結(jié)核分枝桿菌(1)

1、一、 生物學(xué)性狀 形態(tài)與染色結(jié)核分枝桿菌為細(xì)長略帶彎曲的桿菌，大小14X0.4m。牛分枝桿菌則比較粗短。分枝桿菌屬的細(xì)菌細(xì)胞壁脂質(zhì)含量較高，約占干重的60%，特別是有大量分枝菌酸包圍在肽聚糖層的外面，可影響染料的穿入。 分群（Mitchson假說） A菌群：快速繁殖，巨噬細(xì)胞外和肺空洞干酪液化部分； B菌群：半靜止?fàn)顟B(tài)，巨噬細(xì)胞內(nèi)和空洞璧壞死組織中； C菌群：半靜止?fàn)顟B(tài)，可突然間歇生長。 D菌群：休眠狀態(tài)，不繁殖，數(shù)量很少。染色 分枝桿菌一般用齊尼（Ziehl- Neelsen)抗酸染色法，以5% 石炭酸復(fù)紅加溫染色后可以染上，但用3%鹽酸乙醇不易脫色。若再加用美藍復(fù)染，則分枝桿菌呈紅色，而其

2、他細(xì)菌和背景中的物質(zhì)為藍色。 培養(yǎng)特性 專性需氧。最適溫度為37，低于30不生長。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的脂質(zhì)含量較高，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，故生長緩慢。在一般培養(yǎng)基中每分裂1代需時1824h，營養(yǎng)豐富時只需5h。 常用的有羅氏（Lowenstein-Jensen）固體培養(yǎng)基，內(nèi)含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機鹽和孔雀綠等?？兹妇G可抑制雜菌生長，便于分離和長期培養(yǎng)。蛋黃含脂質(zhì)生長因子，能刺激生長。根據(jù)接種菌多少，一般24周可見菌落生長。菌落呈顆粒、結(jié)節(jié)或花菜狀，乳白色或米黃色，不透明。抵抗力 結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中含有脂質(zhì)，故對乙醇敏感，在70%乙醇中2min死亡。此外，脂質(zhì)可防止菌體水分丟失，故對干燥的抵

3、抗力特別強。粘附在塵埃上保持傳染性810d，在干燥痰內(nèi)可存活68個月。結(jié)核分枝桿菌對濕熱敏感，在液體中加熱626315min或煮沸即被殺死。結(jié)核分枝桿菌對紫外線敏感。直接日光照射數(shù)小時可被殺死，可用于結(jié)核患者衣服、書籍等的消毒。 耐藥性 在固體培養(yǎng)基中對常用的含異煙肼1mg、鏈霉素10mg、利福平50mg能生長的結(jié)核分枝桿菌為耐藥菌。耐藥菌株毒力有所減弱。異煙肼可影響細(xì)胞壁中分枝菌酸的合成，誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌成為L型,此可能是耐異煙肼的一種原因。藥物敏感試驗表明對異煙肼耐藥，而對利福平和鏈霉素大多仍敏感。二、致病性 結(jié)核分枝桿菌不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素。其致病性可能與細(xì)菌在組織細(xì)胞內(nèi)大量繁殖引起的炎癥，

4、菌體成分和代謝物質(zhì)的毒性以及機體對菌體成分產(chǎn)生的免疫損傷有關(guān)。 致病物質(zhì)與莢膜、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)有關(guān)。莢膜 莢膜的主要成分為多糖，部分脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。其對結(jié)核分枝桿菌的作用有： 莢膜能與吞噬細(xì)胞表面的補體受體3結(jié)合，有助于結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞上的粘附與入侵； 莢膜中有多種酶可降解宿主組織中的大分子物質(zhì)，供入侵的結(jié)核分枝桿菌繁殖所需的營養(yǎng)； 莢膜能防止宿主的有害物質(zhì)進入結(jié)核分枝桿菌，甚至如小分子NaOH也不易進入。 故結(jié)核標(biāo)本用4% NaOH消化時，一般細(xì)菌很快殺死，但結(jié)核分枝桿菌可耐受數(shù)十分鐘。結(jié)核分枝桿菌入侵后莢膜還可抑制吞噬體與溶酶體的融合。脂質(zhì) 據(jù)實驗研究細(xì)菌毒力可能與其所含復(fù)雜的脂質(zhì)成分有

5、關(guān)，特別是糖脂更為重要。 索狀因子 ： 是分枝菌酸和海藻糖結(jié)合的一種糖脂。能使細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中呈蜿蜒索狀排列。此因子與結(jié)核分枝桿菌毒力密切相關(guān)。它能破壞細(xì)胞線粒體膜，影響細(xì)胞呼吸，抑制白細(xì)胞游走和引起慢性肉芽腫。若將其從細(xì)菌中提出，則細(xì)菌喪失毒力。 磷脂：能促使單核細(xì)胞增生，并使炎癥灶中的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)轭惿掀ぜ?xì)胞，從而形成結(jié)核結(jié)節(jié)。 硫酸腦苷脂：可抑制吞噬細(xì)胞中吞噬體與溶酶體的結(jié)合，使結(jié)核分枝桿菌能在吞噬細(xì)胞中長期存活。 蠟質(zhì)D:是一種肽糖脂和分枝菌酸的復(fù)合物，可從有毒株或卡介苗中用甲醇提出，具有佐劑作用，可激發(fā)機體產(chǎn)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)。蛋白質(zhì) 有抗原性，和蠟質(zhì)D結(jié)合后能使機體發(fā)生超敏反應(yīng)，引

6、起組織壞死和全身中毒癥狀，并在形成結(jié)核結(jié)節(jié)中發(fā)揮一定作用。免疫性 免疫機制結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)感染菌，其免疫主要是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。T細(xì)胞不能直接和胞內(nèi)菌作用，必須先與感染細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞崩潰，釋放出結(jié)核分枝桿菌。機體對結(jié)核分枝桿菌雖能產(chǎn)生抗體，但抗體只能與釋出的細(xì)菌接觸起輔助作用。 結(jié)核分枝桿菌侵入呼吸道后，由于肺泡中80%90% 是巨噬細(xì)胞，10% 是淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞占多數(shù)）；原肺泡中未活化的巨噬細(xì)胞抗菌活性弱，不能防止所吞噬的結(jié)核分枝桿菌生長，反可將結(jié)核分枝桿菌帶到他處。但可遞呈抗原，使周圍T淋巴細(xì)胞致敏。 致敏淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生多種淋巴因子，如IL-2、IL-6、INF- ，他們與T

7、NF-的共同作用可殺死病灶中的結(jié)核分枝桿菌。淋巴因子中INF- 是主要的，有多種細(xì)胞能產(chǎn)生INF- ，浸潤的先后為NK、Ts/Th和CD4+、CD8+/T細(xì)胞。上述細(xì)胞有的可直接殺傷靶細(xì)胞，有的產(chǎn)生淋巴因子激活巨噬細(xì)胞，使吞噬作用加強引起呼吸暴發(fā)，導(dǎo)致活性氧中介物和活性氮中介物的產(chǎn)生而將病菌殺死。 結(jié)核的免疫屬于感染免疫(infection immunity)，又稱有菌免疫，即只有當(dāng)結(jié)核分枝桿菌或其組分存在體內(nèi)時才有免疫力。一旦體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌或其組分全部消失，免疫也隨之不存在。 隨著機體對結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生保護作用的同時，也可以看到有遲發(fā)型超敏反應(yīng)的產(chǎn)生，二者均為T細(xì)胞介導(dǎo)。 近來研究表明結(jié)

8、核分枝桿菌誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫和超敏反應(yīng)的物質(zhì)不同。超敏反應(yīng)主要由結(jié)核菌素蛋白和蠟質(zhì)共同引起，而免疫則由結(jié)核分枝桿菌核糖體RNA引起。二種不同抗原成分激活不同的T細(xì)胞亞群釋放出不同的淋巴因子所致。結(jié)核菌素試驗 結(jié)核菌素試驗是應(yīng)用結(jié)核菌素進行皮膚試驗來測定機體對結(jié)核分枝桿菌是否能引起超敏反應(yīng)的一種試驗。1.結(jié)核菌素試劑：舊結(jié)核菌素：系將結(jié)核分枝桿菌接種于甘油肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)48周后加熱濃縮過濾制成。稀釋2 000倍，每0.1ml含5u。目前都用純蛋白衍化物，PPD有二種：人結(jié)核分枝桿菌制成的PPD-C和卡介苗制成的BCG-PPD。每0.1ml含5u。 2.試驗方法與意義：常規(guī)試驗分別取2種PPD 5

9、個單位注射兩前臂皮內(nèi)，4872h后: 硬結(jié)4mm者為陰性； 5-9mm為弱陽性； 10-19mm為陽性； 20mm或雖20mm，但局部出現(xiàn)水泡和淋巴管炎，為強陽性。 若PPD-C側(cè)紅腫大于BCG-PPD側(cè)為感染。反之，BCG-PPD側(cè)大于PPD-C側(cè)，可能系卡介苗接種所致。 陰性反應(yīng)表明未感染過結(jié)核分枝桿菌，但應(yīng)考慮以下情況： 感染初期，因結(jié)核分枝桿菌感染后需4周以上才能出現(xiàn)超敏反應(yīng) 老年人 嚴(yán)重結(jié)核患者或患有其他傳染病，如麻疹，水痘導(dǎo)致的細(xì)胞免疫低下 獲得性細(xì)胞免疫低下，如艾滋病或腫瘤等用過免疫抑制劑者。 涂片法 抗酸桿菌（）：連續(xù)觀察300視野未發(fā)現(xiàn)； 抗酸桿菌（）：連續(xù)觀察300視野發(fā)現(xiàn)

10、1-3條; 抗酸桿菌（1）：1-9條/100視野 抗酸桿菌（2）：1-9條/10視野 抗酸桿菌（3）：1-9條/1視野 抗酸桿菌（4）：10條/1視野濃縮集菌 先集菌后檢查，可提高檢出率。培養(yǎng)與動物試驗也必須經(jīng)集菌過程以除去雜菌。腦脊液和胸、腹水無雜菌，可直接離心沉淀集菌。痰、支氣管灌洗液、尿、糞等污染標(biāo)本需經(jīng)4% NaOH（痰和堿的比例為1:4,尿、支氣管灌洗液和堿的比例為1:1）處理15min，時間過長易使結(jié)核分枝桿菌L型與非結(jié)核分枝桿菌死亡。尿標(biāo)本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于錐形量筒內(nèi)靜置，取沉淀物處理。處理后的材料再離心沉淀。取沉淀物作涂片染色鏡檢。若需進一步作培養(yǎng)或動物接種，應(yīng)先用酸中和后再離心沉淀。 培養(yǎng) 羅氏培養(yǎng)基，一般需2-6周，陽性結(jié)果隨時報告，8周無菌生長，報為陰性結(jié)果，陽性結(jié)果按生長菌落占斜面1/4,1/2,3/4和全部劃分1+到4+快速診斷 一般涂片檢查菌數(shù)需5x1034/ml,培養(yǎng)需1x102/ml,標(biāo)本中菌數(shù)少于此數(shù)時不易獲得陽性結(jié)果，且培養(yǎng)需時較長。目前已將多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增技術(shù)應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌DNA鑒定，每ml中只需含幾個細(xì)菌即可獲得陽性，且1-2d得出結(jié)果。操作中需注意實驗器材的污染問題，以免出現(xiàn)假陽性。細(xì)菌L型由于缺壁并有代償性細(xì)胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使細(xì)胞膜破裂釋出DNA，以致造成PCR假陰性。用組織