第四章 目的基因的制取

1、第四章第四章 目的基因的制取目的基因的制取 山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程原理目的基因目的基因的克隆戰(zhàn)略 n一類是構(gòu)建感興趣的生物個(gè)體的基因文庫(kù)，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫(kù)中挑出含有目的基因的重組克?。籲另一類是利用PCR擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。第四章第四章 目的基因的制取目的基因的制取n一 目的基因制取的基本策略n二 文庫(kù)法n三 化學(xué)合成法n四 PCR法一、目的基因制取的基本策略一、目的基因制取的基本策略1.選擇含目的基因的實(shí)驗(yàn)材料選擇含目的基因的實(shí)驗(yàn)材料n染色體DNAn由mRNA反轉(zhuǎn)錄而得到的cDNA2.選擇合

2、適的方法制備選擇合適的方法制備DNA片段并克隆到分片段并克隆到分子克隆載體子克隆載體3.人工構(gòu)建的重組體向寄主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移人工構(gòu)建的重組體向寄主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移4.選擇合適方法篩選目的基因選擇合適方法篩選目的基因mRNA組織載體（選擇一種載體）cDNADNA部分或完全消化DNA片段的電泳分離待克隆的DNA外源同載體分子連接D N A重組導(dǎo)入大腸桿菌（體外包裝或轉(zhuǎn)化）D N A基因庫(kù)的鑒定陽(yáng)性克隆的篩選擴(kuò)增長(zhǎng)期儲(chǔ)藏真核基因克隆的基本步驟二二 文庫(kù)法制取目的基因文庫(kù)法制取目的基因 n隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段或片段或cDNA片段，然后通過(guò)快速有效的篩選程序片段，然后

3、通過(guò)快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。重組子，進(jìn)而獲得目的基因。1.染色體染色體DNA的切斷的切斷n超聲波處理：片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端。 n全酶切：片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開(kāi)，大小不可控 DNA的限制酶切的限制酶切 基因組基因組DNA的片段化的片段化 a.不同的限制酶酶切基因組產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的片段Four-base enzymeSix-base enzymeEight-base enzymeb. 不同的限制酶酶切同一個(gè)基因組產(chǎn)生不同數(shù)目的DNA片段限制酶切位點(diǎn)限制酶切位點(diǎn)限制

4、酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫(kù)基因文庫(kù)載體載體DNA的酶切：的酶切：1. 載體DNA用相應(yīng)的限制酶酶切2. 載體DNA的脫磷酸化反應(yīng) CTTAAPPAATTCGOHHOGCTTAAPGOHPAATTCHOGCTTAAPPAATTCGOHHOG

5、CTTAAOHGOHHOAATTCHOGn去除載體DNA片段的5-末端磷酸基。防止線狀DNA自身環(huán)化(self ligation)。n與在不同的分子上的兩個(gè)粘性末端相比較而言，同一個(gè)分子上的粘性末端更容易配對(duì)，因此載體自身環(huán)化的可能性最大。n用磷酸酶（如CIP，小牛腸內(nèi)磷酸酶）去掉載體上的磷酸基團(tuán)。 DNA連接酶需要在連接位點(diǎn)上有一個(gè)5端的磷酸基。n必須在連接反應(yīng)之前去掉磷酸酶，否則它也會(huì)把要插入的DNA的磷酸基團(tuán)去掉，這造成連接失敗！凝膠純化不會(huì)把載體與磷酸酶分開(kāi)，切出來(lái)的凝膠帶中總會(huì)有一些磷酸酶。n加熱滅活磷酸酶。小牛腸內(nèi)磷酸酶（CIP）加熱反應(yīng)物到65度并保持10分鐘。 n脫磷酸化后連接

6、的產(chǎn)物將會(huì)怎樣？n產(chǎn)物將留下一個(gè)切口，如果質(zhì)粒進(jìn)入了細(xì)菌的話，細(xì)菌能夠修復(fù)這個(gè)切口。CTTAAPPAATTCGOHHOGCTTAAPGOHPAATTCHOGCTTAAPPAATTCGOHHOGCTTAAOHGOHHOAATTCHOGn為什么不選擇把插入物去磷酸化？ n載體會(huì)環(huán)化并將會(huì)給我們帶來(lái)一些不含插入物的且有氨芐抗性的轉(zhuǎn)化子。 n一個(gè)自身環(huán)化的插入物不會(huì)帶來(lái)麻煩。因?yàn)樗粫?huì)產(chǎn)生氨芐抗性，而那些在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得環(huán)化DNA的菌株將無(wú)法在氨芐平板上生長(zhǎng)。2.片段與載體的連接形成重組片段與載體的連接形成重組DNA分子分子 n相容性末端直接連接n不匹配末端的連接非互補(bǔ)粘性末端DNA分子間的連接n在一

7、定的反應(yīng)條件下，用T4 DNA連接酶仍然可以將平末端的DNA片段連接起來(lái)。n具有非互補(bǔ)粘性末端的兩種DNA片段之間，經(jīng)過(guò)作用于單鏈DNA的S1核酸酶處理變成平末端之后，一樣也可以使用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。 外源DNA片段定向插入載體分子n用兩種不同的限制酶同時(shí)消化一種特定的DNA分子，將會(huì)產(chǎn)生出具有兩種不同粘性末端的DNA片段。n如果載體分子和待克隆的DNA分子，都是用同一對(duì)核酸內(nèi)切限制酶切割，那么載體分子和外源DNA片段將按一種取向退火形成重組DNA分子 。外源DNA片段同載體分子的重組 n考慮到下列三個(gè)因素：考慮到下列三個(gè)因素：n實(shí)驗(yàn)步驟要盡可能簡(jiǎn)單易行；實(shí)驗(yàn)步驟要盡可能簡(jiǎn)單易行；n連

8、接形成的連接形成的“接點(diǎn)接點(diǎn)”序列，應(yīng)能被一定的核酸內(nèi)序列，應(yīng)能被一定的核酸內(nèi)切限制酶重新切割，以便回收插入的外源切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；片段；n對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不發(fā)生干擾。對(duì)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不發(fā)生干擾。3.重組重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞分子導(dǎo)入受體細(xì)胞n如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細(xì)胞；n如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞。4.篩選含有目的基因的目的重組子篩選含有目的基因的目的重組子n利用遺傳標(biāo)記基因鑒定重組DNAn菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法（篩選模

9、型的建立） 操作的改進(jìn)n使用特征性限制性內(nèi)切酶切開(kāi)染色體使用特征性限制性內(nèi)切酶切開(kāi)染色體DNA n使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。n在連接前將在連接前將DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離片段進(jìn)行分級(jí)分離 n例如，已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開(kāi)，瓊脂糖凝膠電泳分離，切下相當(dāng)于1.6 - 2.0 kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，回收，與載體進(jìn)行拼接n凝膠凝膠DNA片段回收技術(shù)片段回收技術(shù) （二）cDNA文庫(kù)n利用純化的總mRNA在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成互補(bǔ)的DNA即cDNA，再按上述構(gòu)建基因文庫(kù)的類似方法對(duì)cDNA片段進(jìn)行克隆，由此獲得的克隆總稱為“cD

10、NA”文庫(kù)文庫(kù)。n若提取的是某種特異的mRNA，而非總的mRNA，則由此構(gòu)成的克隆即為相應(yīng)于該種相應(yīng)于該種特異基因的特異基因的cDNA克隆克隆。 cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)文庫(kù)的特點(diǎn)1. 基因特異性基因特異性 來(lái)自結(jié)構(gòu)基因，僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表正在表達(dá)的基因的遺傳信息2. 器官特異性器官特異性 不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)就具有器官特異性，故由不同器官提取的mRNA所組建的cDNA文庫(kù)也就不同。3. 代謝或發(fā)育特異性代謝或發(fā)育特異性 處于不同代謝階段（或發(fā)育階段）的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)亦不相同。 4. 不均勻性不均勻性 在同一個(gè)cDNA文庫(kù)中，不同類型的cDNA分子

11、的數(shù)目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的。構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟（1）總RNA（total RNA）提取 提取總RNA有商業(yè)化的試劑盒（kit）。 （2）mRNA的分離純化 原理 利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。 mRNA只占總RNA的1%-2%。 mRNA的分離純化 Column（柱） 分離mRNA用商業(yè)化的Oligo dT纖維柱。 RNA酶的降解RNA分子不穩(wěn)定RNA易遭降解由于核糖環(huán)上的2OH促使對(duì)磷酸二酯鍵的親水性攻擊。RNA分子結(jié)構(gòu)分子結(jié)構(gòu)RNA抽提抽提 異硫氰酸胍法異硫氰酸胍法：可裂解細(xì)胞，使RNA與蛋

12、白質(zhì)分離，將RNA釋放到溶液中。加入苯酚、氯仿，可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開(kāi)。水相層（無(wú)色）為RNA，有機(jī)層（黃色）為DNA和蛋白質(zhì)動(dòng)植物總RNA提取-Trizol法 n用 Trizol法提取的總RNA絕無(wú)蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。n Trizol試劑：含有苯酚、8羥基喹啉、異硫氰酸胍、-巰基乙醇等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞并抑制核酸酶。能保持RNA的完整性。mRNA的分離純化的分離純化nmRNA只占總只占總RNA的的1%-

13、5%。n原理：原理：利用利用mRNA都含有一段都含有一段polyA尾巴，將尾巴，將mRNA從總從總RNA中分離純化。中分離純化。n方法：方法： 寡聚（寡聚（dT）-纖維素柱層析法。纖維素柱層析法。mRNA純化2、cDNA合成合成ncDNA的合成包括第一鏈和第二鏈的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。的合成。n第一鏈第一鏈cDNA的合成是的合成是以以mRNA為模板為模板，反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄為為cDNA，有，有反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成催化，該酶合成DNA時(shí)需時(shí)需要引物引導(dǎo)，常用引物是要引物引導(dǎo)，常用引物是oligo dT。n第二鏈合成是以第二鏈合成是以第一鏈為模板第一鏈為模板，由，由DNA聚合

14、酶聚合酶催催化?；?。cDNA的第一鏈合成的第一鏈合成n反轉(zhuǎn)錄：反轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，合成DNA。與通常轉(zhuǎn)錄過(guò)程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反。n禽類成髓細(xì)胞瘤病毒（禽類成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV)的反轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄酶 一類能引起鳥(niǎo)類等動(dòng)物白血病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。其反轉(zhuǎn)錄酶由一個(gè)亞基和一個(gè)亞基組成，有二種酶活力。1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力。2）RNaseH酶活力，水解RNA-DNA雜種分子中的RNA，可沿35和53兩個(gè)方向起外切酶作用。 引物引物1、Oligo dT引物引物2、隨機(jī)引物（六聚體寡核苷酸）、隨機(jī)引物（六聚體寡核苷酸） 這種非特異性引物可沿著這種非特異性引物可沿著

15、mRNA多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合3、特異性引物。、特異性引物。反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTT在總的在總的RNA中可作為具有中可作為具有mRNA的特異的特異引物引物文庫(kù)不能完全文庫(kù)不能完全包含基因編碼包含基因編碼序列序列產(chǎn)生一個(gè)大的產(chǎn)生一個(gè)大的具有特定序列具有特定序列的的 cDNA文庫(kù)文庫(kù)cDNA產(chǎn)物可能產(chǎn)物可能是小的，不具有是小的，不具有多聚腺苷的模板多聚腺苷的模板也可被利用也可被利用可產(chǎn)生大量特可產(chǎn)生大量特定基因的定基因的cDNA文庫(kù)文庫(kù)產(chǎn)生的產(chǎn)生的cDNA文庫(kù)應(yīng)用范圍文庫(kù)應(yīng)用范圍有限有限第二鏈合成第二鏈合成n剩下的剩下的cDNA單鏈的單鏈的3末端可

16、能形成一個(gè)末端可能形成一個(gè)彎回來(lái)的彎回來(lái)的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈第一鏈5 cDNA第二鏈合成第二鏈合成DNA聚合酶聚合酶cDNA第一鏈第一鏈cDNA第二鏈第二鏈5 3 n用用核酸酶核酸酶S1S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致cDNAcDNA中有用的序列被切掉）。中有用的序列被切掉）。核酸酶核酸酶S1cDNA第一鏈第一鏈cDNA第二鏈第二鏈5 3 cDNA第一鏈第一鏈cDNA第二鏈第二鏈5 3 5 3 cDNA合成缺點(diǎn)

17、：合成效率低;1% mRNA能合成cDNA。 改進(jìn)改進(jìn)nRNase H酶酶能識(shí)別能識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。，并將其降解成許多小片斷。n小片斷正好成為小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來(lái)合成岡聚合酶的引物，用來(lái)合成岡崎片斷崎片斷。nDNA聚合酶聚合酶I能除去引物并修補(bǔ)后再使用能除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連連接酶接酶連成一整條連成一整條DNA鏈。鏈。mRNAcDNA3 5 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶引物引物mRNAcDNA第一鏈第一鏈3 5 引物引物mRNAcDNA第一鏈第一鏈3 5 mRNAmRNADNA 聚合酶聚合酶DNA 聚合酶聚合酶cDNA

18、第二鏈第二鏈cDNA第一鏈第一鏈3 RNaseHDNA ligase去引物去引物cDNA末端修飾末端修飾n借助借助末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈給載體和雙鏈cDNA的的3端分別加端分別加上幾個(gè)上幾個(gè)C或或G，成為粘性末端。，成為粘性末端。n在雙鏈在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。接，轉(zhuǎn)入受體菌。接上人工接頭接上人工接頭粘性末端粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶n加人工接頭cDNA克隆載體克隆載體n如果用功能測(cè)定功能測(cè)定來(lái)篩選目的基因，可用質(zhì)粒載體來(lái)構(gòu)建cDNA的表達(dá)文庫(kù)。n如果通過(guò)分子雜交或抗體分子雜交或抗體篩選目的基因，可用噬菌

19、體載體構(gòu)建cDNA文庫(kù)。n噬菌體載體 Zap cDNA 載體載體 cDNA文庫(kù)的篩選文庫(kù)的篩選n表達(dá)分析n核酸原位雜交1、已知氨基酸序列的相關(guān)簡(jiǎn)并密碼子探針；2、純化蛋白質(zhì)的相應(yīng)抗體探針；3、差異表達(dá)的扣除cDNA探針。1、簡(jiǎn)并寡核苷酸探針、簡(jiǎn)并寡核苷酸探針n簡(jiǎn)并探針：簡(jiǎn)并探針：是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據(jù)不同生物的堿基使用偏好，減少簡(jiǎn)并性。n在探針庫(kù)探針庫(kù)中，只有一種與目的基因完全互補(bǔ)。n一般為17個(gè)核苷酸，序列相同，堿基組成不同。n雜交時(shí)借助一定濃度氯化四甲銨氯化四甲銨控制解鏈溫度（Tm)。 2、抗體探針、抗體

20、探針利用免疫學(xué)的原理，檢測(cè)克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物。 抗體鑒別陽(yáng)性克隆抗體鑒別陽(yáng)性克隆n用專門(mén)設(shè)計(jì)的表達(dá)載體，將真核基因編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，通過(guò)免疫化學(xué)法進(jìn)行檢測(cè)。差示雜交差示雜交n需要兩種不同的細(xì)胞群體（目的基因正常表達(dá)、目的基因不表達(dá)），分別制備兩種不同mRNA提取物，以兩種總mRNA探針（或以相應(yīng)的cDNA作探針)平行雜交，對(duì)有表達(dá)目的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆文庫(kù)進(jìn)行篩選。差別雜交的局限性： 1.雜交靈敏度低，對(duì)于低峰度的mRNA尤為明顯。 2.工作量大，重復(fù)性差，兩套平行濾膜之間的DNA保有量有差別，導(dǎo)致雜交信號(hào)不一致。DNA的化學(xué)合成的化學(xué)合成n寡核苷酸單鏈的化學(xué)合成寡

21、核苷酸單鏈的化學(xué)合成n探針的化學(xué)合成探針的化學(xué)合成n連接子和接頭的合成連接子和接頭的合成n基因的半合成基因的半合成n全長(zhǎng)基因化學(xué)合成全長(zhǎng)基因化學(xué)合成三三 化學(xué)法合成目的基因化學(xué)法合成目的基因 nDNA的化學(xué)合成法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酰胺法、氫磷酸法、寡核苷酸連接法等，現(xiàn)在常用的是固相亞磷酰胺法，使用全自動(dòng)合成儀，將一個(gè)不同的單核苷酸按照需要連接起來(lái)再經(jīng)脫保護(hù)處理、純化，獲得一個(gè)特定的DNA片段。n這種方法主要適用于已知核苷酸序列的、分子量較小的目的基因的制備。方 法n磷酸二酯法磷酸二酯法 n亞磷酸三酯法亞磷酸三酯法 n寡核苷酸連接法寡核苷酸連接法 磷酸二酯法磷酸二酯法n磷酸二酯法的基

22、本原理磷酸二酯法的基本原理：將二個(gè)分別在5-或3-末端帶有保護(hù)基的脫氧單核苷酸連接起來(lái)，形成一個(gè)帶有磷酸二酯鍵的脫氧二核苷酸。n具5保護(hù)的單核苷酸，便能夠通過(guò)它的3-OH 同另一個(gè)具有3保護(hù)的單核苷酸的5-P之間定向地形成一個(gè)二酯鍵 n一端脫保護(hù)的二核苷酸分子，如帶5保護(hù)的二核苷酸分子，又能夠同另一個(gè)帶3-保護(hù)的單核苷酸分子進(jìn)行第二次縮合反應(yīng)，形成一個(gè)三核甘酸分子。 亞磷酸三酯法亞磷酸三酯法n原理原理是將所要合成的寡聚核苷酸鏈的3-末端先以3-OH與一個(gè)不溶性載體，如多孔玻璃珠（CPG）連接，然后依次從3-5的方向?qū)⒑塑账釂误w加上去，所使用的核苷酸單體的活性官能團(tuán)都是經(jīng)過(guò)保護(hù)的 寡核苷酸連接法

23、寡核苷酸連接法n化學(xué)合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150200bp，而絕大多基因的大小超過(guò)了這個(gè)范圍，因此，需要將寡核苷酸適當(dāng)連接組裝成完整的基因。常用的基因組裝常用的基因組裝方法主要有種方法主要有種 n第一種方法是帶上5-磷酸基團(tuán)寡聚核苷酸，與相應(yīng)的互補(bǔ)寡核苷酸片段退火，形成帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段，再用T4DNA連接酶將它們彼此連接成一個(gè)完整的基團(tuán)或基團(tuán)的一個(gè)大片段。n第二種方法是將兩條具有互補(bǔ)3末端的長(zhǎng)的寡核苷酸片段彼此退火，所產(chǎn)生的單鏈DNA作為模板在大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相應(yīng)的互補(bǔ)鏈，所形成的雙鏈DNA片段，可經(jīng)處理插入適當(dāng)?shù)妮d體上。限制化學(xué)法合成基因的因素限制化學(xué)法合成基因的因素n已知序列且有應(yīng)用價(jià)值的基因很少，而植物來(lái)源的基因更少；n化學(xué)合成的寡核苷酸片段長(zhǎng)度有限，經(jīng)基因組裝才能合成較大的目的基因，而這往往使基因制備難度加大；n化學(xué)基因合成相比之下比較昂貴。 四、 PCR制備目的基因