精子中組蛋白甲基化調(diào)控的紊亂將通過隔代遺傳給子代造成損傷

1、精子中組蛋白甲基化調(diào)控的紊亂將通過隔代遺傳給子代造成損傷Keith Siklenka, Serap Erkek, Maren Godmann, Romain Lambrot, Serge McGraw,Christine Lafleur, Tamara Cohen, Jianguo Xia, Matthew Suderman, Michael Hallett,Jacquetta Trasler, Antoine H. F. M. Peters,* Sarah Kimmins*前言：盡管，父本也為胚胎貢獻一半的遺傳信息，但胚胎的起始健康狀態(tài)的關(guān)注點在母本。父本效應(yīng)被認為與一些癌癥，糖尿病，肥胖等

2、復(fù)雜的疾病相關(guān)。這些疾病發(fā)病率皆上升，而僅靠基因不能解釋這種現(xiàn)象，這啟示通過非基因遺傳的表觀遺傳可能對于疾病的傳染具有重要作用。表觀遺傳體系包括DNA甲基化修飾，組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾，非編碼RNA。基于人類和動物的研究表明，表觀遺傳可能在環(huán)境誘導(dǎo)的表觀特征在子代的遺傳中具有重要作用。這些表觀特征在第一，二子代中，與改變基因的表達和組織的功能相關(guān)聯(lián)，分別稱為代間和隔代遺傳?；诖祟惖母副颈碛^遺傳的的機制并不清楚?；驹恚壕拥陌l(fā)生包括細胞快速分裂，特定的轉(zhuǎn)錄程序，產(chǎn)生具有高度凝聚染色體的泳動細胞。與精子核高度一致，極少的組蛋白的滯留暗示它對發(fā)育的作用。盡管是表觀遺傳的重點，但DNA 甲基化在父本的

3、表觀遺傳中的作用依舊不清楚。只要在精子的CpG富集的區(qū)域所發(fā)生的微小的DNA甲基化修飾改變已證明與環(huán)境誘導(dǎo)的表觀特征的遺傳有關(guān)。取而代之的是，在涉及精子中組蛋白或RNA狀態(tài)的改變的父本表觀遺傳中，這可能存在一種聯(lián)合作用的分子機制。精子中組蛋白的功能和修飾在胚胎發(fā)育，子代健康和表觀遺傳是不清楚的。通過在小鼠精子發(fā)生期過表達人類去除KDM1A組蛋白的第四個氨基酸的甲基化的去甲基化酶，我們培育出了精子發(fā)育相關(guān)基因中CpG 島H3K4me2減少的小鼠模型，我們研究了其子代的發(fā)育和健康狀態(tài)。結(jié)果：雄性的轉(zhuǎn)基因子代小鼠與C57BL/6品系的雌鼠雜交，培育出實驗用的雜合轉(zhuǎn)基因(TG)和非基因改造的(nonT

4、G)的子代。每代中(TG)和(nonTG)分別與57BL/6品系的雌鼠雜交，并研究其子代的代間遺傳和隔代遺傳效應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)在一代中KDM1A的過表達嚴重損傷了其發(fā)育和其子代的存活。在缺少KDM1A表達的種系中，這中缺陷一直遺傳了兩代。我們檢測了轉(zhuǎn)基因(TG)和非基因改造的(nonTG)的子代的組蛋白和DNA甲基化狀態(tài)。KDM1A的過表達導(dǎo)致了超過2300 個基因的H3K4me2的缺失，其中包含了許多發(fā)育相關(guān)的基因。不同于其他父本的轉(zhuǎn)基因遺傳案例，我們沒有在精子中看到CpG 富集區(qū)域的的DNA甲基化的改變。相反，在轉(zhuǎn)基因(TG)和非基因改造的(nonTG)的后代，它們子代及其二細胞期，我們檢測到

5、它們的RNA量發(fā)生顯著而相似的變化。在子代中這些表達水平的改變和所觀察到的異常表型與在精子中組蛋白的甲基化水平的改變相關(guān)聯(lián)。這些研究證明，在精子發(fā)生期KDM1A對子代有主要啟發(fā)性的作用，并參與組蛋白的甲基化，精子RNA作為一個潛在的轉(zhuǎn)基因遺傳的中介。我們的數(shù)據(jù)強調(diào)轉(zhuǎn)基因表觀遺傳的的復(fù)雜性，這可能涉及多種分子，包括在精子發(fā)生期不同染色體狀態(tài)的形成和精子形成RNA。結(jié)論：精子發(fā)生期準(zhǔn)確的組蛋白甲基化對于跨世代的子代發(fā)育和存活具有重要作用。這些發(fā)現(xiàn)證明，組蛋白的甲基化可為解釋父本的表觀遺傳的潛在分子機制。由環(huán)境誘導(dǎo)的組蛋白的修飾可能改變胚胎的發(fā)育進程，導(dǎo)致復(fù)雜疾病的時代遺傳。一個必須的步驟就是建立功

6、能和環(huán)境壓力的聯(lián)系，精子表觀遺傳學(xué)組的圖譜，子代中基因表達改變的影響和代謝過程?；诘皆絹碓蕉嗟淖C據(jù)，我們很快將得出一個合理結(jié)論：未來的父親保護器他們精子的表觀基因組父親的一生的經(jīng)歷可以傳給其子代而影響其發(fā)育。但是，這種基于表觀遺傳的傳遞機制并不清楚。不像體細胞，在精子中幾乎沒有核小體，且其表觀遺傳的功能并不清楚。我們培育出一種過表達H3K4的去甲基化酶KDM1A（也叫LSD1）的小鼠，這種酶在精子發(fā)生期可以減少產(chǎn)生的精子中H3K4的二甲基化。過表達的KDM1A一代會出現(xiàn)子代的發(fā)育和存活嚴重受損。這中缺陷會持續(xù)的出現(xiàn)在KDM1A缺陷的品系中，且在精子和子代中，伴隨相關(guān)的RNA譜系的改變。我們研

7、究表示在發(fā)育的精子中，組蛋白的去甲基化可激活異常發(fā)育的表觀遺傳，而沒有CpG富集區(qū)DNA甲基化的改變。在人類嬰兒中有3%出生時伴有缺陷，這種缺陷可以由遺傳因子或環(huán)境壓力引起，盡管這其中有50%是先天引起的。盡管父親也給子代貢獻了一半的遺傳物質(zhì)及可能的一些表觀遺傳信息，但這方面的預(yù)防工作的重點卻在母親。基于人類和動物學(xué)實驗表明表觀遺傳機制可能在由環(huán)境誘導(dǎo)的表觀特征的遺傳中起作用(38)。這種表觀特征已與子一代 、二代或三代的基因表達和組織功能的改變相關(guān)(38)。基于世代數(shù)和父源，這種現(xiàn)象與代間和隔代表觀遺傳(Fig.1)。母本和父本的這類效應(yīng)的遺傳與生殖細胞的DNA甲基化改變有關(guān)(7, 911)

8、。在精子中，在基因啟動子DNA的甲基化并不普遍，但是重復(fù)元件多被甲基化(1315)。盡管DNA的甲基化修飾研究是表觀遺傳研究的重點，但在父本的表觀遺傳中，它的重要性并不清楚。絕大多數(shù)研究報道，在精子中CpG富集區(qū)只要較少的發(fā)生DNA甲基化，CpG富集區(qū)通常認為與環(huán)境誘導(dǎo)的表觀特征的遺傳相關(guān)聯(lián)(5, 7, 8, 10, 11)。父本的世代表觀遺傳也許與組蛋白的狀態(tài)、RNA或精子中其他成分的改變相關(guān)。在精子形成的最后階段，染色質(zhì)經(jīng)歷了大規(guī)模的重塑，精子中特異的魚精蛋白取代大部分的組蛋白，這對精子核產(chǎn)生了廣泛的影響(20)。盡管如此，只要小部分的組蛋白（小鼠中約1%，人中約15%）保留在成熟的精子中

9、。最近幾項研究鑒定了小鼠和人的精子核小體在整個基因組的分布，但結(jié)果有部分不統(tǒng)一，這同Saitouan 和Kurimoto的綜述中表述相一致 (22)。利用一種有效的方法打開高度凝集的小鼠精子核，接著用微球菌核酸酶消化和深度測序，我們觀察到接近10倍比例的序列定位于與核小體關(guān)聯(lián)的DNA上CpG富集的啟動子序列。在小鼠精子中組蛋白的保留是可預(yù)測的，主要發(fā)生于高CpG密度區(qū)和地DNA甲基化密度區(qū)，比如看家基因和發(fā)育調(diào)控基因。在未甲基化的CGIs區(qū)的保留在小鼠和人中是保守的。在精子中，看家基因的啟動子中保留組蛋白變體H3.3，被H3K4二和三甲基化標(biāo)記。相對的，精子中發(fā)育調(diào)控基因的啟動子包含H3.3和

10、經(jīng)典的H3.1/H3.2，被H3K27標(biāo)記。在胚胎發(fā)育，子代健康和表觀遺傳中，精子中組蛋白的功能和發(fā)生的修飾大部分并不了解。在Caenorhabditis elegans中，H3K4me2去甲基化酶的缺失與代間的表型有關(guān)，H3K4me2在原生殖細胞的穩(wěn)定積累有效促使不孕。鼠源中賴氨酸的去甲基化酶Kdm1a，通過催化主要的單和二甲基化的H3K4的去除來調(diào)控基因的表達及發(fā)育。為研究在精子中滯留組蛋白對于胚胎發(fā)育和代間的表觀遺傳的作用，我們靶向H3K4的甲基化，它是與精子中發(fā)育基因相關(guān)的表觀標(biāo)記。我們致力于培育出這樣的小鼠模型，它可產(chǎn)生參與發(fā)育基因的CGIs 區(qū)的H3K4me2減少的精子。為達到這個

11、目標(biāo)，我們在小鼠的精子的發(fā)生期過表達了人KDM1A H3K4去甲基化酶，并研究了子代的發(fā)育和適應(yīng)性。由雜合子轉(zhuǎn)基因的父代產(chǎn)生的父代和非轉(zhuǎn)基因的子代中出生的缺陷率，嬰兒死亡率及基因表達改變率都上升。我們鑒定了轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因雄性子代的精子組蛋白和DNA甲基化狀態(tài)。過表達KDM1A基因與超過2300個基因的H3K4me2 特異丟失有關(guān)，包括一些發(fā)育調(diào)控基因。不同于其他父系的代間遺傳案例，我們沒有觀察到精子的CpG富集區(qū)的DNA甲基化的改變。相反，我們檢測到在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因子代精子中的RNA轉(zhuǎn)錄物存在穩(wěn)定相似的改變，在子代的二細胞期也有同樣發(fā)現(xiàn)。在子代中所觀察到的表達水平的改變和表型異常與精子中組蛋

12、白甲基化水平的改變相關(guān)聯(lián)。該研究證明精子中KDM1A活性和相關(guān)組蛋白甲基化的減少會給子代帶來災(zāi)難性的后果。另外，我們研究表明組蛋白的甲基化和精子RNA為代間遺傳的潛在中介分子。結(jié)果轉(zhuǎn)染到雄性小鼠生殖細胞系中的KDM1A基因特異性地過表達我們培育了兩種轉(zhuǎn)基因的小鼠細胞系，即在生殖腺特異表達、截短的人源多聚肽鏈延伸因子的啟動子調(diào)控下，特異表達人KDM1A H4K去甲基化酶。這個啟動子在睪丸生殖細胞中很活躍但在其他組織就不活躍。轉(zhuǎn)入的KDM1A的mRNA出現(xiàn)于精原細胞和精母細胞中，在精子附近的轉(zhuǎn)錄水平低。同時觀察到轉(zhuǎn)基因標(biāo)記綠色熒光蛋白也有相似的分布。兩種品系的子代的睪丸組織病理學(xué)評定揭示，在，從第

13、一期精子發(fā)生期到成年的所有年齡段精子的發(fā)生皆正常。同樣地，基本未影響睪丸和附睪重量及精子數(shù)。為了評估DNA的完整性，我們模擬了gH2AX的磷酸化，利用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷的三磷酸化缺口末端標(biāo)記(TUNEL) 來測定DNA的損害。在轉(zhuǎn)基因和對照動物的精原細胞、靜母細胞和精子細胞中，磷酸化的H2AX在細胞內(nèi)的分布是不同的。但我們并沒有在轉(zhuǎn)基因雄鼠檢測到TUNEL陽性細胞數(shù)的增加。最后，在轉(zhuǎn)基因、非轉(zhuǎn)基因和對照組中LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)坐子的表達并無差異?？偠灾?，這些數(shù)據(jù)表明KDM1A的表達不誘導(dǎo)DNA損傷或基因組的不穩(wěn)定性。在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因雄性產(chǎn)生的子代中代間遺傳的父本效應(yīng)我們繁育

14、了TG和非TG的雄性，檢測在過表達KDM1A健康子代中可能存在的代間和隔代遺傳的父本效應(yīng)。家系和世代圖如Fig. 2.所示。雄性的轉(zhuǎn)基因子代與C57BL/6磁性鼠雜交，培育出雜合子TG和非TG的子群。從TG二代到底四代和非TG3代到第五代的雄鼠皆與C57BL/6雌鼠雜交，子代用于研究代間和隔代遺傳效應(yīng)。首先，我們分析了多代TG和非TG的雄性幼崽的發(fā)育和存活情況，我們我們檢測了出生一窩的數(shù)量、重量和性別，并檢測了幼崽出生36和48h及出生后6和21天的小鼠。與對照組C57BL/6相比，由TG2-4和非TG3代中雄性產(chǎn)生的子代的嬰兒存活率下降了。我們觀測到轉(zhuǎn)基因表達對存活力的積累效應(yīng)：由于連續(xù)世代

15、的精子都處于轉(zhuǎn)基因的壓力下，在兩種品系中轉(zhuǎn)基因子代的存活率皆下降。我們也觀察到幼崽中四肢、骨骼和皮膚異常和發(fā)育不全者。單個雄性所產(chǎn)生的子代分析表明，上述所產(chǎn)生的現(xiàn)象并不是由少數(shù)雄性父本傳給子代的異常造成，而是由許多雄性父本將表觀遺傳的改變傳給了不同的子代。而且，子代嬰兒的存活和異常率與子代是否從轉(zhuǎn)基因父本獲得的轉(zhuǎn)基因無關(guān)聯(lián)。在單倍體的精子的表觀基因組中可能發(fā)生的頻率并不攜帶真正的轉(zhuǎn)基因，這可能是由于在TG雜合子雄性中，KDM1A在精子發(fā)生期不同階段的生殖細胞中表達活躍，如在二倍體的精原細胞精母細胞。而且，即便在兩次減數(shù)分裂之后，由于不完全的有絲分裂和減數(shù)分裂，單倍體的精子通過細胞間的連接分享m

16、RNAs。結(jié)果，盡管只有50%的精子中的轉(zhuǎn)入基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄，但所有的單倍體精子在細胞多核期皆受到了影響。由于轉(zhuǎn)基因的表達限定于發(fā)育的生殖系中，非TG雄性子代在發(fā)育的精子中并不表達轉(zhuǎn)入的基因，這些數(shù)據(jù)表明在非TG幼崽中觀察到的遺傳表型與世代的表觀遺傳現(xiàn)象有關(guān)。C57BL/6母本可能踢出一些它們認為異常的幼崽，我們也許低測了被測幼崽中表型異常率。為了解決這種可能性和進一步鑒定在世代中的發(fā)育缺陷，我們對底18.5天的胚胎進行了詳細的表型發(fā)育分析。每代的轉(zhuǎn)基因TG2-4(F0to F2)和TG3-5(F1to F3)雄性與至少兩只磁性交配，用測定的窩崽數(shù)、植入前后的損失及異常的幼崽來評估懷孕數(shù)。TG產(chǎn)生

17、的子代中，異常者各不相同，且被多個系統(tǒng)影響。發(fā)育錯誤案例有骨骼異常,其包括前后指畸形、脊柱缺陷、露骨結(jié)構(gòu)異常、四肢和體節(jié)發(fā)育失敗。同樣，在由非TG3和非TG4產(chǎn)生的子代群中，F(xiàn)2和 F3子代中，與對照組對比，我們觀察到明顯更高頻率可見異常和骨骼缺陷。在F3子代（由非TG父系產(chǎn)生）中的異常者代表代間遺傳效應(yīng)。在幾代TG和非TG中，妊娠丟失發(fā)生率增加。由非TG5雄性產(chǎn)生的F4子代在18.5天胚胎期未觀察到可見異常。為進一步及鑒定股價缺陷的特異性屬性和確定在非TG子代所觀察到的結(jié)果，特異分析一系列子代的骨架異常。這些分析表明在TG和非TG子代中皆存在成骨出錯、脊柱缺陷、顱骨缺失或異常。，我們的骨架分

18、析確定，由非TG5雄性產(chǎn)生的F4子代中出現(xiàn)了發(fā)育異常的稀釋現(xiàn)象。因此，在轉(zhuǎn)基因壓力下，經(jīng)過三代，對可檢測到的出生缺陷，在我們的分析中觀察到了子代表型正常的正?；５?，我們可能低測了子代的異常數(shù)，也未進行深入的病理學(xué)分析，異常數(shù)僅限定與在子代中可觀察到的缺陷和骨架分析。轉(zhuǎn)入的KDM1A的表達改變了精子H3K4二甲基化為將在子代中產(chǎn)生的發(fā)育缺陷和父本中精子的染色質(zhì)可能發(fā)生的改變相關(guān)聯(lián)，利用先前提到的由于分析特異研究精子中高度凝聚染色體方法，我們研究了KDM1A靶標(biāo)H3K4me2在TG3雄性精子中、同窩出生仔畜和年齡相一致的對照組中在基因組水平的作用。我們用微球菌核酶消化的核小體，再用H3K4me

19、2特異性抗體進行了ChIP，接著進行了ChIP-seq。在閱讀-基數(shù)-標(biāo)準(zhǔn)化的文庫中，與對照組相比，我們觀察到在TG3的精子的不同基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)區(qū)域的CpG序列H3K4me2豐度的減少。為了鑒定發(fā)生H3K4me2改變的 (TSS)區(qū)在基因組水平的作用，我們估算出了在不同精子樣本中在基因組水平圍繞TSS上下游250bpH3K4me2的豐度.因為我們已經(jīng)展示了核小體在小鼠精子CpG富集序列的保留，在精子中，與最高核小體占有量區(qū)域相一致，且最有可能將任一編碼的組蛋白的信息傳給子代。在TG3樣品中，8171被H3K4me2標(biāo)記的TSS區(qū)域中有28.7%發(fā)生了H3K4me2水平的減少，但是

20、有3.4%的區(qū)域表現(xiàn)出溫和的上升。H3K4me2主要的下調(diào)與已經(jīng)報道的H3K4me2的去甲基化酶H3K4me2活性一致。核小體關(guān)聯(lián)的DNA直接測序并沒有顯示在TG3精子有不同水平H3K4me2的TSS區(qū)域核小體占有情況的不同，也沒有顯示出TG3和非TG3小鼠及對照組小鼠一窩幼崽數(shù)量上的差異。這些結(jié)果排除了在TG3精子的某一位點上H3K4me2的減少情況下，核小體滯留會是引起的損傷原因。為了驗證基于特定TSS的H3K4me2水平減少的假設(shè)，我們根據(jù)CpG的密度和不同的染色質(zhì)分布，比如組蛋白變體H3.3的占有率和H3K4me3及H3K27me3的水平，對這些區(qū)域進行了分類，同樣也對對照組的精子進行

21、了測量；這些分布與特異基因的功能相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)，H3K4me2減少的區(qū)域都是CpG富集區(qū)，這些表明人的KDM1A的靶標(biāo)與CpG密度相關(guān)。內(nèi)源性的鼠科動物的Kdm1a特異定位于小鼠精子的TSS區(qū)高密度的CpG區(qū)。而且，在TG3精子中，與H3K4me2水平未發(fā)生改變的區(qū)域相比，H3K4me2水平減少的區(qū)域鼠科Kdm1a的占有水平更高。這項發(fā)現(xiàn)指出，人源的KDM1a特異靶標(biāo)于內(nèi)源鼠科KDM1a的特異位點上。以上數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)入的人源KDM1A靶標(biāo)于這些選擇區(qū)域，這些區(qū)域在精子發(fā)生期與內(nèi)源的鼠科KDM1a廣泛相關(guān)。就如在對照組測定的一樣，H3K4me2減少的TSS區(qū)域與H3.3強烈相關(guān)。因為在精子中強C

22、GIs的高水平的H3.3與染色質(zhì)高頻率的核小體的轉(zhuǎn)換的一致，在強CGI啟動子H3K4me2 水平的減少也許反應(yīng)了H3K4組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶不能消除TG授予的KDM1A作用，因此在TG3雄性精子核小體轉(zhuǎn)換過程中未能重建H3K4me2的狀態(tài)。同源基因分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入的基因KDM1A調(diào)控一群特異的基因。在TG3雄性中，發(fā)生H3K4me2 減少，而H3K4me3高度介導(dǎo)的染色質(zhì)的基因在不同的胞內(nèi)蛋白代謝過程中具有重要功能。例如，在TG3精子中，在Pdpk1和E2F6上看到H3K4me2的減少。在胰腺中Pdpk1的消除導(dǎo)致了糖尿病，在其敲出小鼠出現(xiàn)了胚胎發(fā)生、生長及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受損現(xiàn)象。E2F6的缺失導(dǎo)

23、致骨架缺陷。發(fā)生H3K27me2減少且被H3K27me3標(biāo)記的基因在胚胎發(fā)育期間具有不同作用。舉例來說，Gsc在TG3精子時期，其H3K27me3、H3K4me和 Kdm1a結(jié)合域重疊區(qū)的H3K4me2量的減少。Gsc的定點突變導(dǎo)致了小鼠顱骨發(fā)育異常和骨骼發(fā)育缺陷頻率的上升。在基因消除的模型中報道出的讓人想起TG1-4和nonTG3-4子代中觀察到的表型，盡管與精子發(fā)生中組蛋白甲基化的改變關(guān)聯(lián)并不清楚。我們的胚胎期表達基因的同源分析表明，H3K4me2減少的基因參與形態(tài)發(fā)生、圖文形成、系統(tǒng)發(fā)育、軟骨發(fā)育、分解和代謝過程。相反，在TG3雄性中高的和無H3K4me2改變?nèi)旧|(zhì)基因分別在精子發(fā)生和各

24、種核內(nèi)過程起作用。這些結(jié)果強調(diào)了hKDM1A靶向特異的一類易影響子代發(fā)育的基因。而且，這類基因與我們的表型相一致，這些表型在轉(zhuǎn)TG雄性的精子發(fā)生過程中沒有觀察到缺陷，但在幼崽中可見。組蛋白H3K4me2的改變不依賴DNA甲基化TG3的精子相發(fā)反，nonTG3的雄性精子ChIP-seq分析未顯示H3K4me2的占有情況與TG3或?qū)φ战M的雄性精子的不同。這些數(shù)據(jù)表明在nonTG雄性子代親畜所觀察到的表型異常與H3K4me2水平的減少無直接相關(guān)性，在TG的雄性親畜的成熟精子的情況相似。已經(jīng)報道，在一些情況下，KDM1A介導(dǎo)H3K9的單甲基和二甲基化的移除。在不同的體細胞中，H3K9me2是異染色體高

25、豐度修飾，分布在整個基因組的大部分區(qū)域。H3K9me2 不分布于H3K4me2 或H3K27me3標(biāo)記的區(qū)域，或與其相互排斥，而H3K4me2 或H3K27me3在精子中含核小體的CGI分布廣泛。這種反相關(guān)小化了H3K9me2對于TG 和nonTG子代所觀察到的胚胎損傷特征父本遺傳作用。DNA甲基化的改變與在父本環(huán)境壓力誘導(dǎo)的表型相關(guān)，認為是一種表觀遺傳的機制。為了證明H3K4me2水平的減少是能引起DNA甲基化的可遺傳改變，我們首先利用一種靶標(biāo)方法來測定TG3(F1) 和nonTG3(F1)同窩出生幼崽精子中的DNA甲基化。在T中，基于CpGs富集元件的靶向選擇，并將G3精子中H3K4me2

26、不同甲基化鑒定結(jié)果與對照組C57BL/6細胞相比較。通過高質(zhì)量測序質(zhì)譜ARRAY分析選擇的靶點，用來研究DNA甲基化的改變，高質(zhì)量測序質(zhì)譜ARRAY是先將其進行中重硫酸鹽轉(zhuǎn)換，再用CpG水平分辨率的質(zhì)譜進行分析。在24個靶基因中，與對照組相比，我們未能觀察到TG3和nonTG3 DNA甲基化發(fā)生顯著改變(fig. S8)。接著，我們利用減少代表的重壓硫酸鹽測序(RRBS)對DNA甲基化水平進行了全基因組水平的比較，發(fā)現(xiàn)在對照組、TG3和nonTG3精子中主要分布于CpG島。全基因組的單個CpG位點甲基化水平分析表示，在三個基因型的樣本中具有高度的相似性，無明顯的基團聚集(fig. S9A)。當(dāng)

27、測定與基因型顯著相關(guān)的單個CpG位點時，我們比預(yù)期檢測到了更多(fig. S9, B and C)。總之，利用靶向測序分析和RRBS，與對照組相比，在TG3和nonTG3轉(zhuǎn)基因鼠我們未發(fā)現(xiàn)CpG甲基化水平有顯著的改變。這些結(jié)果表明在CpG島的DNA甲基化不涉及分子過程，這產(chǎn)生了我們所觀察到的隔代遺傳表型。KDM1A的過表達與精子中RNA的改變相關(guān)聯(lián)TG3和nonTG3小鼠的精子的RNA分析表明了一種普遍的非基因改變(Fig. 6)。精子中含有各類RNAs，這些RNAs可以作為父本遺傳效應(yīng)的潛在中介子。我們利用Affymetrix GeneChip ST2.0 Array將TG3和nonTG3小

28、鼠精子的RNAs與對照組進行了比較。這使得我們可以檢測到28,000個編碼轉(zhuǎn)錄本和超過7000的非編碼RNAs，其中包括2000個lincRNAs。與對照組相比，TG3和nonTG3精子表現(xiàn)了較明顯的RNAs的改變，TG3精子中650 RNAs發(fā)生了改變，nonTG3精子中619 RNAs 發(fā)生了改變，二者中共同存在的564 RNAs發(fā)生了錯調(diào)，67個為cnRNAs，471個為蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本(table S5)?？深A(yù)見到能基因激活的組蛋白修飾的減少，與對照組相比，在TG3和nonTG3精子中，99%的不同RNAs減少。在野生型精子中，超過60%的RNA關(guān)聯(lián)啟動子被H3K4me3標(biāo)記，間接地反映

29、了在雄性精子細胞發(fā)育前期階段存在轉(zhuǎn)錄活性(Fig. 6B) ，但只有約3% 的RNAs被H3K27me3標(biāo)記。最后，41個共享的下調(diào)轉(zhuǎn)錄本與H3K4me2減少的基因相關(guān)聯(lián)(Fig. 6B)。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄本和調(diào)控RNAs通過TG3和nonTG3小鼠精子傳給了胚胎，并可能參與到子代的表型遺傳。TG3和nonTG3小鼠精子在早期胚胎中基因表達發(fā)生了改變?yōu)槔斫庠赥G3精子基因可承受的組蛋白甲基化的改變與胚胎期基因的表達及子代表型是否存在關(guān)聯(lián)存在，我們進行了TG8和nonTG8及對照組雄性二細胞胚胎期的表達矩陣分析。我們選擇檢測了二細胞期的胚胎，因為就發(fā)育時間來看，它們與我們所觀察的精子H3K4me

30、2改變相似。我們假設(shè)在父本染色體存在潛在的改變，與后續(xù)的發(fā)育階段相比，在二細胞期胚胎會至少稀釋二倍。在TG8和nonTG8產(chǎn)生的胚胎分別鑒定出874和123 不同表達的RNAs (table S6)。在TG8中轉(zhuǎn)錄874RNAs下調(diào)的基因中80%上調(diào)，nonTG8則有近一半上調(diào)。在同窩中的二細胞胚胎期，71個共享基因表達發(fā)生改變。而且，TG3精子中110個表達下調(diào)的基因在轉(zhuǎn)錄起始位點的H3K4me2減少了。這些基因都是被H3K27me3 和H3K4me3標(biāo)記(Fig. 6, C to E)。在TG3精子期時H3K4me2減少，或H3K27me 或H3K4me3富集，但卻在胚胎期發(fā)生改變的基因，

31、與在TG 和nonTG 產(chǎn)生的子代所觀察到的發(fā)育異常相關(guān)(Fig. 6E)。這些結(jié)果表明，在精子發(fā)育過程中引發(fā)H3K4me2改變的事件會引起在胚胎期基因表達的改變。討論這里，我們發(fā)現(xiàn)，在精子發(fā)生期，染色質(zhì)修飾分子KDM1A的表達上升會誘導(dǎo)大部分的發(fā)育缺陷，這些缺陷在三代中都可遺傳的，即便在在非轉(zhuǎn)基因子代缺少轉(zhuǎn)入基因的表達。我們的數(shù)據(jù)表明，在我們的模型中，在雄性精子發(fā)育期的組蛋白甲基化時期，重要的起始事件就已經(jīng)發(fā)生改變，導(dǎo)致子代發(fā)育異常。在hKDM1A模型的精子中，組蛋白甲基化在無甲基化改變的CGIs位點發(fā)生了改變。TG a和 nonTG 雄性精子和二細胞胚胎子代中，我們觀察到RNAs發(fā)生了改變

32、Fig. 6)。我們的數(shù)據(jù)強調(diào)隔代表觀遺傳機制的復(fù)雜性，以及可能涉及的分子因素，如在精子發(fā)生期染色體的形成，DNA的甲基化以及精子RNA。我們觀察到畸變的表型種類很多，包括骨骼和皮膚異常，存活率下降，生長受阻。這種異常見于于多父親來源的多子代中，而非少數(shù)父本產(chǎn)生的多子代中。與非轉(zhuǎn)基因子代的第四代相關(guān)的高外顯率表型一起，這些觀察表明一種引發(fā)發(fā)育損傷的表觀遺傳機制。不像在精子發(fā)育中表達的hKDM1A以化學(xué)突變物或誘導(dǎo)精子或子代表型突變起作用，產(chǎn)生高頻率的異常表型。與前面的概念一致，我們利用多種手段檢驗出沒有DNA損傷或染色質(zhì)不穩(wěn)定。另外，正常的精子頭部形態(tài)進一步支持精子染色體的穩(wěn)定性。人和小鼠的精

33、子組蛋白物改變的突變導(dǎo)致精子頭部無凝集。不像之前關(guān)于隔代遺傳的研究，但是我們采取了幾種方法，包括利用RRBS進行的基因組范圍的DNA甲基化分析和用Epityper靶向分析來確定TG 或nonTG 精子的CGIsDNA甲基化未發(fā)生改變。轉(zhuǎn)基因KDM1A表達誘導(dǎo)TG子代中精子包含CGI的啟動子H3K4me2的減少。在精子中H3K4me2水平的減少在高Kdm1a的精子中也觀察到。因為nonTG3生產(chǎn)的發(fā)育缺陷的子代，TG3動物也一樣，在TG3精子中觀察到的H3K4me2的減少也許并不直接導(dǎo)致發(fā)育缺陷的跨代的表觀遺傳。取而代之的是，我們的數(shù)據(jù)表明H3K4me2的分布有串聯(lián)效應(yīng)，在精子發(fā)生期基因的轉(zhuǎn)錄和

34、精子的RNA發(fā)生改變。相應(yīng)的，精子中H3K4me2的改變與攜有H3K4me3和H3K27me3的基因表達的改變相關(guān)，在精子中一系列的胚胎發(fā)育相關(guān)基因的CGIs表現(xiàn)正常。相應(yīng)的，由TG 或nonTG雄性產(chǎn)生的兩細胞胚胎期基因表達的改變與精子中組蛋白甲基化相關(guān)。這表明精子中組蛋白甲基化的改變可以影響早期胚胎基因的表達。相似地，Snf2h染色體重塑分子Smarca5MommeD4突變體在精子發(fā)生期與表觀遺傳靈敏基因agoutiviable yellow (Avy)相關(guān)。就如我們的研究，Smarca5MommeD雜合子的4WT雄子代有各種表型，這暗示在精子發(fā)生期正確的染色質(zhì)調(diào)控對子代的適應(yīng)性和基因表達

35、具有重要作用。我們的數(shù)據(jù)也提供了精子RNA作為子代表型促進分子的可能性。我們觀察到在TG 和nonTG精子的RNA有大量重疊，從對照組所得的不同RNA有85%的相似性。由RNA介導(dǎo)的父本效應(yīng)已經(jīng)在線蟲中被證實，誘導(dǎo)的病毒性表達導(dǎo)致小病毒RNA (viRNA)的跨代的父本遺傳。就如在我們的模型中，WT子代使子代繼承得到viRNA分子和免病毒侵染的保護性表型。隔代效應(yīng)通過處于轉(zhuǎn)基因壓力的第三代來分辨，因此這表明表型逐漸的缺失，與我們觀察到的結(jié)果相一致。但是，如RNA的擴散劑可以促使的隔代遺傳表型較低，因為哺乳動物精子細胞在囊胚期其命運是特定的，在受精后發(fā)生多細胞分裂。在RNS信號途徑受阻時，信號會

36、在細胞分裂過程中丟失直到細胞發(fā)生特化。因此，我們建立一個哺乳動物模型，精子中的RNA異常與精子發(fā)育期的染色質(zhì)改變有關(guān)。在發(fā)育階段，這些RNA可以作用于染色質(zhì)調(diào)控基因的表達(Fig. 7)。與對照組相比，TG和nonTG s雄性精子中，特異RNA大部分是調(diào)控RNA，調(diào)控RNA的功能包括調(diào)控多能性和分化，指導(dǎo)表觀遺傳形成。我們知道，是精子將lnRNA傳給胚胎，推測這些RNA會影響受精后的基因組。如果lncRNAs在發(fā)育的胚細胞中不準(zhǔn)確轉(zhuǎn)錄，改變的lncRNAs就會傳給胚胎，此事基因表達可以被修飾。lncRNAs與染色質(zhì)調(diào)控機器作用，并介導(dǎo)染色質(zhì)的改變。而且，lncRNAs敲出，在PND20前，導(dǎo)致

37、出生前或后死亡，這在我們的轉(zhuǎn)基因子代中一種普遍觀察到的現(xiàn)象。結(jié)果我們的數(shù)據(jù)表明，在精子發(fā)生期CGIs位點獨立的DNA甲基化和組蛋白甲基化異常與胚胎基因表達的改變和發(fā)育相關(guān)聯(lián)。我們關(guān)于隔代表觀遺傳結(jié)果表明，在精子發(fā)生期，染色質(zhì)修飾所引起的基因損傷及環(huán)境所引起的組蛋白甲基化改變，可能是一種潛在的導(dǎo)致新生兒缺陷和疾病的原因，而這種缺陷和疾病很可能是父親引起的。個體對環(huán)境的反應(yīng)，遺傳的敏感性或疾病的易感性可能受染色體修飾因子數(shù)目的影響。1. I. Lobo, K. Zhaurova, Birth defects: causes and statistics. Nat.Educ. 1, 18 (2008).2. T. J. Mathews, M. F. MacDorman, “Infant mortality statisticsfrom the 2005 period linked birth/infant death data set”(National V