離，適用于任何化失活，從而將抗體與抗原分離，適用于任何化 學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)。膜解吸方法（膜的重復(fù)利用）膜解吸方法（膜的重復(fù)利用） 膜的重復(fù)利用膜的重復(fù)利用 如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用Western一抗二抗去除液處理蛋白膜，以重復(fù)一抗二抗去除液處理蛋白膜，以重復(fù)利用蛋白膜。利用蛋白膜。 兩種方法都不能去除由顯色檢測系統(tǒng)產(chǎn)生的

31、兩種方法都不能去除由顯色檢測系統(tǒng)產(chǎn)生的有色沉淀物（例如有色沉淀物（例如BCIP、4-CN、DAB和和TMB）。然而，仍可以用針對不同靶蛋白的特）。然而，仍可以用針對不同靶蛋白的特異性抗體分析印跡膜。異性抗體分析印跡膜。 在各次免疫檢測之間不應(yīng)使印跡膜干燥，印在各次免疫檢測之間不應(yīng)使印跡膜干燥，印跡膜干燥將會使任何剩余抗體與膜永久性結(jié)合。跡膜干燥將會使任何剩余抗體與膜永久性結(jié)合。 通過加熱和去污劑進(jìn)行解吸。通過加熱和去污劑進(jìn)行解吸。儀器和溶液：儀器和溶液：解吸液：解吸液：100mM 2-巰基乙醇，巰基乙醇，2%（w/v）SDS，62.5 mM Tris-HCl，pH6.7；磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩

32、沖液（PBS）：）：10mM 磷酸鈉，磷酸鈉，pH7.2，0.9%（w/v）NaCl；淺托盤，大小足以將膜放入其中。淺托盤，大小足以將膜放入其中。操作：操作：1. 在通風(fēng)櫥中，將印跡膜放入解吸液中在在通風(fēng)櫥中，將印跡膜放入解吸液中在50下下振搖振搖30分鐘。分鐘。2. 將印跡膜放入緩沖液中振搖將印跡膜放入緩沖液中振搖10分鐘。用新緩沖分鐘。用新緩沖液重復(fù)漂洗兩次。液重復(fù)漂洗兩次。3. （可選）重復(fù)起始檢測方法（忽略一抗步驟），（可選）重復(fù)起始檢測方法（忽略一抗步驟），確保已滅活抗體或已從膜上解吸抗體。確保已滅活抗體或已從膜上解吸抗體。4. 將印跡膜放入緩沖液中振搖將印跡膜放入緩沖液中振搖10分

33、鐘。分鐘。5. 繼續(xù)下一輪檢測的封閉步驟。繼續(xù)下一輪檢測的封閉步驟。酸解吸：酸解吸：儀器和溶液：儀器和溶液：解吸液：解吸液：25mM 甘氨酸甘氨酸- HCl，1%（w/v）SDS；pH2，磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽緩沖液（PBS）：）：10mM 磷酸鈉，磷酸鈉，pH7.2，0.9%（w/v）NaCl。淺托盤，大小足以將膜放入其中。淺托盤，大小足以將膜放入其中。操作：操作：1. 將印跡膜放入解吸液中振搖將印跡膜放入解吸液中振搖30分鐘。分鐘。2. 將印跡膜放入緩沖液中振搖將印跡膜放入緩沖液中振搖10分鐘。用新緩沖分鐘。用新緩沖液重復(fù)漂洗。液重復(fù)漂洗。3. 繼續(xù)下一輪檢測的封閉步驟。繼續(xù)下一輪檢測的封閉

34、步驟。目的蛋白的灰度值目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差，所得以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。目的蛋白相對含量。1Western Blot結(jié)果結(jié)果分析軟件分析軟件Gel-Pro Analyzer 4 綠色版綠色版（附動畫演示教程）（附動畫演示教程）http:/ 2Western Blot結(jié)果分析結(jié)果分析 內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在

35、檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。 在在Western Blot中使用內(nèi)參其實(shí)就是在過程中使用內(nèi)參其實(shí)就是在過程中另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測中另外用內(nèi)參對應(yīng)的抗體檢測內(nèi)參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參目的產(chǎn)物的同時可以檢測內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，借助檢測每在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，借助檢測每個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正蛋白質(zhì)定量，上個樣品內(nèi)參的量就可以用于校正蛋白質(zhì)定量，上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外使用內(nèi)參可以作為空

36、白對照，檢測蛋白性。此外使用內(nèi)參可以作為空白對照，檢測蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者顯色或者發(fā)光體系是否正常。發(fā)光體系是否正常。 常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH和細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或或beta-tubulin。一般要選擇一個在處。一般要選擇一個在處理因素作用的條件下蛋白含量不會發(fā)生改變的蛋理因素作用的條件下蛋白含量不會發(fā)生改變的蛋白作內(nèi)參。白作內(nèi)參。 為了讓實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)有說服力都要設(shè)計對照實(shí)為了讓實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)有說服力都要設(shè)計對照實(shí)驗(yàn)，對照分為：陽性對照（最好有標(biāo)準(zhǔn)品（比如驗(yàn)，對照分為：陽性對照（最好有

37、標(biāo)準(zhǔn)品（比如-actin，GAPDH）或陽性血清）；陰性對照）或陽性血清）；陰性對照（測血時用相應(yīng)小鼠未免疫血清（即正常血）；（測血時用相應(yīng)小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對照（不加一抗，用空白對照（不加一抗，用PBS代替）；無關(guān)對照代替）；無關(guān)對照（用無關(guān)抗體）。（用無關(guān)抗體）。 成功進(jìn)行成功進(jìn)行 Western Blot 檢測，設(shè)置合適正確檢測，設(shè)置合適正確的對照是必不可少的，只要正確設(shè)置了這些對的對照是必不可少的，只要正確設(shè)置了這些對照，即可快速和準(zhǔn)確的找到照，即可快速和準(zhǔn)確的找到 Western Blot 的問的問題所在，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性！題所在，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性！一般需要設(shè)置的對照如下：一般需要設(shè)置的對照如下：陽性對照：明確表達(dá)檢測蛋白的組織或細(xì)胞，用陽性對照：明確表達(dá)檢測蛋