環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、環(huán)境工程微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義實(shí)驗(yàn)一 光學(xué)顯微鏡的使用一、 目的要求1、 熟悉普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及其使用方法。2、 了解油鏡的原理，并掌握其使用方法。3、學(xué)習(xí)生物圖的繪制方法二、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容學(xué)習(xí)普通光學(xué)顯微鏡的使用方法，學(xué)會(huì)判斷是否需要使用油鏡，學(xué)習(xí)理解，學(xué)習(xí)怎樣使用和利用光圈，反光鏡，調(diào)整反差，使視野達(dá)到最好的觀察效果。學(xué)習(xí)使用油鏡觀察微生物標(biāo)本示范片。觀察的示范片有，細(xì)菌三型涂片、葡萄球菌涂片、枯草芽孢桿菌涂片、褐球固氮菌涂片、八疊球菌涂片、豬鏈球菌涂片，青霉、曲霉示范片等。三、 實(shí)驗(yàn)器材顯微鏡、各種示范片、香柏油、二甲苯、擦鏡紙等。四、 方法步驟1 用低倍鏡對(duì)（調(diào)）光，使視野明亮。2 選擇要觀

2、察的標(biāo)本片，首先在低倍鏡觀察（尋找觀察目標(biāo)）。3 高倍鏡觀察（選取理想的觀察目標(biāo)）。4 油鏡觀察：高倍鏡觀察后上升鏡筒（或者是下調(diào)載物臺(tái)）油鏡轉(zhuǎn)至正下方，在載玻片上加一小滴香柏油小心地下降鏡筒使鏡頭浸在油里用粗螺旋將鏡筒（載物臺(tái)）緩慢上升，尋找目標(biāo)（物象）用細(xì)螺旋調(diào)節(jié)，使物象清晰觀察記錄。5 觀察完畢。上升鏡筒（或者是下調(diào)載物臺(tái)），轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使油鏡物鏡偏位。用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上的油跡，再取一張擦鏡紙醮上二甲苯擦去鏡頭上殘留的香柏油，最后再用一張干凈的擦鏡紙擦去殘留在鏡頭上的二甲苯。6 將顯微鏡各部分還原至進(jìn)實(shí)驗(yàn)室時(shí)模樣。五 結(jié)果與思考 1 繪圖記錄觀察結(jié)果（以細(xì)菌三型為例）細(xì)菌三型涂片

3、觀察放大倍數(shù) 目10物100_細(xì)菌三型涂片觀察放大倍數(shù)目10 物1002 油鏡完畢后，鏡頭應(yīng)如何處理?六、講解時(shí)的注意事項(xiàng)：1、本次實(shí)驗(yàn)為學(xué)生第一次進(jìn)入微生物實(shí)驗(yàn)室，因此在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí)必須向?qū)W生交代實(shí)驗(yàn)室的一些規(guī)章制度及注意事項(xiàng)。2、對(duì)顯微鏡的介紹從原理到各部件到使用都務(wù)必詳細(xì)，包括使用過(guò)程中應(yīng)該注意的事項(xiàng)，盡量減少學(xué)生用壞儀器的幾率。3、一定要詳細(xì)講解觀察時(shí)視野內(nèi)的反差調(diào)節(jié)，提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)效率。4、要提醒學(xué)生要掌握正確的觀察方法，左眼觀測(cè)，右眼用于畫(huà)圖或記錄。養(yǎng)成良好的觀察習(xí)慣。5、要要求學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告繪圖時(shí)必須采用鉛筆。6、 要強(qiáng)調(diào)油鏡護(hù)理的重要性。實(shí)驗(yàn)二 藻類、原生動(dòng)物及微型后生動(dòng)物個(gè)體形態(tài)

4、的觀察（水處理中常見(jiàn)微生物的觀察或活性污泥的觀察）一、 目的要求1 進(jìn)一步熟悉和掌握普通光學(xué)顯微鏡的使用方法。2 掌握生物圖的繪制方法。3 學(xué)習(xí)壓滴法制作標(biāo)本片。二 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容用顯微鏡觀察活性污泥。三 實(shí)驗(yàn)器材1、 實(shí)驗(yàn)室提供的水樣：活性污泥混合液、生物濾池水樣、SBR反應(yīng)器水樣、生物接觸氧化池水樣2、 學(xué)生自取水樣（讓學(xué)生來(lái)實(shí)驗(yàn)室之前自選地點(diǎn)取樣，記錄采樣地點(diǎn)）3、 顯微鏡、吸水紙、擦鏡紙。四 方法步驟1、 用壓滴法制作藻類、原生動(dòng)物和微型后生動(dòng)物的標(biāo)本片。2 、低倍鏡觀察（尋找觀察目標(biāo)）。3 、高倍鏡觀察（選取理想的觀察目標(biāo)）。4 、繪制藻類、原生動(dòng)物和微型后生動(dòng)物的形態(tài)圖。五 結(jié)果與思考

5、1 繪圖記錄觀察結(jié)果藻類觀察放大倍數(shù)原生動(dòng)物觀察 微型后生動(dòng)物觀察放大倍數(shù)放大倍數(shù) 2 你觀察到幾種微生物？來(lái)自不同水樣觀察到的結(jié)果是否不同六、講解時(shí)的注意事項(xiàng)：1、要再一次強(qiáng)調(diào)顯微鏡的正確使用方法。2、再一次強(qiáng)調(diào)反差的作用。3、示范壓滴法制作生物標(biāo)本片的過(guò)程4、結(jié)合課堂內(nèi)容，讓學(xué)生明白使用顯微鏡觀測(cè)活性污泥的意義，鼓勵(lì)學(xué)生多做示范片，多認(rèn)識(shí)幾種原生動(dòng)物等。5、再一次強(qiáng)調(diào)正確的觀察方法。6、再次提醒學(xué)生注意使用鉛筆繪圖。7、提及PFU生物監(jiān)測(cè)法，告訴學(xué)生此為開(kāi)放實(shí)驗(yàn)，有興趣的學(xué)生可以選擇在實(shí)驗(yàn)結(jié)束選做。實(shí)驗(yàn)三、四 微生物細(xì)胞計(jì)數(shù)和大小的測(cè)量一 目的要求1 學(xué)習(xí)掌握血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法

6、。2 學(xué)習(xí)掌握用測(cè)微尺測(cè)量微生物細(xì)胞大小的方法。二 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算酵母菌懸液中，每毫升原液的菌數(shù)。2 用測(cè)微尺測(cè)量生物示范片中微生物的大小。三 實(shí)驗(yàn)器材1 菌種：釀酒酵母。2 儀器及其它：顯微鏡、目鏡測(cè)微尺、鏡臺(tái)測(cè)微尺、血球計(jì)數(shù)板、載玻片、蓋玻片、滴管、吸水紙、各種生物示范片。四 方法步驟（一）微生物顯微鏡直接計(jì)數(shù)法1 制備酵母菌的菌懸液。2 取血球計(jì)數(shù)板一塊，先用眼睛觀察其結(jié)構(gòu)，然后在低倍鏡下觀察計(jì)數(shù)室的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。3 將蓋玻片放在計(jì)數(shù)器的網(wǎng)格上方使之架起。4 用滴管吸取少許搖勻的酵母菌懸液，從蓋玻片的一端注入，使酵母菌懸液滲入兩玻片之間（應(yīng)無(wú)氣泡，蓋玻片不頂浮）。5 將計(jì)數(shù)板水

7、平靜置5分鐘使菌液分布均勻后計(jì)數(shù)，。6 用低倍鏡尋找計(jì)數(shù)器的網(wǎng)格，然后在高倍鏡下按下述原則對(duì)上下兩個(gè)計(jì)數(shù)室內(nèi)的酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。即：采用五點(diǎn)取樣法（2516）或四點(diǎn)計(jì)樣法（1625）各計(jì)上不計(jì)下、計(jì)左下計(jì)右的原則計(jì)數(shù)五個(gè)或四個(gè)中格中的酵母菌數(shù)。7 計(jì)算原菌液中含酵母菌數(shù)每ml原液中含酵母菌數(shù)=兩次計(jì)數(shù)總酵母菌數(shù)/(280)400104稀釋倍數(shù)每ml原液中含酵母菌數(shù)=兩次計(jì)數(shù)總酵母菌數(shù)/(2100)400104稀釋倍數(shù)（二）微生物大小測(cè)定1 目鏡測(cè)微尺的校正（1）目鏡測(cè)微尺裝入目鏡的隔板上，刻度朝下，將鏡臺(tái)測(cè)微尺置于載物臺(tái)上，刻度朝上。（或?qū)в心跨R測(cè)微尺的目鏡頭換上）（2）從目鏡中觀察“目尺”的

8、結(jié)構(gòu)后，用低倍鏡尋找鏡臺(tái)測(cè)微尺（先找黑圈，再稍加移動(dòng)）。（3）移動(dòng)臺(tái)尺和轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使兩尺平行，并把兩測(cè)微尺一端的第一條線完全重疊，然后尋找另一端的一條完全重疊的線。（4）記下兩重疊線之間的格數(shù)，并依下列公式求出校正值。校正值（微米）=兩重疊線間鏡臺(tái)測(cè)微尺的格數(shù)/兩重疊線間目鏡測(cè)微尺的格數(shù)10微米（5）用同樣的方法 ，求出高倍鏡下目鏡微尺的校正值。2 測(cè)量細(xì)菌的大小（6）取下臺(tái)尺，換上生物示范片。（7）在油鏡下測(cè)量每種細(xì)菌的3個(gè)細(xì)胞的大小。五 結(jié)果與思考1 填表：表一 微生物的顯微計(jì)數(shù)（2516）12345小計(jì)總數(shù)細(xì)胞數(shù)/mL1室2室表二 不同物鏡倍數(shù)的校正值物鏡鏡頭鏡臺(tái)測(cè)微尺（格數(shù)）目鏡測(cè)微尺

9、（格數(shù)）校正值低倍鏡高倍鏡油鏡表三 油鏡下細(xì)菌細(xì)胞大小的測(cè)定測(cè)量次數(shù)細(xì)菌名稱測(cè)量參數(shù)目鏡測(cè)微尺（格數(shù)）細(xì)胞實(shí)際大小1球菌直徑桿菌長(zhǎng)寬螺旋菌長(zhǎng)寬2球菌直徑桿菌長(zhǎng)寬螺旋菌長(zhǎng)寬3球菌直徑桿菌長(zhǎng)寬螺旋菌長(zhǎng)寬2 為什么用兩種不同規(guī)格的計(jì)數(shù)板測(cè)同一樣品時(shí)，其結(jié)果一樣？3 目鏡測(cè)微尺在用前為什么要校正？六、講解時(shí)的注意事項(xiàng)1、實(shí)驗(yàn)講解務(wù)必詳盡，不僅要跟學(xué)生講實(shí)驗(yàn)原理，還要講每一步操作的注意事項(xiàng)，比如在利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，如何找到計(jì)數(shù)室所在，利用測(cè)微尺校正時(shí)如和快速在油鏡下找到鏡臺(tái)測(cè)微尺。這樣使學(xué)生的實(shí)驗(yàn)效率提高，可以提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)興趣。2、示范利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，菌液如何添加。3、強(qiáng)調(diào)測(cè)量大小時(shí)校正的原則

10、：邊對(duì)齊，整數(shù)格（不能出現(xiàn)小數(shù)），找最遠(yuǎn)的重合線。計(jì)數(shù)要防止重復(fù)計(jì)數(shù)注意的原則：數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。實(shí)驗(yàn)五 微生物染色法一 目的要求1 學(xué)習(xí)掌握單染色的操作技術(shù)和無(wú)菌操作技術(shù)。2 了解革蘭氏染色機(jī)理，并掌握其操作技術(shù)。二 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 分別以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus.aureus）、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌（E.coli）為材料進(jìn)行革蘭氏染色，并通過(guò)顯微鏡觀察，判斷其反應(yīng)類型。同時(shí)說(shuō)明單染色的操作技術(shù)和無(wú)菌操作技術(shù)。2 學(xué)習(xí)掌握細(xì)菌芽孢染色方法。三 實(shí)驗(yàn)器材1 菌種：枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。2 顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、酒精燈、接種環(huán)、吸水紙、蓋玻片、試管、水

11、浴鍋。3 草酸銨結(jié)晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、0.5%番紅色液、蒸餾水、雙料瓶（香柏油和二甲苯）、5%孔雀綠溶液。四 方法步驟（一）單染色步驟1 涂片：用1%鹽酸清潔玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸餾水，再用無(wú)菌操作的方法挑菌少許于玻片的水中，并充分混勻涂成薄膜。2 干燥：將涂片置火焰高處微熱烘干或自然干燥。3 固定：涂面朝上，通過(guò)微火2-3次。4 染色：待玻片泠卻后加結(jié)晶紫1-2滴于涂片上，覆蓋涂面染色1-2分鐘。5 水洗：傾去染色液，用水自玻片一端輕輕沖洗至流下的水變無(wú)色為止（注：勿沖去菌體）。6 干燥：自然干燥，或用吸水紙吸干。7 鏡檢：油鏡觀察并繪圖。（二）革蘭氏染色步驟1 涂片

12、：取清潔玻片一塊，并滴一滴蒸餾水，將菌種涂布在蒸餾水中。2 干燥與固定：方法同（一）中2，3步驟。3 染色：結(jié)晶紫染色1-2分鐘-水洗-碘液媒染1-2分鐘-水洗-酒精脫色15-20秒-水洗-番紅復(fù)染色2-3分鐘-水洗-干燥-鏡檢記錄。（三）細(xì)菌的芽孢染色1 制備菌液：加1-2滴蒸餾水于試管中，從斜面挑取2-3環(huán)的菌苔于試管中并充分打勻，制成濃稠的菌液。2 加染色液：加5%孔雀綠2-3滴于試管中用接種環(huán)攪拌，使其充分混合。3 加熱：將此試管浸于沸水浴中，加熱15-20分鐘。4 涂片：從試管底部挑菌液于潔凈的玻片上，涂成薄膜，晾干。5 固定：將涂片通過(guò)微火3次。6 脫色：水洗，直到流出的水中無(wú)綠色

13、為止。7 復(fù)染：加番紅染色2-3分鐘后，傾去染色液，不用水洗，直接用吸水紙吸去余水，于酒精燈火焰上烘干。8 鏡檢：用油鏡觀察繪圖。五、結(jié)果與思考1 繪圖記錄觀察結(jié)果（只要求記錄革蘭氏染色結(jié)果）革蘭氏染色放大倍數(shù)_菌種_顏色_屬性_ 革蘭氏染色 放大倍數(shù)_菌種_顏色_屬性_革蘭氏染色 放大倍數(shù)_菌種_顏色_屬性_2 在制作涂片中，為什么要進(jìn)行固定這一步？3 革蘭氏染色中哪一步關(guān)鍵，為什么？六、講解時(shí)的注意事項(xiàng)1、要強(qiáng)調(diào)無(wú)菌操作的重要性。2、示范無(wú)菌操作。3、強(qiáng)調(diào)挑菌、涂片過(guò)程應(yīng)注意事項(xiàng)，挑菌不宜太多。否則涂片太厚4、示范革蘭氏染色全過(guò)程5、強(qiáng)調(diào)酒精脫色的重要性6、強(qiáng)調(diào)涂片必須干燥后才能置于油鏡下

14、觀察實(shí)驗(yàn)六 細(xì)菌淀粉酶和過(guò)氧化氫的定性測(cè)定一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)對(duì)淀粉酶和過(guò)氧化氫的定性測(cè)定，加深對(duì)酶和酶促反應(yīng)的感性認(rèn)識(shí)。二 實(shí)驗(yàn)器材1 藥品及試劑：肉膏胨、淀粉瓊脂培養(yǎng)基1瓶（約50mL）；0.2淀粉溶液1滴瓶、革氏碘液1滴瓶、310過(guò)氧化氫1滴瓶；2 菌種 枯草桿菌和大腸桿菌 其他來(lái)源的細(xì)菌 如土壤懸液3 儀器及其它試管4支、試管架1個(gè)、培養(yǎng)皿2套、接種環(huán)三 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 枯草桿菌培養(yǎng)液中淀粉酶的測(cè)定2 細(xì)菌淀粉酶在固體培養(yǎng)基中的擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)3 過(guò)氧化氫酶的定性測(cè)定四 方法步驟（一）枯草桿菌培養(yǎng)液中淀粉酶的測(cè)定1 取4支干凈的試管，按1、2、3對(duì)照編號(hào)。放在試管架上備用。2 在1、2、3號(hào)試管中分別

15、加入5、10、15mL的枯草桿菌培養(yǎng)液，再在1、2號(hào)試管內(nèi)分別加入10、5mL蒸餾水。在對(duì)照管內(nèi)加入15mL蒸餾水。3 1、2、3號(hào)試管中分別加入0.2淀粉溶液若干滴，迅速搖勻并記下反應(yīng)的初始時(shí)間。4 在以上4個(gè)試管內(nèi)分別滴加若干滴碘液，迅速搖勻，這時(shí)各管均呈藍(lán)色。5 觀察結(jié)果。注意各管的變化，記下各管藍(lán)色完全消失的時(shí)間，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。（二）細(xì)菌淀粉酶在固體培養(yǎng)基中的擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)1 將肉膏胨淀粉瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，待冷至45左右倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)（每皿約10mL），共倒5個(gè)，靜置待冷凝即成平板。2 在無(wú)菌操作條件下，所有的平板在培養(yǎng)皿底部貼好標(biāo)簽后，用接種環(huán)分別挑取枯草桿菌和大腸桿菌分別在2個(gè)平

16、板上點(diǎn)5個(gè)點(diǎn)。再打開(kāi)一個(gè)平板，在空氣中放置30分鐘，蓋上培養(yǎng)皿蓋，剩余的兩個(gè)平板處理如下：一個(gè)接種土壤懸液，另一個(gè)讓學(xué)生用手在平板里氨手印，或取硬幣在平板里按一下，或打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，搖搖頭等，所有平板倒置于37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24-48小時(shí)。3 觀察結(jié)果，取出平板，分別在2個(gè)平板內(nèi)菌落周?chē)渭拥庖海^察菌落周?chē)伾淖兓?。并記錄結(jié)果。（三）過(guò)氧化氫酶的定性測(cè)定1 將配備的枯草桿菌和大腸桿菌斜面各1支放在試管架上。2 用滴管吸取過(guò)氧化氫滴加入兩管菌種斜面上。3 分析結(jié)果，把所觀察到的現(xiàn)象記錄下來(lái)，進(jìn)行分析。五 結(jié)果與思考表一 枯草桿菌培養(yǎng)液中淀粉酶的測(cè)定結(jié)果記錄與分析試管藍(lán)色消失時(shí)間結(jié)果分析對(duì)照管

17、1號(hào)2號(hào)3號(hào)表二 細(xì)菌淀粉酶在固體培養(yǎng)基中的擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄與分析培養(yǎng)皿菌種淀粉酶產(chǎn)生情況結(jié)果分析1號(hào)2號(hào)注：產(chǎn)生記為陽(yáng)性“+”，不產(chǎn)生記為陰性“”。表三 過(guò)氧化氫酶的定性測(cè)定結(jié)果記錄與分析試管菌種過(guò)氧化氫酶有無(wú)結(jié)果分析1號(hào)2號(hào)注：有記為陽(yáng)性“+”，無(wú)記為陰性“”。講解注意事項(xiàng)：1、 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的講解要與理論相結(jié)合，要告訴學(xué)生為什么會(huì)有這種現(xiàn)象發(fā)生。2、 讓學(xué)生對(duì)酶的理解進(jìn)一步加深。啟發(fā)學(xué)生思考淀粉酶是胞內(nèi)酶還是胞外酶，理解不是所有的細(xì)菌都能利用淀粉。注意對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的引申。3、 關(guān)于過(guò)氧化氫酶，要讓學(xué)生思考并理解為什么兩個(gè)菌都是過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)七 培養(yǎng)基的配制和滅菌一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 熟悉玻璃

18、器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備工作。2 掌握培養(yǎng)基和無(wú)菌水的制備方法。3 掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)。二 實(shí)驗(yàn)器材1 藥品及試劑：可溶性淀粉 KNO3 K2HPO43H2O MgSO47H2O FeSO47H2O 1mol/L NaOH 瓊脂2 儀器及其它試管 三角瓶 燒杯 量筒 玻棒 天平 藥匙 高壓蒸汽滅菌鍋 pH試紙(5.5-9.0) 棉花 牛皮紙 記號(hào)筆 麻繩 紗布 干燥箱 培養(yǎng)皿 涂布棒 吸管（1ml） 玻璃珠三 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 分組配制高氏一號(hào)培養(yǎng)基300ml。配方：可溶性淀粉 20g NaCL 0.5g KNO3 1g K2HPO43H2O 0.5g MgSO4*7H2O 0.5g FeSO4*

19、7H2O 0.01g 瓊脂 15-25g 水 1000ml pH 7.4-7.62 每組制備玻璃珠無(wú)菌水(50ml)三角瓶2個(gè)。3 每組制備無(wú)菌水試管(4.5ml/管)10支。4 每組包9cm培養(yǎng)皿24付，6付一包。5 每組包裝1ml吸管5支，玻璃刮鏟4個(gè)。四 方法步驟（一）培養(yǎng)基的制備與分裝1 稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取藥品。可溶性淀粉先用少量熱水溶化后再加入其他成份，補(bǔ)足所需水分，混勻后加入瓊脂。2 熔化：在沸水浴鍋中加熱熔化。3 調(diào)pH：用1N NaOH調(diào)pH至7.4-7.6。4 過(guò)濾：趁熱用多層紗布過(guò)濾（本實(shí)驗(yàn)勿需過(guò)濾）5 分裝：將溶化的固體培養(yǎng)基趁熱加至漏斗上，裝試管時(shí)，裝

20、量不超過(guò)試管的1/4，注意管口不要沾上培養(yǎng)基。6 加棉塞：試管應(yīng)先捆成一捆，然后再于棉塞外包扎牛皮紙，貼上標(biāo)簽，注明培養(yǎng)基名稱、日期、組別。（二）無(wú)菌水的制備7 用量筒量取50ml自來(lái)水于帶玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。8 用5ml吸管取4.5ml水于試管中，塞上棉塞，包扎牛皮紙。（三）器皿的準(zhǔn)備9 培養(yǎng)皿的包裝 每6套一包，用舊報(bào)紙包扎（或放在特制鐵皮圓筒里加蓋扣嚴(yán)）。10 吸管的包裝 首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用長(zhǎng)紙條包扎、打結(jié)。11 玻璃涂布棒的包裝方法同吸管的包裝。（四）培養(yǎng)基、無(wú)菌水、器皿的滅菌12 將培養(yǎng)基、無(wú)菌水放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，濕熱滅菌。13 滅菌完畢，將試管

21、培養(yǎng)基擱成斜面。14 器皿放入干熱滅菌箱內(nèi)，加熱滅菌。五 思考題1 培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng)菌是無(wú)菌的？2 加壓蒸汽滅菌的原理是什么？是否只要壓力表上的指針指到所需的壓力時(shí)就能達(dá)到所需滅菌溫度？為什么？3 干熱滅菌應(yīng)該注意哪些事項(xiàng)？4 管口、瓶口為什么要用棉塞？能否用木塞或棉皮塞代替？為什么？六、講解注意事項(xiàng)1、提問(wèn)學(xué)生什么是培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌告訴學(xué)生如何檢查滅菌后的培養(yǎng)菌是無(wú)菌的。2、講解滅菌的機(jī)理以及適應(yīng)干熱滅菌和適宜濕熱滅菌的物品3、強(qiáng)調(diào)滅菌時(shí)的注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)八 細(xì)菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥

22、、垃圾、堆肥等）中分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，從而獲得若干種細(xì)菌純種培養(yǎng)技能。2 掌握幾種接種技術(shù)。二 實(shí)驗(yàn)器材1 無(wú)菌培養(yǎng)皿10套、無(wú)菌移液管1mL2支、10mL1支2 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1瓶、土壤10克、湖水1瓶、無(wú)菌稀釋水90mL、9mL的5管三 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容（一）細(xì)菌純種分離的操作方法1 稀釋平板分離法2 平板劃線分離法（二）幾種接種操作技術(shù)1 斜面接種技術(shù)2 穿刺接種技術(shù)3 稀釋平板涂布法四 方法步驟（一）細(xì)菌純種分離的操作方法1 稀釋平板分離法1）取樣用無(wú)菌錐形瓶到現(xiàn)場(chǎng)取一定量的土壤、湖水迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。2）稀釋水樣用無(wú)菌移液管取好梯度稀釋水樣。3）平板的制作用無(wú)菌移液管將各稀釋水樣加入各融化的培

23、養(yǎng)基內(nèi)，制成稀釋平板。2 平板劃線分離法1）平板的制作將融化的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成平板。2）操作只取一次樣，按不同方法進(jìn)行劃線。（二）幾種接種操作技術(shù)1 斜面接種技術(shù)將長(zhǎng)在斜面培養(yǎng)基（或平板培養(yǎng)基）上的微生物接到另一支斜面培養(yǎng)基上。2 穿刺接種技術(shù)將斜面菌種接種到半固體深層培養(yǎng)基。3 稀釋平板涂布法把聚集在一起的群體分散成能在培養(yǎng)基上長(zhǎng)成單個(gè)菌落。五 思考題1 用一根無(wú)菌移液管接種幾種濃度的水樣時(shí)，應(yīng)從哪個(gè)濃度開(kāi)始？為什么？六、講解時(shí)的注意事項(xiàng)1、讓學(xué)生明白為什么在菌種分離時(shí)要做稀釋。2、讓學(xué)生明白理解并掌握什么是倒平板，什么是稀釋平板分離法，什么是平板畫(huà)線分離法，什么是稀釋平板涂布法等經(jīng)典的微生物分離的方法。3、理論聯(lián)系實(shí)際，啟發(fā)學(xué)生用所學(xué)的分離細(xì)菌的方法設(shè)計(jì)一個(gè)分離具有某種功能的細(xì)菌。讓學(xué)生理解選擇性壓力法分離細(xì)菌的作用，富集培養(yǎng)基的應(yīng)用等。實(shí)驗(yàn)九 純培養(yǎng)菌種的菌體、菌落形態(tài)的觀察一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察上一實(shí)驗(yàn)分離出來(lái)的幾種細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)及與其相應(yīng)的菌落形態(tài)特征。通過(guò)觀察比較細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌的菌落特征，達(dá)到初步鑒別上述微生物的能力。二 實(shí)驗(yàn)器材1 顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈2 上一實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)出的各種細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)室配給放線菌、酵母菌及霉菌3 革蘭