第四章中藥制劑的含量測定

1、第四章第四章 中藥制劑的含量測定中藥制劑的含量測定第一節(jié)第一節(jié) 定量測定的目的與意義定量測定的目的與意義含量測定是中藥制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)含量測定是中藥制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)測定對象：有效成分、指標(biāo)成分、毒性成分測定對象：有效成分、指標(biāo)成分、毒性成分目的：判定藥物的優(yōu)劣，保證臨床用藥的安目的：判定藥物的優(yōu)劣，保證臨床用藥的安全、有效全、有效 注意點(diǎn)：與西藥含量測定的區(qū)別注意點(diǎn)：與西藥含量測定的區(qū)別觀點(diǎn)：指標(biāo)成分觀點(diǎn)：指標(biāo)成分 有效成分有效成分 單一成分單一成分 多指標(biāo)成分多指標(biāo)成分/ /有效成分有效成分第一節(jié)第一節(jié) 定量測定樣品的處理定量測定樣品的處理樣品處理的作用樣品處理的作用充分釋放被測

2、成分充分釋放被測成分除雜純化除雜純化富集濃縮或衍生化富集濃縮或衍生化使樣品形式、溶劑符合測定要求使樣品形式、溶劑符合測定要求一一. 樣品的粉碎樣品的粉碎樣品粉碎的目的：樣品粉碎的目的：保證所取樣品均勻且有代表性保證所取樣品均勻且有代表性較快且完全地提取被測成分較快且完全地提取被測成分粉碎設(shè)備：粉碎設(shè)備： 粉碎機(jī)、研缽、食品處理機(jī)粉碎機(jī)、研缽、食品處理機(jī) 高速勻漿機(jī)或玻璃勻漿器。高速勻漿機(jī)或玻璃勻漿器。二二. 樣品的提取樣品的提取冷浸法冷浸法適用：熱不穩(wěn)定的樣品適用：熱不穩(wěn)定的樣品方法：稱取一定量樣品置于帶塞容器內(nèi)，加入方法：稱取一定量樣品置于帶塞容器內(nèi)，加入適量溶劑（樣品量的適量溶劑（樣品量的

3、10105050倍），稱重，浸泡倍），稱重，浸泡提取，浸泡時(shí)間提取，浸泡時(shí)間12122424小時(shí)。浸泡后再稱重，小時(shí)。浸泡后再稱重，補(bǔ)足溶劑。補(bǔ)足溶劑。測定：部分測定法（等量法）測定：部分測定法（等量法） 全部測定法（總量測定法）全部測定法（總量測定法）優(yōu)點(diǎn)：操作簡單優(yōu)點(diǎn)：操作簡單缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)、費(fèi)溶劑、不易提取完全缺點(diǎn)：費(fèi)時(shí)、費(fèi)溶劑、不易提取完全 回流提取法回流提取法 適用：熱穩(wěn)定性的成分適用：熱穩(wěn)定性的成分方法：以單一溶劑或混合溶劑于水浴方法：以單一溶劑或混合溶劑于水浴/ /電電 熱套加熱回流提取熱套加熱回流提取優(yōu)點(diǎn)：提取效率比冷浸法高，提取時(shí)間短，優(yōu)點(diǎn)：提取效率比冷浸法高，提取時(shí)間短，缺點(diǎn)：

4、提取雜質(zhì)較多缺點(diǎn)：提取雜質(zhì)較多 不宜用于熱不穩(wěn)定或揮發(fā)性的成分不宜用于熱不穩(wěn)定或揮發(fā)性的成分連續(xù)回流提取法連續(xù)回流提取法 （索氏提取索氏提?。┻m用：熱穩(wěn)定性的成分適用：熱穩(wěn)定性的成分方法：樣品置索氏提取器中，用遇熱可以方法：樣品置索氏提取器中，用遇熱可以 揮發(fā)的溶劑進(jìn)行反復(fù)提取揮發(fā)的溶劑進(jìn)行反復(fù)提取優(yōu)點(diǎn)：提取效率高，所需溶劑少優(yōu)點(diǎn)：提取效率高，所需溶劑少 提取雜質(zhì)少，操作簡便提取雜質(zhì)少，操作簡便 缺點(diǎn)：受熱易分解的成分不宜使用缺點(diǎn)：受熱易分解的成分不宜使用 超聲提取法超聲提取法 適用：熱穩(wěn)定性的成分適用：熱穩(wěn)定性的成分方法：方法：樣品置適當(dāng)容器中，加入提取溶劑樣品置適當(dāng)容器中，加入提取溶劑，

5、放入超聲振蕩器中提取。放入超聲振蕩器中提取。 優(yōu)點(diǎn)：提取效率高，優(yōu)點(diǎn)：提取效率高，提取速度提取速度快，操作簡便快，操作簡便注意：超聲頻率、提取時(shí)間、溫度需考察注意：超聲頻率、提取時(shí)間、溫度需考察超臨界流體提取法（超臨界流體提取法（SFESFE）適用：主要用于熱不穩(wěn)定成分或揮發(fā)性成分，適用：主要用于熱不穩(wěn)定成分或揮發(fā)性成分， 也可熱穩(wěn)定性成分也可熱穩(wěn)定性成分 主要用于主要用于非極性、弱極性非極性、弱極性化合物，化合物， 也可也可極性化合物極性化合物加入極性改性劑（甲加入極性改性劑（甲 醇、氯仿、苯），增加其溶解能力。醇、氯仿、苯），增加其溶解能力。方法：方法：超臨界流體萃取儀超臨界流體萃取儀 優(yōu)

6、點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：萃取效率高、速度快、準(zhǔn)確度高、選擇性萃取效率高、速度快、準(zhǔn)確度高、選擇性較高、節(jié)省溶劑、易于自動(dòng)化，可避免使用易燃，較高、節(jié)省溶劑、易于自動(dòng)化，可避免使用易燃，有毒的有機(jī)溶劑，有毒的有機(jī)溶劑，并并能與色譜和光譜等儀器聯(lián)用。能與色譜和光譜等儀器聯(lián)用。 二二. 樣品的分離凈化樣品的分離凈化沉淀法沉淀法 ：利用某些試劑與被測成分或雜質(zhì)生成：利用某些試劑與被測成分或雜質(zhì)生成沉淀，分離沉淀或保留溶液的精制方法沉淀，分離沉淀或保留溶液的精制方法蒸餾法蒸餾法 ：利用某些被測成分具有揮發(fā)性，采用：利用某些被測成分具有揮發(fā)性，采用蒸餾法，收集餾出液進(jìn)行含量測定；或某些成分蒸餾法，收集餾出液進(jìn)行含量測定

7、；或某些成分經(jīng)蒸餾分解成揮發(fā)性成分，利用分解產(chǎn)物（要求經(jīng)蒸餾分解成揮發(fā)性成分，利用分解產(chǎn)物（要求結(jié)構(gòu)明確）進(jìn)行測定。結(jié)構(gòu)明確）進(jìn)行測定。 最常用：水蒸氣蒸餾法最常用：水蒸氣蒸餾法 適用：適用：揮發(fā)油，小分子生物堿揮發(fā)油，小分子生物堿 優(yōu)化：蒸餾液中加入一定量無機(jī)鹽（鹽析作用），優(yōu)化：蒸餾液中加入一定量無機(jī)鹽（鹽析作用），使揮發(fā)性成分更完全地蒸餾出來使揮發(fā)性成分更完全地蒸餾出來 液一液萃取法液一液萃取法 直接萃取法直接萃取法 ：利用被測成分與干擾成分在有機(jī)溶：利用被測成分與干擾成分在有機(jī)溶劑（萃取劑）中的溶解度不同，通過多次萃取達(dá)到劑（萃取劑）中的溶解度不同，通過多次萃取達(dá)到分離凈化的目的。分離

8、凈化的目的。萃取次數(shù)：萃取次數(shù)：實(shí)驗(yàn)考察（回收率符合）實(shí)驗(yàn)考察（回收率符合）溶劑的選擇溶劑的選擇：根據(jù)被測組分疏水性的相對強(qiáng)弱：根據(jù)被測組分疏水性的相對強(qiáng)弱 選擇極性適當(dāng)?shù)娜軇┻x擇極性適當(dāng)?shù)娜軇?水相水相pHpH的控制的控制：弱酸性成分：弱酸性成分 pHKpHKa a-2-2 弱堿性成分弱堿性成分 pHPKpHPKa a+2 +2 鹽析作用鹽析作用：水相用：水相用NaClNaCl飽和，提高提取率。飽和，提高提取率。2.2.離子對萃取法離子對萃取法適用適用：高度離解的有機(jī)酸、有機(jī)堿：高度離解的有機(jī)酸、有機(jī)堿 中藥制劑分析主要用于生物堿（中藥制劑分析主要用于生物堿（B B）離子對試劑離子對試劑：常

9、為酸性染料（：常為酸性染料（InIn- -） 如：溴百里酚藍(lán)（如：溴百里酚藍(lán)（BTBBTB）和溴甲酚綠）和溴甲酚綠（BCGBCG）注意注意：水相水相pHpH值值的的控制控制 離子對試劑的選擇。離子對試劑的選擇。 色譜法色譜法最常用最常用：經(jīng)典微柱色譜（固相萃取、液經(jīng)典微柱色譜（固相萃取、液固萃?。┕梯腿。┓椒ǚ椒ǎ簩悠啡芤杭拥窖b有合適固定相的色：將樣品溶液加到裝有合適固定相的色 譜柱中，將被測成分保留于柱上，洗去譜柱中，將被測成分保留于柱上，洗去 雜質(zhì)后，再洗脫被測成分進(jìn)行測定。雜質(zhì)后，再洗脫被測成分進(jìn)行測定。 或者：使雜質(zhì)強(qiáng)烈保留于柱上，直接洗脫或者：使雜質(zhì)強(qiáng)烈保留于柱上，直接洗脫 被測成

10、分進(jìn)行測定。被測成分進(jìn)行測定。適用適用于于：總類成分的含量測定總類成分的含量測定 進(jìn)展進(jìn)展：商品商品LSELSE柱作為柱作為GCGC、HPLCHPLC的預(yù)處理柱的預(yù)處理柱LSELSE常用填料常用填料 ： 硅膠、氧化鋁等：硅膠、氧化鋁等： 傳統(tǒng)吸附劑傳統(tǒng)吸附劑 不不極性吸附作用極性吸附作用 氧化鋁氧化鋁：用于用于生物堿、苷類等生物堿、苷類等堿性、中性成分堿性、中性成分的的 測測定，定，吸附吸附酸性成分酸性成分硅膠硅膠：適合于分離適合于分離中性或酸性化合物中性或酸性化合物，強(qiáng)烈保留，強(qiáng)烈保留 堿性化合物。堿性化合物。 鍵合相硅膠：鍵合相硅膠：十八烷基鍵合相硅膠（十八烷基鍵合相硅膠（C C1818，

11、ODSODS）、 C C8 8 分分離離脂溶性雜質(zhì)或成分脂溶性雜質(zhì)或成分苯基、氰基鍵合相硅膠苯基、氰基鍵合相硅膠 分分離離水溶性雜質(zhì)或成分水溶性雜質(zhì)或成分 大孔樹脂：大孔樹脂：分為極性和非極性型分為極性和非極性型 ，D D101101最常用最常用 注意：預(yù)處理；定量時(shí)回收率注意：預(yù)處理；定量時(shí)回收率聚酰胺：聚酰胺： 氫鍵吸附氫鍵吸附常用于含常用于含phphOHOH的的黃酮黃酮類成分類成分硅藻土、纖維素：硅藻土、纖維素：親水型填料，分配作用親水型填料，分配作用 流動(dòng)相流動(dòng)相：與水不混溶的有機(jī)溶劑與水不混溶的有機(jī)溶劑 洗脫洗脫：親脂親脂性性的成分的成分離子交換樹脂：離子交換樹脂： 萃取樣品液中可離

12、解化合物萃取樣品液中可離解化合物 除去樣品中的離子，防止組分分解除去樣品中的離子，防止組分分解消化法消化法目的：目的： 重金屬檢查限量較低，有機(jī)成分重金屬檢查限量較低，有機(jī)成分 往往會(huì)嚴(yán)重干擾測定，須采用合往往會(huì)嚴(yán)重干擾測定，須采用合 適的方法破壞這些有機(jī)物適的方法破壞這些有機(jī)物常用的破壞方法：常用的破壞方法：濕法消化，干法消化濕法消化，干法消化濕法消化濕法消化硝酸硝酸高氯酸法高氯酸法 適用于血，尿、組織等生物樣品和適用于血，尿、組織等生物樣品和動(dòng)植物藥制劑的破壞動(dòng)植物藥制劑的破壞有機(jī)金屬藥物經(jīng)破壞后，得到的無機(jī)金有機(jī)金屬藥物經(jīng)破壞后，得到的無機(jī)金屬離子一般呈屬離子一般呈高價(jià)態(tài)高價(jià)態(tài)。本法本法

13、不能用于含氮雜環(huán)藥物不能用于含氮雜環(huán)藥物的破壞的破壞硝酸硝酸硫酸法硫酸法適用于大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)的破壞適用于大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)的破壞破壞得到的無機(jī)金屬離子均為破壞得到的無機(jī)金屬離子均為高價(jià)態(tài)高價(jià)態(tài)不能用于含堿土金屬有機(jī)藥物不能用于含堿土金屬有機(jī)藥物的破壞的破壞（ 不適用于與硫酸形成不溶性硫酸鹽不適用于與硫酸形成不溶性硫酸鹽的金屬離子）的金屬離子）硫酸硫酸硫酸鹽法硫酸鹽法 常用于含砷或銻有機(jī)藥物常用于含砷或銻有機(jī)藥物的破壞，破壞的破壞，破壞得到的無機(jī)金屬離子多為得到的無機(jī)金屬離子多為低價(jià)態(tài)低價(jià)態(tài)（三價(jià)三價(jià)砷或銻）。砷或銻）。 樣品中加入濃硫酸作氧化劑，樣品中加入濃硫酸作氧化劑，加入硫加入硫酸鹽提高硫酸的

14、沸點(diǎn)酸鹽提高硫酸的沸點(diǎn)，增強(qiáng)硫酸的氧化，增強(qiáng)硫酸的氧化破壞能力，且防止硫酸的分解損失。破壞能力，且防止硫酸的分解損失。其它濕法其它濕法 硝酸硝酸硫酸硫酸高氯酸法高氯酸法 硫酸硫酸氧化劑法（過氧化氫法、高錳氧化劑法（過氧化氫法、高錳酸鉀）酸鉀） 破壞后，金屬呈高價(jià)態(tài)破壞后，金屬呈高價(jià)態(tài)注意點(diǎn)注意點(diǎn)：所用儀器一般為硅玻璃或硼玻璃制成的所用儀器一般為硅玻璃或硼玻璃制成的凱氏瓶凱氏瓶所用試劑應(yīng)為優(yōu)級(jí)純所用試劑應(yīng)為優(yōu)級(jí)純水應(yīng)為去離子水或高純水水應(yīng)為去離子水或高純水按相同條件進(jìn)行空白試驗(yàn)校正按相同條件進(jìn)行空白試驗(yàn)校正操作在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行操作在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行 干法消化干法消化 將有機(jī)物灼燒灰化達(dá)到分解目的將有機(jī)

15、物灼燒灰化達(dá)到分解目的方法方法：將適量樣品置于瓷坩鍋、鎳坩鍋或：將適量樣品置于瓷坩鍋、鎳坩鍋或鉑坩堝中，常加無水鉑坩堝中，常加無水NaNa2 2COCO3 3或輕或輕質(zhì)質(zhì)MgOMgO以以助灰化。混勻后，先小火加熱，使樣品助灰化?；靹蚝?，先小火加熱，使樣品完全炭化，然后放入高溫爐中灼燒，使完全炭化，然后放入高溫爐中灼燒，使其灰化完全即可。其灰化完全即可。 適用：適用：1. 濕法不易破壞完全的有機(jī)物；濕法不易破壞完全的有機(jī)物；2. 某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物。不適用：含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）不適用：含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機(jī)藥物的破壞有機(jī)藥物的破壞注

16、意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：（1）加熱或灼燒時(shí)，應(yīng)控制溫度在）加熱或灼燒時(shí)，應(yīng)控制溫度在420以下，防止金屬化合物的揮發(fā)以下，防止金屬化合物的揮發(fā)（2）一定要灰化完全）一定要灰化完全（3）經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易）經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但不要輕易棄去溶解，但不要輕易棄去第二節(jié)第二節(jié) 常用定量分析方法常用定量分析方法 藥物含量測定是評價(jià)藥品質(zhì)量優(yōu)劣的藥物含量測定是評價(jià)藥品質(zhì)量優(yōu)劣的重要手段重要手段常用測定方法：（常用測定方法：（Ch.P2000Ch.P2000收載較多）收載較多） 化學(xué)分析法化學(xué)分析法 光譜法（光譜法（UVUV、FDFD） 色譜法（色譜法（HPLCHPLC、GC GC

17、、TLCSTLCS）一一. . 化學(xué)分析化學(xué)分析法法包括重量分析和滴定分析包括重量分析和滴定分析 適用：主要用于測定制劑中適用：主要用于測定制劑中含量較高含量較高的一些的一些成分及含成分及含礦物藥制劑中的無機(jī)成分礦物藥制劑中的無機(jī)成分 如：總生物堿類、總酸類、總皂苷及礦物藥如：總生物堿類、總酸類、總皂苷及礦物藥特點(diǎn)：儀器簡單，結(jié)果準(zhǔn)確特點(diǎn)：儀器簡單，結(jié)果準(zhǔn)確 但有一定的局限性，靈敏度低，操作繁瑣、但有一定的局限性，靈敏度低，操作繁瑣、耗時(shí)長，專屬性不高，不適宜微量成分測定耗時(shí)長，專屬性不高，不適宜微量成分測定（一）重量分析法（一）重量分析法 揮發(fā)法：測定具有揮發(fā)性或能定量轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)的組分

18、含量。 如：干燥失重 、水分 灰分及熾灼殘?jiān)臏y定萃取法：萃取法：根據(jù)被測組分在互不相溶的兩根據(jù)被測組分在互不相溶的兩相中溶解度的不同，達(dá)到分離的目的。相中溶解度的不同，達(dá)到分離的目的。適用：總皂苷、總有機(jī)酸、總生物堿適用：總皂苷、總有機(jī)酸、總生物堿如：冰硼散中冰片的含量測定如：冰硼散中冰片的含量測定 地奧心血康膠囊中甾體總皂苷含量測定、昆地奧心血康膠囊中甾體總皂苷含量測定、昆明山海棠片中總生物堿的含量測定明山海棠片中總生物堿的含量測定 甘草浸膏中甘草酸的含量測定甘草浸膏中甘草酸的含量測定 沉淀法：沉淀法：將被測組分定量轉(zhuǎn)化為難溶將被測組分定量轉(zhuǎn)化為難溶 化合物，測定其含量?；衔?，測定其含量

19、。適用于：制劑中純度較高的成分。適用于：制劑中純度較高的成分。如：西瓜霜潤喉片中西瓜霜的含量測定如：西瓜霜潤喉片中西瓜霜的含量測定 苦參片中苦參總堿的含量測定苦參片中苦參總堿的含量測定 復(fù)方元胡注射液總堿的測定復(fù)方元胡注射液總堿的測定（二）滴定分析法（二）滴定分析法1.1.容量分析法的適用性及特點(diǎn)容量分析法的適用性及特點(diǎn)適用：適用：常量組分的分析常量組分的分析特點(diǎn)：操作簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，特點(diǎn)：操作簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確， 一般相對誤差一般相對誤差5n5），分別測定吸光度，繪制），分別測定吸光度，繪制A-CA-C曲曲線或求出回歸直線方程（線或求出回歸直線方程（r0.999r0.999）。）。

20、在相同條件下測定供試品溶液的吸在相同條件下測定供試品溶液的吸光度，求得供試品中被測成分的濃度或光度，求得供試品中被測成分的濃度或含量。含量。 （二）計(jì)算分光光度法（二）計(jì)算分光光度法 適用：多組分的含量測定適用：多組分的含量測定原理：吸光度具有加和性原理：吸光度具有加和性方法：方法： 雙波長法（等吸收點(diǎn)法和系數(shù)倍率法）雙波長法（等吸收點(diǎn)法和系數(shù)倍率法） 三波長法三波長法 導(dǎo)數(shù)光譜法導(dǎo)數(shù)光譜法（三）差示光譜法（三）差示光譜法基本原理基本原理 1.1.能提供一個(gè)合適的參比溶液能提供一個(gè)合適的參比溶液2.2.在兩種不同的介質(zhì)環(huán)境或?qū)嶒?yàn)條件下，被測組在兩種不同的介質(zhì)環(huán)境或?qū)嶒?yàn)條件下，被測組分有不同的特

21、征光譜（即不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)），分有不同的特征光譜（即不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)），而賦形劑或其它共存組分的光譜不變。因而可而賦形劑或其它共存組分的光譜不變。因而可消除它們的干擾。消除它們的干擾。 三三. .薄層掃描法薄層掃描法 薄層吸收掃描法薄層吸收掃描法適用于適用于: :在可見、紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，及在可見、紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，及 通過色譜前或色譜后衍生成上述化通過色譜前或色譜后衍生成上述化 合物的樣品組分合物的樣品組分分分: :反射法和透射法，薄層掃描中大多采用反射法和透射法，薄層掃描中大多采用 反射法反射法 定量依據(jù)定量依據(jù) Kubelka-Munk理論及曲線理論及曲線 以斑點(diǎn)的相對反射率或相對透光率

22、計(jì)算以斑點(diǎn)的相對反射率或相對透光率計(jì)算薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度，說明固定相的散薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度，說明固定相的散射參數(shù)射參數(shù)SXSX對斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸光度間對斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸光度間關(guān)系的影響，獲得不同散射參數(shù)關(guān)系的影響，獲得不同散射參數(shù)SXSX時(shí)斑點(diǎn)時(shí)斑點(diǎn)的的A-KXA-KX理論曲線，即理論曲線，即Kubelka-MunkKubelka-Munk曲線。曲線。不符合不符合L LB B定律：薄層板存在明顯的散射現(xiàn)象定律：薄層板存在明顯的散射現(xiàn)象 Kubelka-MunkKubelka-Munk曲線說明了薄層色譜斑曲線說明了薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度與其濃度間呈非線性關(guān)系，點(diǎn)的吸光度與其濃度間呈非線

23、性關(guān)系，解釋了薄層掃描法中標(biāo)準(zhǔn)曲線的彎曲解釋了薄層掃描法中標(biāo)準(zhǔn)曲線的彎曲問題，問題， 2.2.薄層熒光掃描法薄層熒光掃描法適用于：本身具有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后適用于：本身具有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測定 特點(diǎn)：專屬性強(qiáng)，靈敏度比吸收法高特點(diǎn)：專屬性強(qiáng)，靈敏度比吸收法高1 13 3個(gè)數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)，但適用范圍較窄。量級(jí)，但適用范圍較窄。定量原理：定量原理：當(dāng)溶液濃度很稀時(shí)當(dāng)溶液濃度很稀時(shí)（abc0.05）F=KC高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法高效液相色譜法是在經(jīng)典的液是在經(jīng)典的液相柱色譜法的基礎(chǔ)上引入了氣相色相柱色譜法的基礎(chǔ)上引入了氣相色譜的理論和技術(shù)

24、，采用高壓泵，高譜的理論和技術(shù)，采用高壓泵，高效固定相以及高靈敏度在線檢測器效固定相以及高靈敏度在線檢測器發(fā)展而成的分離分析方法發(fā)展而成的分離分析方法。分析方法分析方法正相分配色譜法正相分配色譜法常用于分離強(qiáng)極性化合物。常用于分離強(qiáng)極性化合物。常用極性鍵合相為氨基鍵合相（強(qiáng)極性）、常用極性鍵合相為氨基鍵合相（強(qiáng)極性）、氰基鍵合相（中強(qiáng)極性），氰基鍵合相（中強(qiáng)極性），流動(dòng)相常選用低極性溶劑如烴類，加入適量流動(dòng)相常選用低極性溶劑如烴類，加入適量極性溶劑如醇類等調(diào)節(jié)洗脫液。極性溶劑如醇類等調(diào)節(jié)洗脫液。梯度洗脫時(shí)，通常逐漸增大洗脫劑中極性溶梯度洗脫時(shí)，通常逐漸增大洗脫劑中極性溶劑的比例，故樣品中極性小

25、的組分先流出，劑的比例，故樣品中極性小的組分先流出，極性大的組分后流出極性大的組分后流出。 氰基鍵合相氰基鍵合相的分離選擇性與的分離選擇性與硅膠硅膠相似，相似，但極性比硅膠弱。許多能在硅膠上分離但極性比硅膠弱。許多能在硅膠上分離的樣品，可以在氰基鍵合相上完成。氰的樣品，可以在氰基鍵合相上完成。氰基鍵合相對基鍵合相對雙鍵異構(gòu)體雙鍵異構(gòu)體有很好的分離選有很好的分離選擇性。擇性。 氨基鍵合相氨基鍵合相是分析是分析糖類糖類最常用的固最常用的固定相，常用乙腈定相，常用乙腈- -水為流動(dòng)相。水為流動(dòng)相。 反相分配色譜法反相分配色譜法 適合于分離弱極性和中等極性的化合物。極適合于分離弱極性和中等極性的化合物

26、。極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。性大的組分先流出，極性小的組分后流出。常用的固定相為十八烷基硅膠鍵合常用的固定相為十八烷基硅膠鍵合相相C C1818(ODS)(ODS)，其次是辛基硅烷鍵合硅膠；，其次是辛基硅烷鍵合硅膠；流動(dòng)相采用甲醇水或乙腈水。有時(shí)也可流動(dòng)相采用甲醇水或乙腈水。有時(shí)也可加入適當(dāng)?shù)乃峄驂A來控制流動(dòng)相的加入適當(dāng)?shù)乃峄驂A來控制流動(dòng)相的pHpH值，以值，以防止出現(xiàn)不對稱色譜峰。防止出現(xiàn)不對稱色譜峰。反相色譜常采用梯度洗脫，使每個(gè)組分都在反相色譜常采用梯度洗脫，使每個(gè)組分都在適宜條件下獲得分離適宜條件下獲得分離 離子對色譜離子對色譜（IPC） 在流動(dòng)相中加入溶質(zhì)分子電荷相反的

27、離子對在流動(dòng)相中加入溶質(zhì)分子電荷相反的離子對試劑，來分離試劑，來分離離子型或可離子化的化合物離子型或可離子化的化合物的的方法。方法。離子對色譜法分為正相離子對色譜和反相離離子對色譜法分為正相離子對色譜和反相離子對色譜法，最常用的是子對色譜法，最常用的是反相離子對色譜。反相離子對色譜。它使用反相色譜中常用的固定相（它使用反相色譜中常用的固定相（ODSODS），能），能同時(shí)分離離子型化合物和中性化合物。同時(shí)分離離子型化合物和中性化合物。HPLC條件的選擇條件的選擇固定相選擇固定相選擇 一般的一般的液相色譜適合的相對分子質(zhì)量范圍液相色譜適合的相對分子質(zhì)量范圍200-2000200-2000，相對分子

28、質(zhì)量大于，相對分子質(zhì)量大于20002000的則用空的則用空間排阻色譜較佳。間排阻色譜較佳。樣品為酸、堿化合物，則采用離子交換色譜；樣品為酸、堿化合物，則采用離子交換色譜；異構(gòu)體采用液異構(gòu)體采用液- -固吸附色譜；固吸附色譜；樣品為脂肪族或芳香族，可采用液樣品為脂肪族或芳香族，可采用液- -液分配液分配色譜或液色譜或液- -固吸附色譜；固吸附色譜；同系物不同官能團(tuán)及強(qiáng)氫鍵的樣品可用液同系物不同官能團(tuán)及強(qiáng)氫鍵的樣品可用液- -液分配色液分配色譜。譜。正相色譜正相色譜主要用于分離極性化合物主要用于分離極性化合物， 常用氫基、氰基鍵合固定相。常用氫基、氰基鍵合固定相。反相色譜反相色譜應(yīng)用最為廣泛，適于

29、分析應(yīng)用最為廣泛，適于分析非極性和中等極性的化合物非極性和中等極性的化合物最常用的固定相是十八烷基鍵合固定相最常用的固定相是十八烷基鍵合固定相，流動(dòng)相選擇流動(dòng)相選擇 根據(jù)不同類型的色譜法選擇流動(dòng)相根據(jù)不同類型的色譜法選擇流動(dòng)相正相分配色譜正相分配色譜 流動(dòng)相是以烴類（如己烷、流動(dòng)相是以烴類（如己烷、烷等）為主，加入少量極性溶劑（如氯仿、烷等）為主，加入少量極性溶劑（如氯仿、甲醇等）改變流動(dòng)相的極性和組成，分離異甲醇等）改變流動(dòng)相的極性和組成，分離異構(gòu)體、極性化合物等。構(gòu)體、極性化合物等。反相分配色譜反相分配色譜 流動(dòng)相是以水為主，再加入流動(dòng)相是以水為主，再加入能與水混溶的有機(jī)溶劑，通過改變有機(jī)

30、溶劑能與水混溶的有機(jī)溶劑，通過改變有機(jī)溶劑的組成，調(diào)整組分的容量因子，改善分離效的組成，調(diào)整組分的容量因子，改善分離效率，率，甲醇甲醇是最常用的有機(jī)溶劑，其次是乙腈是最常用的有機(jī)溶劑，其次是乙腈和四氫呋喃。和四氫呋喃。 在反相鍵合相色譜中，用水在反相鍵合相色譜中，用水- -甲醇、水甲醇、水- -乙腈溶液為流動(dòng)相，可分離極性物質(zhì)。乙腈溶液為流動(dòng)相，可分離極性物質(zhì)。 用水和無機(jī)鹽的緩沖溶液作流動(dòng)相，用水和無機(jī)鹽的緩沖溶液作流動(dòng)相，可以分離易離解的物質(zhì)，如有機(jī)酸、有可以分離易離解的物質(zhì)，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等。機(jī)堿、酚類等。離子交換色譜離子交換色譜 流動(dòng)相通常是鹽類的緩沖溶液。流動(dòng)相通常是鹽類的緩

31、沖溶液。 通過改變流動(dòng)相的通過改變流動(dòng)相的PHPH、緩沖溶液的類型、緩沖溶液的類型、離子強(qiáng)度、以及加入有機(jī)溶劑、配合劑都會(huì)改離子強(qiáng)度、以及加入有機(jī)溶劑、配合劑都會(huì)改變分離選擇性，提高分離效果。變分離選擇性，提高分離效果。空間排阻色譜空間排阻色譜 流動(dòng)相的選擇不是為了提流動(dòng)相的選擇不是為了提高色譜柱的選擇性，而是為了使樣品更好地高色譜柱的選擇性，而是為了使樣品更好地溶解，或是為了減少流動(dòng)相黏度，提高柱效。溶解，或是為了減少流動(dòng)相黏度，提高柱效。選用低黏度的流動(dòng)相，其沸點(diǎn)要比柱溫高選用低黏度的流動(dòng)相，其沸點(diǎn)要比柱溫高25-25-5050，且應(yīng)與選用的固定相和檢測器相配。，且應(yīng)與選用的固定相和檢測器

32、相配。 洗脫技術(shù)洗脫技術(shù)根據(jù)分離度的要求，在色譜分離過程中樣品組分根據(jù)分離度的要求，在色譜分離過程中樣品組分的的k k值值范圍應(yīng)控制在范圍應(yīng)控制在1-101-10之間。之間。 如果樣品組分較少、性質(zhì)差別不大，一般采用如果樣品組分較少、性質(zhì)差別不大，一般采用等等度洗脫度洗脫（溶劑組成在一分析周期里保持恒定）可（溶劑組成在一分析周期里保持恒定）可以使所有組以使所有組分的分的k k值都處于這個(gè)范圍內(nèi)。值都處于這個(gè)范圍內(nèi)。 對于組分?jǐn)?shù)目較多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜混合物，對于組分?jǐn)?shù)目較多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜混合物，為使各組分均得到滿意的分離，必須采用為使各組分均得到滿意的分離，必須采用梯度洗梯度洗脫技術(shù)脫

33、技術(shù)，即在一個(gè)分析周期中，程序控制流動(dòng)相，即在一個(gè)分析周期中，程序控制流動(dòng)相的組成（如溶劑的極性、離子強(qiáng)度、的組成（如溶劑的極性、離子強(qiáng)度、PHPH值等）改值等）改變，使每個(gè)組分都在適宜的條件下獲得分離。變，使每個(gè)組分都在適宜的條件下獲得分離。 梯度洗脫可以采用二元混合溶劑或多元混合溶劑，梯度洗脫可以采用二元混合溶劑或多元混合溶劑，即所謂二元梯度和多元梯度。梯度洗脫程序一般是以即所謂二元梯度和多元梯度。梯度洗脫程序一般是以等強(qiáng)度洗脫的結(jié)果為基礎(chǔ)，通過實(shí)驗(yàn)加以確定的。對等強(qiáng)度洗脫的結(jié)果為基礎(chǔ)，通過實(shí)驗(yàn)加以確定的。對極性固定相，梯度溶劑范圍從正己烷到氯代烷；極性固定相，梯度溶劑范圍從正己烷到氯代烷

34、； 對非極性固定相，一般采用水對非極性固定相，一般采用水- -乙腈、水乙腈、水- -甲醇線性梯甲醇線性梯度。度。 梯度洗脫特別適用于極性范圍很寬的混合物分離。梯度洗脫特別適用于極性范圍很寬的混合物分離。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 縮短總分析時(shí)間，提高分離度，是使縮短總分析時(shí)間，提高分離度，是使k k值相值相差差10103 310104 4的樣品組分，在合理分析速度下得到適當(dāng)?shù)臉悠方M分，在合理分析速度下得到適當(dāng)分離度的唯一方法。分離度的唯一方法。 改善峰形，提高峰的對稱性，減少峰的區(qū)域改善峰形，提高峰的對稱性，減少峰的區(qū)域?qū)挾?，使微量組分易被檢出，降低最小檢出量，提高寬度，使微量組分易被檢出，降低最小檢出量，提高

35、檢測靈敏度。檢測靈敏度。 檢測器的選擇檢測器的選擇針對樣品的性質(zhì)不同選擇適合的檢測器。針對樣品的性質(zhì)不同選擇適合的檢測器。紫外檢測器紫外檢測器 高靈敏度，但只能用于高靈敏度，但只能用于有可見有可見紫外吸收的化合物紫外吸收的化合物。主要用于芳烴與稠環(huán)芳。主要用于芳烴與稠環(huán)芳烴、芳香基取代物、芳香氨基酸、核酸、甾烴、芳香基取代物、芳香氨基酸、核酸、甾體激素、羧基與羰基化合物等。體激素、羧基與羰基化合物等。蒸發(fā)光散射檢測器蒸發(fā)光散射檢測器 用于用于揮發(fā)性低于流動(dòng)揮發(fā)性低于流動(dòng)相，紫外無吸收或呈末端吸收的樣品組分相，紫外無吸收或呈末端吸收的樣品組分，但對于有紫外吸收的組分的檢測靈敏度較低。但對于有紫外

36、吸收的組分的檢測靈敏度較低。主要用于糖類、高分子化合物、高級(jí)脂肪酸主要用于糖類、高分子化合物、高級(jí)脂肪酸及甾體類等幾十類化合物。及甾體類等幾十類化合物。 熒光檢測器熒光檢測器 適用于適用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì)能發(fā)熒光的物質(zhì)。主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴、。主要用于氨基酸、多環(huán)芳烴、維生素、甾體化合物及酶等的檢測。維生素、甾體化合物及酶等的檢測。電化學(xué)發(fā)光檢測器電化學(xué)發(fā)光檢測器 對于對于電活性物質(zhì)電活性物質(zhì)來說是一來說是一類較好的選擇性檢測器。主要用于有機(jī)胺類化類較好的選擇性檢測器。主要用于有機(jī)胺類化合物。合物。前處理前處理流動(dòng)相脫氣：流動(dòng)相脫氣：流動(dòng)相在使用前必須

37、進(jìn)行脫氣流動(dòng)相在使用前必須進(jìn)行脫氣處理，目的是除去其中溶解的氣體。常用處理，目的是除去其中溶解的氣體。常用的脫氣方法有：超聲波振動(dòng)脫氣、抽真空脫的脫氣方法有：超聲波振動(dòng)脫氣、抽真空脫氣、加熱回流脫氣、吹氦脫氣、真空在線脫氣、加熱回流脫氣、吹氦脫氣、真空在線脫氣氣 。 超聲波振動(dòng)脫氣，超聲波振動(dòng)脫氣，將欲脫氣的流動(dòng)相置放于將欲脫氣的流動(dòng)相置放于超聲波提取器中，用超聲波振蕩超聲波提取器中，用超聲波振蕩10-15min10-15min，此法的脫氣簡單，最常用。此法的脫氣簡單，最常用。過膜過膜：流動(dòng)相及供試液須經(jīng)過：流動(dòng)相及供試液須經(jīng)過0.45um0.45um或或0.2um0.2um濾膜過濾濾膜過濾V

38、an DeemterVan Deemter方程式在方程式在HPLCHPLC中的表達(dá)式為：中的表達(dá)式為：H = A + CU HPLC HPLC可以近似地認(rèn)為流動(dòng)相的流速與板高可以近似地認(rèn)為流動(dòng)相的流速與板高成直線關(guān)系，流速增大，板高增加，色譜柱成直線關(guān)系，流速增大，板高增加，色譜柱柱效降低。柱效降低。 為了兼顧柱效與分析速度，一般都盡可能為了兼顧柱效與分析速度，一般都盡可能地采用較低流速。內(nèi)徑地采用較低流速。內(nèi)徑4.6mm4.6mm柱，流量多采用柱，流量多采用1 1mLmL/min/min。色譜適用性試驗(yàn)色譜適用性試驗(yàn)色譜適用性試驗(yàn)可以用來評價(jià)高效液相色譜色譜適用性試驗(yàn)可以用來評價(jià)高效液相色譜

39、法色譜條件。法色譜條件。按各品種項(xiàng)下要求對儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，按各品種項(xiàng)下要求對儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，即用規(guī)定的對照品對儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子子。 1.1.色譜柱的理論板數(shù)（色譜柱的理論板數(shù)（n n） 在選定的狀態(tài)下，在選定的狀態(tài)下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間物

40、質(zhì)峰的保留時(shí)間tRtR（以分鐘或長度計(jì)）和半（以分鐘或長度計(jì)）和半峰高寬（峰高寬（W Wh h/2/2），按），按n n5.545.54（t tR R/ / W Wh h/2/2）2 2計(jì)算計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。色譜柱的理論板數(shù)。 如果測得的理論板數(shù)低于此樣品規(guī)定的最小如果測得的理論板數(shù)低于此樣品規(guī)定的最小理論塔板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱理論塔板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論塔板數(shù)達(dá)到要求。論塔板數(shù)達(dá)到要求。2.分離度分離度 定量分析時(shí)，要求定量峰與其他峰定量分析時(shí)，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好

41、的分離度。或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度。分離度（分離度（R）的計(jì)算公式為：）的計(jì)算公式為： R2（tR2tR1）/W1+W2 tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間；為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間；W1、 W2為此相鄰兩峰的峰寬。為此相鄰兩峰的峰寬。分離度應(yīng)大于分離度應(yīng)大于1.5。 3.重復(fù)性重復(fù)性 樣品的對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣樣品的對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有次，除另有規(guī)定外，其規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于不大于2.0。 也可按照各樣品校正因子測定項(xiàng)下，也可按照各樣品校正因子測定項(xiàng)下，配置配置

42、80、100、120的對照溶液的對照溶液，加入規(guī)定，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子次，計(jì)算平均校正因子，其，其相對相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于標(biāo)準(zhǔn)偏差也應(yīng)不大于2.02.0。4. 拖尾因子拖尾因子 為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時(shí)，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子（高法測量時(shí)，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子（T）是否符合規(guī)定，或不同濃度進(jìn)樣的校正因子是否符合規(guī)定，或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為：誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為： TW0.05h/2d1 W0.0

43、5h為為0.05峰高處的峰寬峰高處的峰寬d1為峰極大至峰前沿之間的距離。為峰極大至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，除另有規(guī)定外，T應(yīng)在應(yīng)在0.951.05之間之間。定量分析方法定量分析方法 液相色譜法的定量方法，液相色譜法的定量方法，常用外標(biāo)法及內(nèi)標(biāo)法常用外標(biāo)法及內(nèi)標(biāo)法，也，也可用內(nèi)加法、校正因子法定量。可用內(nèi)加法、校正因子法定量。 1. 1. 外標(biāo)法外標(biāo)法 以試樣的對照品作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，與標(biāo)準(zhǔn)物以試樣的對照品作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對比求算試樣含量的方法。質(zhì)對比求算試樣含量的方法。外標(biāo)法可分為外標(biāo)工作曲線法、外標(biāo)一點(diǎn)法及外標(biāo)外標(biāo)法可分為外標(biāo)工作曲線法、外標(biāo)一點(diǎn)法及外標(biāo)二點(diǎn)法等，前二種方法常用。二點(diǎn)

44、法等，前二種方法常用。優(yōu)點(diǎn)是不需要知道校正因子，只要被測組分出峰、優(yōu)點(diǎn)是不需要知道校正因子，只要被測組分出峰、無干擾、保留時(shí)間適宜，即可進(jìn)行定量分析。無干擾、保留時(shí)間適宜，即可進(jìn)行定量分析。缺點(diǎn)，進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確，否則定量誤差大。缺點(diǎn)，進(jìn)樣量必須準(zhǔn)確，否則定量誤差大。在在HPLCHPLC中，一般用中，一般用六通閥六通閥定量環(huán)進(jìn)樣，進(jìn)樣量誤差定量環(huán)進(jìn)樣，進(jìn)樣量誤差相對較小，因此相對較小，因此外標(biāo)法是外標(biāo)法是HPLCHPLC常用的定量分析方法常用的定量分析方法之一。之一。外標(biāo)工作曲線法（簡稱工作曲線法）外標(biāo)工作曲線法（簡稱工作曲線法）用試樣的對照品，配制一系列濃度不同的對用試樣的對照品，配制一系列濃

45、度不同的對照品溶液，準(zhǔn)確進(jìn)樣，測量峰面積或峰高，照品溶液，準(zhǔn)確進(jìn)樣，測量峰面積或峰高，以對照品溶液的濃度或進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以以對照品溶液的濃度或進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積或峰高為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，計(jì)算峰面積或峰高為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)?；貧w方程及相關(guān)系數(shù)。相同條件下，注入供試品溶液，利用此曲線相同條件下，注入供試品溶液，利用此曲線或回歸方程或回歸方程A=A=a+ba+bC C ( (計(jì)算樣品溶液的濃度）。計(jì)算樣品溶液的濃度）。 （2 2）外標(biāo)一點(diǎn)法）外標(biāo)一點(diǎn)法 只有在工作曲線通過原點(diǎn)，即截距為零時(shí)，只有在工作曲線通過原點(diǎn)，即截距為零時(shí)，才可用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行定量分析，否則需

46、才可用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行定量分析，否則需用外標(biāo)二點(diǎn)法定量。用外標(biāo)二點(diǎn)法定量。用一種濃度的對照品溶液對比，求算同一用一種濃度的對照品溶液對比，求算同一物質(zhì)的樣品（色譜組分）含量的方法，稱物質(zhì)的樣品（色譜組分）含量的方法，稱為外標(biāo)一點(diǎn)法。為外標(biāo)一點(diǎn)法。sisiAAccC Ci i與與 A Ai i分別為樣品中待測組分濃度和峰面積；分別為樣品中待測組分濃度和峰面積； C Cs s與與A As s分別為對照品溶液濃度與峰面積。分別為對照品溶液濃度與峰面積。 峰形為正常峰時(shí)，常用峰形為正常峰時(shí)，常用隨行外標(biāo)一點(diǎn)法隨行外標(biāo)一點(diǎn)法即即每次測定都同時(shí)進(jìn)對照品與樣品，并且濃度每次測定都同時(shí)進(jìn)對照品與樣品，并且濃度接

47、近，以減少因儀器不穩(wěn)定帶來的誤差。接近，以減少因儀器不穩(wěn)定帶來的誤差。 2. 2. 內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)法法將一定量的內(nèi)標(biāo)物加入到樣品中，再經(jīng)色將一定量的內(nèi)標(biāo)物加入到樣品中，再經(jīng)色譜分析，根據(jù)樣品的重量和內(nèi)標(biāo)物重量以譜分析，根據(jù)樣品的重量和內(nèi)標(biāo)物重量以及待測組分峰面積和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，就及待測組分峰面積和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，就可求出待測組分的含量?？汕蟪龃郎y組分的含量。內(nèi)標(biāo)法可分為工作曲線法、內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)法可分為工作曲線法、內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法（內(nèi)標(biāo)對比法）、內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法及校正因子（內(nèi)標(biāo)對比法）、內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法及校正因子法。法。所用的內(nèi)標(biāo)物的要求同氣相色譜。所用的內(nèi)標(biāo)物的要求同氣相色譜。 內(nèi)標(biāo)法優(yōu)點(diǎn)：內(nèi)標(biāo)法優(yōu)點(diǎn)： 可抵消儀

48、器穩(wěn)定性差，進(jìn)樣量不夠準(zhǔn)確可抵消儀器穩(wěn)定性差，進(jìn)樣量不夠準(zhǔn)確等原因帶來的定量分析誤差。等原因帶來的定量分析誤差。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 樣品配置比較麻煩，不易尋找內(nèi)標(biāo)物。樣品配置比較麻煩，不易尋找內(nèi)標(biāo)物。 （1）工作曲線法內(nèi)標(biāo)工作曲線法與外標(biāo)法相同，只在各種濃內(nèi)標(biāo)工作曲線法與外標(biāo)法相同，只在各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加入相同量的內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，加入相同量的內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)樣。分別測量組分樣。分別測量組分i i與內(nèi)標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物s s的峰面積的峰面積A A（或峰高），以其（或峰高），以其峰面積峰面積比比A Ai i/A/AS S濃度濃度為縱坐為縱坐標(biāo)，以對照品溶液標(biāo)，以對照品溶液的的C Ci i（標(biāo)準(zhǔn)）（標(biāo)

49、準(zhǔn)）繪制工作曲線，繪制工作曲線，計(jì)算回歸方程式計(jì)算回歸方程式C Ci i= b = b A Ai i /As + a /As + a及相關(guān)系及相關(guān)系數(shù)。數(shù)。b b：斜率；：斜率；a a：截距：截距A Ai i：待測組分的峰面積或峰高；：待測組分的峰面積或峰高；A AS S：內(nèi)標(biāo)物的峰面積或峰高。：內(nèi)標(biāo)物的峰面積或峰高。（2 2）內(nèi)標(biāo)對比法（內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法）內(nèi)標(biāo)對比法（內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法）內(nèi)標(biāo)對比法內(nèi)標(biāo)對比法 不需知道校正因子又具有內(nèi)不需知道校正因子又具有內(nèi)標(biāo)法的定量準(zhǔn)確度與進(jìn)樣量無關(guān)的特點(diǎn)。方標(biāo)法的定量準(zhǔn)確度與進(jìn)樣量無關(guān)的特點(diǎn)。方法簡便實(shí)用法簡便實(shí)用。在藥物分析中分析結(jié)果（含量）常用標(biāo)示量在藥物分析中分析

50、結(jié)果（含量）常用標(biāo)示量% %表示表示%100)%(標(biāo)示量標(biāo)示量對照對照品樣品WmAAAAmisisim mi i為藥物對照品的量，為藥物對照品的量，m m是取樣量是取樣量, ,W W為平均片重（或丸重等）為平均片重（或丸重等） 3.3.內(nèi)標(biāo)法加校正因子法內(nèi)標(biāo)法加校正因子法 用此法需要已知校正因子，而高效液相用此法需要已知校正因子，而高效液相色譜法的校正因子很難由手冊中查到，色譜法的校正因子很難由手冊中查到，常常需要測定。常常需要測定。測定校正因子需配制含有內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)測定校正因子需配制含有內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同實(shí)驗(yàn)條件條件下進(jìn)樣溶液，在相同實(shí)驗(yàn)條件條件下進(jìn)樣5 51010次，分別測定峰面積，

51、計(jì)算各組分的相次，分別測定峰面積，計(jì)算各組分的相對重量校正因子。對重量校正因子。ssiiiAmAmf/ssiiiACACf/m mi i與與m ms s分別為待測物與內(nèi)標(biāo)物的量；分別為待測物與內(nèi)標(biāo)物的量；A Ai i與與A As s分別為它們的峰面積。分別為它們的峰面積。自測的相對重量校正因子，只能在此實(shí)驗(yàn)條自測的相對重量校正因子，只能在此實(shí)驗(yàn)條件下使用，而無通用性，引用時(shí)需注意。件下使用，而無通用性，引用時(shí)需注意。 內(nèi)標(biāo)法的計(jì)算公式：內(nèi)標(biāo)法的計(jì)算公式：%100%CSsiiAAfCCsCs為內(nèi)標(biāo)物的濃度，為內(nèi)標(biāo)物的濃度， f f 為較正因子為較正因子A Ai i、A As s分別為待測組分和內(nèi)

52、標(biāo)物的峰面積分別為待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰面積。氣相色譜法氣相色譜法特點(diǎn)：高靈敏度、高選擇性、高柱效、特點(diǎn)：高靈敏度、高選擇性、高柱效、 快速、用量少快速、用量少適用：具有揮發(fā)性且熱穩(wěn)定性好的物質(zhì)適用：具有揮發(fā)性且熱穩(wěn)定性好的物質(zhì)一般色譜圖于一般色譜圖于3030分鐘內(nèi)記錄完畢分鐘內(nèi)記錄完畢色譜條件的選擇色譜條件的選擇主要依據(jù):分離度方程速率理論l色譜柱的選擇：固定相、柱長l柱溫的選擇：l載氣的選擇：峰擴(kuò)張、柱壓降對檢測器的靈敏度l進(jìn)樣量的選擇：盡量少l氣化溫度的選擇：樣品的揮發(fā)性、沸點(diǎn)及進(jìn)樣量檢測室溫度檢測室溫度系統(tǒng)適用性試驗(yàn)系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 同同HPLC法法定量方法定量方法 由于由于GC一般手動(dòng)進(jìn)

53、樣，且進(jìn)樣量小一般手動(dòng)進(jìn)樣，且進(jìn)樣量?。?.1-1l），故），故GC大多采用內(nèi)標(biāo)法定量大多采用內(nèi)標(biāo)法定量1.歸一化法1）前提：樣品中所有組分都能流出柱且對檢測器都有響應(yīng)。2）計(jì)算公式:mi Ai fipi= 100%= 100% m A1f1 +A2f2 +Anfn如果組分為同系物fi近似相同，則可簡化為Ai Pi= 100% A1+A2+ +An優(yōu)點(diǎn)：a.簡便，結(jié)果與進(jìn)樣量無關(guān),操作條件影響不大。b.比其它方法易行。宜于進(jìn)樣量少不易測準(zhǔn)的液體樣品。c.當(dāng)分析同系物時(shí)可不求f而直接把面積歸一化。缺點(diǎn)：a. 含高沸點(diǎn)或不出峰的組分b.檢測器上無信號(hào)的組分c.無法求得f的組分（未定性或峰重疊）2、

54、內(nèi)標(biāo)法前提：有適合的內(nèi)標(biāo)物對內(nèi)標(biāo)物的要求： a.樣品中不含此成分 b.能單獨(dú)出峰且能與組分完全分開 c.峰位置盡量靠近組分 d.加入的重量接近于組分的量公式 fi mi/Aifi fs ms/Asmi Ai = fims As mi mi ms Ai mspi= 100%= 100%= fi 100% m ms m As m 一般來說，TCD標(biāo)準(zhǔn)物用苯，F(xiàn)ID用正庚烷。操作過程a.先配制已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，加一定量的內(nèi)標(biāo) 標(biāo)準(zhǔn)液 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖b.未知濃度的樣品加同量內(nèi)標(biāo) 待測溶液 樣品色譜圖(Ci%)樣品 (Aifi/Asfs )樣 (Ai/As)樣 (Ci%)標(biāo)準(zhǔn) (Aifi/Asfs )標(biāo)

55、(Ai/As)標(biāo) (Ai/As)樣(Ci%)樣品 (Ci%)標(biāo)準(zhǔn) (Ai/As)標(biāo)優(yōu)點(diǎn)：a.定量準(zhǔn)確b.操作條件影響不大c.沒有歸一化的缺點(diǎn)缺點(diǎn)：每次測定都要精確配制含內(nèi)標(biāo)的樣品，另內(nèi)標(biāo)的選擇也較難。3、外標(biāo)法即以待測組分的標(biāo)準(zhǔn)品作對照物,與對照物對比求算待測組分含量的方法.優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、計(jì)算方便缺點(diǎn)：需嚴(yán)格控制進(jìn)樣體積，操作條件應(yīng)穩(wěn)定單點(diǎn)校正 前提：曲線過原點(diǎn)配一與被測組分含量接近的標(biāo)樣Ps，進(jìn)樣量同分析樣品。 AiPi Ps=Ki Ai AsKi：標(biāo)樣單位峰面積所代表的百分含量不過原點(diǎn)，雙點(diǎn)校正。熒光分析熒光分析法法 特點(diǎn)：靈敏度高，選擇性好。（熒光法靈敏特點(diǎn)：靈敏度高，選擇性好。（熒光

56、法靈敏度可達(dá)度可達(dá)10101010g/ml10g/ml101212g/mlg/ml，而一般紫外，而一般紫外可見分光光度法的靈敏度約為可見分光光度法的靈敏度約為10107 7g/mlg/ml。）。）適用：成分本身具有熒光或經(jīng)衍生化能轉(zhuǎn)變適用：成分本身具有熒光或經(jīng)衍生化能轉(zhuǎn)變 為熒光化合物為熒光化合物 稀溶液中測定稀溶液中測定產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件： 第一是物質(zhì)分子必須有強(qiáng)的紫外第一是物質(zhì)分子必須有強(qiáng)的紫外可見吸可見吸收；第二是必須具備較高的熒光效率。收；第二是必須具備較高的熒光效率。原理：原理： 若濃度若濃度C C很小，當(dāng)很小，當(dāng)ECL0.05ECL0.05時(shí)，則：時(shí)

57、，則： F= 2.3KF= 2.3Kf f I I0 0ECL = K CECL = K C 在低濃度時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與熒在低濃度時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系，此系熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系，此系熒光法定量分析的依據(jù)。光法定量分析的依據(jù)。定量分析方法：1 1標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法 熒光分析一般采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法（校正曲熒光分析一般采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法（校正曲線法），在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，常采用標(biāo)準(zhǔn)溶線法），在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，常采用標(biāo)準(zhǔn)溶液系列中某一溶液作為基準(zhǔn)，先將空白溶液液系列中某一溶液作為基準(zhǔn)，先將空白溶液的熒光強(qiáng)度調(diào)至的熒光強(qiáng)度調(diào)至0 0，再將該標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光，再將該標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度調(diào)

58、至強(qiáng)度調(diào)至100100或或5050，然后測定系列中其它各，然后測定系列中其它各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度F F，再繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即即F-CF-C曲線。曲線。 在實(shí)際工作中，當(dāng)儀器調(diào)零之后，先測定空在實(shí)際工作中，當(dāng)儀器調(diào)零之后，先測定空白溶液的熒光強(qiáng)度白溶液的熒光強(qiáng)度F F0 0，然后測定各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后測定各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度的熒光強(qiáng)度F F，得（，得（F FF F0 0）就是標(biāo)準(zhǔn)溶液本身）就是標(biāo)準(zhǔn)溶液本身的熒光強(qiáng)度。通過這樣測定，再繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，的熒光強(qiáng)度。通過這樣測定，再繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即（即（F FF F0 0）-C-C曲線。曲線。 為了使不同時(shí)間繪制的標(biāo)

59、準(zhǔn)曲線能前后一致，為了使不同時(shí)間繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線能前后一致，每次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)均采用同一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行每次繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)均采用同一標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。校正。 如果試樣溶液在紫外光照射下不很穩(wěn)定，如果試樣溶液在紫外光照射下不很穩(wěn)定，則須則須改用另一種性質(zhì)穩(wěn)定，而且所發(fā)生的熒改用另一種性質(zhì)穩(wěn)定，而且所發(fā)生的熒光和試樣溶液的熒光相近似的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為光和試樣溶液的熒光相近似的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為基準(zhǔn)?；鶞?zhǔn)。 如測定維生素如測定維生素B B1 1時(shí)，采用硫酸奎寧的時(shí)，采用硫酸奎寧的0.050.05mol/LHmol/LH2 2SOSO4 4溶液作為基準(zhǔn)溶液作為基準(zhǔn)( (適用于藍(lán)色熒適用于藍(lán)色熒光光) )；若為黃綠色熒

60、光可用熒光素鈉的水溶液；若為黃綠色熒光可用熒光素鈉的水溶液；紅色熒光可用羅丹明紅色熒光可用羅丹明B B水溶液為基準(zhǔn)。水溶液為基準(zhǔn)。 2比例法 若標(biāo)準(zhǔn)曲線通過零點(diǎn)，可用比例法進(jìn)行測定。若標(biāo)準(zhǔn)曲線通過零點(diǎn)，可用比例法進(jìn)行測定。配制一標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度在線性范圍內(nèi)，配制一標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度在線性范圍內(nèi)，測定熒光強(qiáng)度測定熒光強(qiáng)度F FS S，然后在同樣條件下測定試，然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強(qiáng)度樣溶液的熒光強(qiáng)度F FX X。由標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。由標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度C CS S和兩種溶液的熒光強(qiáng)度比，求得試樣中熒光和兩種溶液的熒光強(qiáng)度比，求得試樣中熒光物質(zhì)的濃度物質(zhì)的濃度C CX X或含量。在空白溶液