植物食品通過分散SPE進(jìn)行乙腈提純隔離與移除之后使用GC-MS與或LC-MSMS 測定殺蟲劑殘留物QuEChERS方法

1、植物食品通過分散SPE進(jìn)行乙腈提純/隔離和移除之后使用GC-MS和/或LC-MS/MS測定殺蟲劑殘留物QuEChERS方法1 范圍 本歐洲標(biāo)準(zhǔn)描述了植物性食物中的農(nóng)藥殘留分析方法，如水果（包括干果制品），蔬菜，谷物及其加工品。該方法是在大量的物品/農(nóng)藥組合的基礎(chǔ)上研究的。2原理 用乙腈提取質(zhì)地均勻的樣品。在初始提取之前，含水量低的樣品（80%）需要另外加約10g水。添加硫酸鎂、氯化鈉和檸檬酸鹽緩沖物，強(qiáng)烈振蕩將混合物并用離心機(jī)進(jìn)行相分離。等分試樣的有機(jī)相是經(jīng)采用批量吸附劑的分散固相（d-spe）提取掉，以及硫酸鎂去除殘余的水。隨著加入少量的甲酸酸化，清理氨基吸附劑提取物（如二級(jí)阿明吸附，PSA

2、），提高堿敏感性農(nóng)藥的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。最后的提取物可直接用于GC和LC的定性分析。定量通常是使用內(nèi)標(biāo)，即乙腈初次加入后添加到提取物中。這個(gè)方法的簡單概述是附件C所示的流程圖。3 試劑3.1 一般和安全方面 除非另有規(guī)定，使用認(rèn)可的分析純?cè)噭?。采取一切預(yù)防措施，以避免可能被水，溶劑，吸附劑，無機(jī)鹽等污染。 免責(zé)聲明本標(biāo)準(zhǔn)涉及幾個(gè)市售的產(chǎn)品和適合該方法流程的儀器。此信息是為了方便本歐洲標(biāo)準(zhǔn)的使用者，和被產(chǎn)品命名的歐洲標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)不被構(gòu)成背書。如果他們可以導(dǎo)致相同的結(jié)果，等效的產(chǎn)品可能被使用。3.2 水，HPLC級(jí)3.3 乙腈，HPLC級(jí)3.4 甲醇，HPLC級(jí)3.5 甲酸銨3.6 無水硫酸鎂，砂礫，例如

3、Fluka63135號(hào) 在馬弗爐中加熱到550，鄰苯二甲酸鹽可以被去除（如過夜）。3.7 無水硫酸鎂，細(xì)粉 在馬弗爐中加熱到550，鄰苯二甲酸鹽可以被去除（如過夜）。3.8 氯化鈉3.9 檸檬酸二鈉鹽1.5水合物3.10檸檬酸鈉3.11氫氧化鈉溶液，物質(zhì)的量濃度C= 5moll溶解2g氫氧化鈉于5ml水中，并稀釋至10ml。3.12緩沖鹽混合溶液第二次提取和分配： 稱取4 g 0.2無水硫酸鎂（3.6），1 g0.05g氯化鈉，1g0.05 g檸檬酸鈉和0,5g0.03g檸檬酸二鈉鹽1.5水合物于燒杯中（4.11）。這些量是約10毫升的水樣品中的。 高酸性樣品（pH3），在添加緩沖鹽后pH值通

4、常是低于5。為了更好地保護(hù)酸不穩(wěn)定化合物，可以通過添加5 mol/l 氫氧化鈉溶液(3.11)升高pH值：對(duì)于檸檬、酸橙和醋栗，可直接向鹽混合物添加600l氫氧化鈉溶液，對(duì)于木莓則是200l。注意 最好是提前準(zhǔn)備足夠數(shù)量的緩沖鹽混合物，以便提取可以迅速地進(jìn)行而不中斷。鹽混合物的制備可以極大地便利分樣器的使用（4.12）。上述的鹽的量是用于約含10g水的樣品部分。3.13乙腈-甲酸混合溶液，體積比例=5ml甲酸100ml用乙腈將0.5ml甲酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)W95%）稀釋至10毫升（3.3）。3.14二級(jí)阿明吸附劑 例如，Bondesil-PSA40 m Varian No. 122130231) 其

5、他氨基酸吸附劑可以使用，但需證是等效的，特別是關(guān)于被分析物的損失和最終提取物的pH值。3.15石墨化炭黑吸附劑（GCB），例如Supelco Supelclean Envi-Carb1) SPE Bulk Packing, No. 57210U 其他石墨化碳吸附劑可以使用，但需證是等效的，特別是關(guān)于分析物的損失。3.16吸附混合物1：GCB（3.15）/硫酸鎂無水細(xì)粉（3.7）混合，1 + 59質(zhì)量比 這兩種成分混合成均勻的混合物。3.17吸附混合物2：GCB（3.15）/硫酸鎂無水細(xì)粉（3.7）混合，1 + 19質(zhì)量比 這兩種成分混合成均勻的混合物。注意 強(qiáng)烈建議提前準(zhǔn)備吸附混合物1(3.1

6、6)和2(3.17)，并將它們存儲(chǔ)在可密封的容器內(nèi)。為凈化提取物，根據(jù)5.4.3將預(yù)混吸附混合物1或2加入到離心管(4.4)。3.18 碳十八吸附劑（十八烷基甲硅烷改性硅膠），50m散裝材料。3.19乙腈內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)溶液，= 10 gml至50 gml表1列出可能用于這種方法的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)（istds）和質(zhì)量控制（QC）的標(biāo)準(zhǔn)。列出的建議濃度值 ()是指 ISTD溶液應(yīng)在第一提取步驟（5.2）中加入。這溶液（）適當(dāng)稀釋應(yīng)準(zhǔn)備用于標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。更多詳情見3.22。3.20 農(nóng)藥原液 制備個(gè)別濃度分析標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，足以制備用于標(biāo)準(zhǔn)溶液制備的復(fù)合農(nóng)藥工作溶液（3.21）。 通常，原液要儲(chǔ)存在

7、低于18 的環(huán)境下。定期檢查原液的穩(wěn)定性 2。在某些情況下，酸或堿的加入可以提高穩(wěn)定性和延長貯存期。在撤退之前，任何部分從該溶液再溶解，會(huì)有沉淀發(fā)生。3.21農(nóng)藥的工作溶液 由于這種方法的廣泛適用性和由于部分農(nóng)藥不同的pH穩(wěn)定性，不止一個(gè)工作溶液中含有一種或多種農(nóng)藥可以覆蓋整個(gè)感興趣的殺蟲譜。這些都是按規(guī)定所需農(nóng)藥原液的體積（3.20）混合在一起的和用適當(dāng)?shù)囊译嫦♂尩?。這些混合農(nóng)藥濃度應(yīng)足以允許制備所需基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)（見3.22.2），用適當(dāng)?shù)目瞻讟悠诽崛∫合♂專ɡ缧∮?0%）。 通常，工作農(nóng)藥溶液要儲(chǔ)存在低于18 的環(huán)境下。定期檢查這些混合農(nóng)藥的穩(wěn)定性。某些情況下，酸或堿的加入可以提高穩(wěn)定

8、性和延長貯存期。3.22標(biāo)準(zhǔn)溶液（校準(zhǔn)混合物）3.22.1溶劑型標(biāo)準(zhǔn) 溶劑型標(biāo)準(zhǔn)的制備是將已知體積的農(nóng)藥工作溶液（見3.21）和ISTD溶液（見3.19)混合，用乙腈定容。 需用內(nèi)標(biāo)溶液的體積（）將取決于將制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（），以確保內(nèi)標(biāo)濃度以類似于樣品測試溶液。例： 如果制備1ml溶劑型標(biāo)準(zhǔn)，加入ISTD溶液的體積應(yīng)包含ISTD質(zhì)量(=)，是在5.2.3用10ml乙腈提取的檢測部分中加入ISTD質(zhì)量的10倍。因此，表明要適當(dāng)稀釋內(nèi)標(biāo)溶液濃度（這里=0.1。然后同樣的吸管量ISTDS加入到穗試驗(yàn)樣品和作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。表2示出了應(yīng)添加到測試部分（5.2.3）和標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.22）中的內(nèi)標(biāo)

9、質(zhì)量的比率。 多標(biāo)準(zhǔn)的溶液的制備包含廣泛的濃度范圍，可制備校準(zhǔn)曲線（見6.2）。注意 濃度為1 g / mL的農(nóng)藥相當(dāng)于一個(gè)10g樣品的1mg/kg的殘留量（如樣品的水含量30%）或5 g樣品的2mg/kg殘留量（如谷類）。3.22.2基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)制備基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)與制備溶劑型標(biāo)準(zhǔn)一樣，然而，而不是使用純乙腈提取空白樣品(準(zhǔn)備如5.1至5.4所述,但是沒有加入ISTD)。以盡量減少在色譜過程中因基質(zhì)效應(yīng)引起的誤差，最好選擇類似農(nóng)產(chǎn)品（如蘋果樣品，胡蘿卜樣品等）。當(dāng)加入農(nóng)藥工作溶液超過20%時(shí)，應(yīng)稀釋空白樣品提取液，體積調(diào)整可能必要的，以避免因在樣品提取物和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)之間的基質(zhì)誘導(dǎo)的增強(qiáng)效果的差

10、異的誤差。 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥的穩(wěn)定性會(huì)低于純乙腈標(biāo)準(zhǔn)，必須檢查得更徹底。 表2 應(yīng)添加到測試部分（5.2.3）和標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.22）中的內(nèi)標(biāo)質(zhì)量的比率（校準(zhǔn)混合物）3.23冷水（4C）3.24 干冰3.25流動(dòng)相A1：甲酸銨水溶液，C=5 mmolL3.26流動(dòng)相B1：甲醇-甲酸銨溶液，C=5 mmolL3.27流動(dòng)相A2：醋酸水溶液，= 0,1ml冰醋酸L3.28流動(dòng)相乙腈B2：乙腈-乙酸溶液，= 0,1mL冰醋酸L3.29流動(dòng)相A3：甲醇/水A32+8（VV）與5mmol/L甲酸銨3.30流動(dòng)相B3：甲醇/水B39 +1（VV）與5mmol/L甲酸銨4設(shè)備實(shí)驗(yàn)室常用儀器，特別是以下：4.1

11、試樣加工設(shè)備，如Stephan UM 5 universal4.2高速分散裝置分散元件的直徑應(yīng)適合所用的離心管（4.4）的開口。4.3自動(dòng)移液槍，適用于處理10 L至100L，200 L 至1 000L和1mL至10mL。注意 10毫升的玻璃移液管可以替代（1ml至10ml)使用。4.4帶螺旋蓋離心管，50ml例 a) 50ml離心管由聚四氟乙烯制成，或是 b)一次性帶螺旋帽50ml聚丙烯離心管4.5 單用帶螺旋帽聚丙烯離心管，10ml或12ml4.6 10ml的乙腈溶劑分配器，用于5.2.34.7 離心機(jī)，適用于離心管用于步驟（4.4和4.5）和可實(shí)現(xiàn)達(dá)到3 000克。4.8 粉末漏斗，要適

12、合離心管的開口4.9 注射瓶，1.5ml，適用于氣相色譜和液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器，如果必要時(shí)用微量注射4.10螺旋蓋玻璃瓶，如20ml，如必要，用于過量的最終提取存儲(chǔ)4.11塑料杯（堆疊），25毫升，用于存儲(chǔ)緩沖鹽混合物部分（3.12）。4.12分樣器，自動(dòng)分鹽和吸附劑例如從Retsch/Haan, PT 100 or Fritsch/Idar-Oberstein, Laborette 27 or Brkle/Lrrach, Repro high-precision sample divider2）。它們的使用是可選的但強(qiáng)烈建議處理大量樣品。注意 前兩個(gè)是分配緩沖鹽混合物較好的（3.12），而 B

13、rkle Repro 是為少量固體設(shè)計(jì)的和更加適合分離PSA (3.14)/硫酸鎂（3.6）的混合物需要分離SPE（5.4.2）。從加拿大進(jìn)口的10毫升聚丙烯管，17mm84mm，貨號(hào)T550-10AT2）（4.5）完全符合Brkle Repro。4.13振動(dòng)裝置，例如渦旋（用于回收試驗(yàn)）4.14 LC-MS/MS系統(tǒng) 配有電噴霧電離（ESI）接口（見附件一）4.15氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，配備適當(dāng)?shù)奶綔y器，如MS，MS / MS，TOF和PTV噴射器溶劑的發(fā)射方式（見附錄A給出的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用設(shè)備）5 步驟5.1樣本的制備和存儲(chǔ)5.1.1一般 在測試樣品（有時(shí)也被稱為“樣品”）中，樣品處

14、理和存儲(chǔ)程序?qū)埩袅繜o顯著影響。處理也應(yīng)使試樣均勻，足以使子采樣的變化是可以接受的。如果一個(gè)單一的分析部分不能代表測試樣本，應(yīng)分析較大的或重復(fù)的部分，提供一個(gè)更好的估計(jì)真實(shí)值。粉碎的程度應(yīng)支持定量排渣。5.1.2實(shí)驗(yàn)室樣品 完全或大部分損壞或退化的實(shí)驗(yàn)室樣品是不應(yīng)被分析夫人。如果可能的話，在發(fā)生任何重大的物理或化學(xué)變化前，在任何情況下，樣品到達(dá)后應(yīng)立即準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)室樣品。如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)室樣品不能及時(shí)做好準(zhǔn)備，應(yīng)該是儲(chǔ)存在適宜的條件下，以保持新鮮和避免變質(zhì)。一般來說，在準(zhǔn)備前，實(shí)驗(yàn)室樣品不應(yīng)超過3天。干的或類似加工樣品應(yīng)在其保質(zhì)期內(nèi)分析。5.1.3半成測試樣品 半成測試樣品的準(zhǔn)備，用部分的實(shí)驗(yàn)室樣品測

15、試最大殘留限量。其余部分可能被清除。 選出的實(shí)驗(yàn)室樣品部分應(yīng)該具有代表性（如通過細(xì)分為四份、選擇對(duì)角部分）。對(duì)于小單位的樣品（如小水果如草莓，豆類，谷物），在稱量部分半成測試樣品前，樣品必須充分混合。當(dāng)樣品是由較大的單位組成，從每個(gè)單元選取楔形部分（例如瓜）或截面（如黃瓜），包括皮膚（外表面） 2 。5.1.4試驗(yàn)樣品 從每一半成測試樣品，任何會(huì)導(dǎo)致均化困難的部分都應(yīng)被剔除。在含石頭的水果中，石頭應(yīng)該被剔除。被剔除的部分應(yīng)該要記錄保存。應(yīng)采取預(yù)防措施，以避免任何的果汁或果肉損失。這是測試樣品。殘留量的計(jì)算應(yīng)根據(jù)原試樣的質(zhì)量（包括石頭）。 在測試樣品的均勻性是不充分的或可能由于明顯大粒徑而影響殘

16、留物的提取，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)氖侄芜M(jìn)行密集的粉碎。在室溫條件下，如果肉和汁分離或農(nóng)藥降解不顯著。在冷凍狀態(tài)下粉碎的樣品，不穩(wěn)定的化學(xué)農(nóng)藥的損失明顯減少，通常會(huì)導(dǎo)致更小的顆粒尺寸和更加均勻。粉碎前，用刀粗切割樣品（如3厘米3厘米）和放進(jìn)冰箱（如-18 過夜）以便于加工。處理也可以輔助，通過保持在溫度0 以下進(jìn)行低溫研磨改進(jìn)（使用干冰或液氮）。特別是水果和蔬菜，相比于室溫研磨，低溫研磨使表皮堅(jiān)韌的樣品均質(zhì)化（如番茄或葡萄）更有效。鑒于表皮經(jīng)常有非系統(tǒng)性農(nóng)藥，低溫研磨大大降低了子采樣的變異。當(dāng)在較低的溫度下處理試驗(yàn)樣品，應(yīng)避免高濕度造成結(jié)露。殘余的二氧化碳應(yīng)該允許充分消散，二氧化碳的貢重量可以忽略不計(jì)。5

17、.1.5試驗(yàn)部分 單項(xiàng)測試部分，每個(gè)充分的分析都是從綜合測試中提取出來。這些測試的部分應(yīng)該立即進(jìn)行分析。如果測試部分不能直接進(jìn)行分析，這測試樣品或測試部分應(yīng)凍結(jié)到直至需要為止。如果測試部分是從冷凍保存后的試驗(yàn)樣品中取出，測試樣品應(yīng)在取出測試部分前混合，以確保均勻性已經(jīng)重新建立。5.1.6干果和類似物品的均質(zhì)化（含水量30%） 加入850g冷水（3.23）到500克凍干果制品，并使混合物均勻（可以加入干冰）。5.2第一提取步驟5.2.1稱重 將一個(gè)具代表性的粉碎均勻的樣品測試部分（ma）轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中（4.4）。在水果和蔬菜重10g0,1 g的情況下（ma）加入到離心管。干果勻漿如5.

18、1.6描述，稱重13.5 g對(duì)應(yīng)5 g樣品（ma）。干燥的樣品材料像谷物制品、蜂蜜等，稱重均質(zhì)部分5g0.05 g（ma）。發(fā)酵產(chǎn)品和提取物豐富的香料稱2g0.03g（ma）。5.2.2水的添加 水含量低于80%的樣品應(yīng)加入足夠的冷水（3.23），使總水含量約10克。見表3特定的水含量和相應(yīng)的測試部分水的添加量。注意 來自5.1.6勻漿不需要添加水。5.2.3溶劑和內(nèi)標(biāo)的添加加入10ml乙腈和一定量的小體積的ISTD溶液(,如100 l），這溶液是表1中給出的含有一個(gè)或幾個(gè)化合物的示例性濃度（）。5.2.4提取 蓋好管子和搖晃震蕩1分鐘。如果樣品的粉碎程度不夠或殘留不容易從基質(zhì)中提取，提取的時(shí)

19、間可延長（例如使用機(jī)械振動(dòng)篩振蕩20分鐘）或使用高速分散器（例如ULTRA-TURRAX）。分散原件浸入樣品-乙腈混合物，進(jìn)行約2至5分鐘高速粉碎。在任何情況下都要確保目標(biāo)農(nóng)藥無明顯降解發(fā)生。當(dāng)添加ISTD溶液后，沒有必要沖洗分散元素。然而，它依然要在下一個(gè)樣品使用前徹底清洗，以避免交叉污染。 要確保采用的分散原件可以通過離心管口（4.4）。 樣品應(yīng)冷凍或在解凍過程時(shí)（除水含量20%的干樣品）提取。如果樣品是采用常溫提取，應(yīng)確保無明顯的目標(biāo)農(nóng)藥降解發(fā)生。5.3第二萃取步驟和分液 將配好的緩沖鹽混合物（3.12）加入到5.2的懸浮液中。封閉試管，立即用力振蕩搖1分鐘，在 3 000克離心5 mi

20、n 注意 當(dāng)處理酸性高的樣品，如檸檬，酸橙，紅醋栗和覆盆子，使用如3.12說明添加了氫氧化鈉的緩沖鹽混合物。在水的存在下，硫酸鎂往往形成結(jié)塊，迅速硬化。這可以避免，在加入鹽混合物后，立即振蕩離心管幾秒鐘。在鹽添加到所有樣品后，一整批可以同時(shí)進(jìn)行1分鐘提取。具有酸性基團(tuán)的農(nóng)藥（例如苯氧乙酸）與氨基吸附劑相互作用，如PSA(N-丙基乙二胺)。因此，如果這種農(nóng)藥在分析范圍內(nèi)，那它們的定性分析（最好通過LC-MS/MS ESI NEG）應(yīng)在離心分離后，直接從原料提取進(jìn)行，而不是前處理（5.4）。對(duì)于這一點(diǎn)，將等分試樣原料提取物裝入小瓶并用于LC-MS/ MS分析。酸性農(nóng)藥特定的LC-MS/MS條件見附

21、錄A。5.4處理5.4.1去除共萃取的脂肪，蠟，糖類（如谷類，柑橘類水果）轉(zhuǎn)移8毫升乙腈相（5.3）等分試樣于離心管（4.5）中，在冰箱儲(chǔ)藏一夜（對(duì)于面粉，2小時(shí)已經(jīng)足夠），就是脂肪和蠟?zāi)毯统恋淼闹饕糠?。在短暫離心（如有必要），根據(jù)5.4.2，還是冷的6毫升提取物被用于分散固相萃取柱。注意 由于在乙腈的溶解度的緣故，凍結(jié)有助于清除一些額外的樣品提取物，如糖。共同提取的脂肪和蠟，這可能會(huì)對(duì)氣相色譜分析的耐用性產(chǎn)生負(fù)面影響，使用硅膠反相吸附劑（ODS，C18型）可有效地除去。為此，25mg十八烷基硅烷鍵合硅膠填料、25mgN-丙基乙二胺和150mg硫酸鎂每毫升提取物被用于分散固相萃取步驟。農(nóng)藥

22、和所提出的內(nèi)部質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（見表1）不受這些處理的影響。5.4.2用氨基吸附劑清理（用PSA分散SPE）從5.3或5.4.1的6毫升乙腈相被轉(zhuǎn)移到聚丙烯單次使用的離心管（4.5），已經(jīng)含有150mg的PSA（3.14）和900mg的硫酸鎂（3.6）。蓋好管子，用力振搖30秒，離心（5分鐘，3000克）。立即隔離，并如5.4.4描述酸化提取物。1毫升的提取物，150毫克和25毫克硫酸鎂PSA是必要的。注意 在開始提取一批樣品的步驟前，用分散固相萃取吸附劑有助于負(fù)荷離心管。分樣器（4.12）的使用大大利于這個(gè)步驟。5.4.3用氨基酸混合吸附劑+ GCB清理（用PSA + GCB分散SPE） 對(duì)于類胡蘿

23、卜素含量高（如紅甜椒，胡蘿卜）和葉綠素含量高（例如菠菜，生菜，芝麻菜，羽衣甘藍(lán)，藤葉，除卷心萵苣萵和萵苣心）的樣品，用PSA和GCB結(jié)合分散固相萃取SPE。 從5.3轉(zhuǎn)移等分6ml乙腈相到離心管（4.5），其中一部分已經(jīng)包含有150mgPSA（3.14）和胡蘿卜、生菜提取物900毫克的吸附混合物1（3.16），和紅甜椒，菠菜，生菜或芝麻提取物900mg的吸附混合物2（3.17）。封閉管，用力振蕩2分鐘，離心（例如在5分鐘 3 000克）。立即隔離，并如5.4.4描述酸化提取物。 1ml提取物25mgPSA，取決于樣品，150mg吸附混合物1或2是必要的。注意 在開始提取一批樣品的步驟前，用分散

24、固相萃取吸附劑有助于負(fù)荷離心管。分樣器（4.12）的使用大大利于這個(gè)步驟。5.4.4提取穩(wěn)定性從5.5.2或5.4.3轉(zhuǎn)移等分5毫升的清理提取物到一個(gè)螺絲杯儲(chǔ)存瓶（4.10），小心以避免在吸附劑顆粒被轉(zhuǎn)移，并稍微加入50l5%甲酸-乙腈溶液酸化（3.13）。將調(diào)節(jié)pH提取物加到到自動(dòng)取樣器小瓶，用于氣體和液體色譜分析。必要時(shí)，可使用存儲(chǔ)在冰箱里的剩余提取物。對(duì)于1毫升提取物，10L的甲酸溶液（3.13）是必要的。5.5測定注入5.4.4（在酸性農(nóng)藥的情況下，利用原提取物5.3）的樣品提取物與標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.22）進(jìn)入GC或LC儀器。這可能涉及校準(zhǔn)溶液包圍樣品提取物。測量可以采用各種儀器，儀器參數(shù)

25、和柱進(jìn)行。一些儀器參數(shù)和柱在附錄A中列出。這些條件已經(jīng)提供滿意的結(jié)果。LC-MS/MS的合適的實(shí)驗(yàn)測量條件，見 CEN/TR 15641 5。適合的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定的實(shí)驗(yàn)條件，指的是 3 。合適的GC-MS實(shí)驗(yàn)測定的條件，請(qǐng)參見3。盡管如此，在測量儀器上進(jìn)行單獨(dú)調(diào)試的化合物，通常提供更好的靈敏度。5.6試驗(yàn)的干擾和回收 在不同的合適的水平下，制備試劑空白和進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。在分析物的保留時(shí)間，試劑空白的色譜圖不應(yīng)顯示任何明顯的干擾峰。6 結(jié)果評(píng)價(jià)6.1識(shí)別和量化 許多參數(shù)可以用來確定不同分析物在樣品提取物中的身份。這包括：1）問題中分析物的保留時(shí)間（RT）或，甚至更好，保留時(shí)間比對(duì)IST

26、D（RT（A）/ RT（ISTD）從相同的運(yùn)行得到的峰2）分析物的峰的形狀；和3）在MS或MS / MS檢測的情況下，記錄相對(duì)豐度（一般2SRM轉(zhuǎn)換需要MS / MS和3 MS應(yīng)用離子）。 在樣品提取液中確定的分析物參數(shù)與校準(zhǔn)溶液中的農(nóng)藥（S）得到的參數(shù)進(jìn)行比較。應(yīng)該需要更高程度確認(rèn)被分析物的身份，額外的措施可能是必要的，如使用不同的色譜分離條件或額外評(píng)估m(xù) / z或SRM轉(zhuǎn)換。更多關(guān)于所需確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的信息，是指在歐盟的質(zhì)量控制指南SANCO/2007/3131文件 1 。表1列出了可以采用的ISTDs。更多的使用ISTD將提供一些備份信息。使用標(biāo)準(zhǔn)溶液（3.22.1或3.22.2）檢查線性和確

27、定每個(gè)校準(zhǔn)功能，如6.2中描述的活性物質(zhì)。基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)的使用是優(yōu)選的，然而，對(duì)于先估計(jì)食品中農(nóng)藥殘留限量或顯示他們?nèi)鄙?，可以使用純?nèi)軇┑臉?biāo)準(zhǔn)溶液（3.22.1）。如果初步實(shí)驗(yàn)表明，任何抑制或增強(qiáng)效果的經(jīng)歷不顯著影響結(jié)果，可用于定量分析。作為一旦相關(guān)的殘留濃度的檢測（如涉嫌侵犯，MRL）更精確使用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)測定（3.22.2）或標(biāo)準(zhǔn)加入法（6.3）應(yīng)使用。影響樣品提取物相比，響應(yīng)的目標(biāo)分析物的響應(yīng)注1 影響樣品提取物的目標(biāo)分析物響應(yīng)與在純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)的目標(biāo)分析物的響應(yīng)矩陣的影響的對(duì)比注2 校準(zhǔn)范圍應(yīng)適當(dāng)對(duì)應(yīng)量化的殘留濃度。因此，因此，有必要從校準(zhǔn)的測量結(jié)果，構(gòu)建多個(gè)標(biāo)定圖。 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定使

28、用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行量化和識(shí)別。然而，沒有ISTD,它還是可以量化。沒有ISTD，乙腈相的體積（5.3）假設(shè)是體積相同的乙腈加入到5.2.3的樣品中（10毫升）。當(dāng)使用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，重要的是要知道，在峰信號(hào)的任何變化將直接影響分析物濃度的計(jì)算。理想情況下，由于體積的不同，內(nèi)標(biāo)信號(hào)應(yīng)該只有變化，因此提高測量精度。然而，也有其他非理想因素，也可能影響ISTD的信號(hào)，從而引入分析物定量分析的誤差。在分區(qū)或清理時(shí)，ISTD的損失將導(dǎo)致被分析物濃度的高估。這樣的損失因此應(yīng)該是最小的。實(shí)驗(yàn)表明，ISTD物質(zhì)的回收率很高，由于ISTD物質(zhì)損失仍然是微不足道的，分析物結(jié)果產(chǎn)生誤差是由其他來源錯(cuò)誤。一個(gè)特定的ISTD物質(zhì)

29、的抑制信號(hào)，由于共洗脫基質(zhì)成分，可能發(fā)生在LC-MS應(yīng)用，也會(huì)導(dǎo)致分析物被高估，而相對(duì)增強(qiáng)的ISTD物質(zhì)信號(hào)，由于矩陣的共同提取物存在，在氣相色譜中，將導(dǎo)致低估分析物濃度。因此，應(yīng)用于氣相色譜的istds應(yīng)該是化合物，幾乎沒有基質(zhì)誘導(dǎo)增強(qiáng)現(xiàn)象的影響。在LC-MS應(yīng)用矩陣的影響，將取決于提取物是否包含特定的化合物，將和ISTD物質(zhì)共同洗脫而影響其電離過程。在任何情況下，它始終是引進(jìn)的質(zhì)量控制措施，以確保由ISTD引入的任何誤差仍然微不足道。質(zhì)量控制措施可能包括備份istds和可以在分析過程中的其他階段加入（例如，最后的提取物）的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，和可能幫助識(shí)別任何非體積有關(guān)的ISTD信號(hào)變化。序列中

30、的每個(gè)樣品中峰的信號(hào)強(qiáng)度觀測對(duì)質(zhì)量控制是很有幫助的。一個(gè)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)變的發(fā)生，數(shù)量應(yīng)不使用使用備份進(jìn)行物質(zhì)或物質(zhì)。在后者的情況下，精確的液體輸送和的標(biāo)準(zhǔn)溶液體積的平衡和樣品提取物是強(qiáng)制性的。6.2計(jì)算不加標(biāo)殘留濃度使用的變量：ISTD溶液的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)濃度校準(zhǔn)混合物的農(nóng)藥濃度校準(zhǔn)混合物中內(nèi)標(biāo)濃度最后提取物中的農(nóng)藥濃度最后提取物的內(nèi)標(biāo)濃度測試部分的質(zhì)量加到測試部分的ISTD體積校準(zhǔn)混合物中農(nóng)藥峰面積校準(zhǔn)混合物中ISTD峰面積最終的提取的農(nóng)藥峰面積最終的提取物的ISTD的峰面積校準(zhǔn)混合物獲得的峰值比最終提取物的峰值比校準(zhǔn)曲線斜率校準(zhǔn)圖偏差樣品中的農(nóng)藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)此外在文本：內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量（S）被用于標(biāo)準(zhǔn)溶液的制

31、備導(dǎo)致大量農(nóng)藥添加到每個(gè)小瓶（標(biāo)準(zhǔn)加入）標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（或基于矩陣的溶劑相匹配的標(biāo)準(zhǔn)）內(nèi)標(biāo)溶液的體積，可用于標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制農(nóng)藥工作溶液的量用于制備校準(zhǔn)混合物農(nóng)藥原液的適當(dāng)稀釋添加量（標(biāo)準(zhǔn)加入）通過繪制內(nèi)部溶液每個(gè)校準(zhǔn)水平對(duì)無量綱濃度比(/)的峰值圖PRcal mix，確定各活性物質(zhì)的校準(zhǔn)功能。從下面公式描述的相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線圖：每一個(gè)預(yù)期的濃度比(/)可按照以下公式計(jì)算：在最后提取中的濃度比(/)取決于測試部分ma中農(nóng)藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)wR、內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)濃度CIST和測試部分中添加的量。當(dāng)從最后提取中得到的峰值比PRsample = /跟從校準(zhǔn)混合物得到的峰值比 PRcal mix ，濃度比/和 /相同并

32、且質(zhì)量分?jǐn)?shù)wR(在測試樣品中殘留濃度)可以計(jì)算如下：注解 一條簡單和面向?qū)嵺`用于計(jì)算結(jié)果的公式，其中不包含ISTD濃度但需要一定前提條件得到滿足，可在附錄D中找到。6.3 用標(biāo)準(zhǔn)加入法的殘留濃度的計(jì)算 在遇到涉嫌違規(guī)殘留物、或已知的通過基質(zhì)誘導(dǎo)的增強(qiáng)或抑制現(xiàn)象強(qiáng)烈影響的化合物時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)添加的程序被建議提供響應(yīng)和在固定濃度范圍內(nèi)的濃度之間的關(guān)系函數(shù)是線性的。在這種情況下幾個(gè)等分的最終樣本提取物被適當(dāng)稀釋的按表4通過溶劑調(diào)整的農(nóng)藥原液（3.20）的增加量強(qiáng)化。 這個(gè)程序需要近似于通過初步分析得到的殘留水平wR的知識(shí)。假設(shè)一個(gè)估計(jì)殘留水平WR=0,8 mg/kg的樣品（用樣品量10克），表4的取樣方案

33、可能合適。樣品中分析物的量是用如圖表1的圖解表示法通過線性回歸計(jì)算的。注釋 在其他殘留水平WR，調(diào)整濃度的分析物標(biāo)準(zhǔn)溶液和/或適量的分析物溶液和溶劑是必須的。Y 分析物峰面積的比值除以ISTD的峰面積X 添加的分析物的絕對(duì)質(zhì)量以g為單位|X| 在標(biāo)準(zhǔn)加入前樣品提取分析物的絕對(duì)質(zhì)量以g為單位圖1內(nèi)部校準(zhǔn)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)加入法，按照?qǐng)D示計(jì)算是通過公式（6）和圖1所示的回歸曲線圖演算的。C是分析物的校準(zhǔn)曲線圖的Y軸截距b是校準(zhǔn)曲線的斜率V是在5.2.3中乙腈加入的量Val是用標(biāo)準(zhǔn)添加法等分的量ma是原始樣品重量6.4 方法的依賴幾個(gè)回收實(shí)驗(yàn)（添加水平為0,01 mg/kg 0,25 mg/kg）已在協(xié)調(diào)多實(shí)

34、驗(yàn)室驗(yàn)證研究的框架，通過利用代表性商品方法進(jìn)行。獲得的回收率通常在70%至110%之間并且對(duì)于復(fù)制分析的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。這些驗(yàn)證研究結(jié)果如附錄B中的表1所示。附錄B中的表2顯示了通過分別在不同實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證的框架和持續(xù)質(zhì)量控制得到的回收研究結(jié)果的匯遍。通過此方法得到的測定和檢測界限很大程度上取決于許多因素包括農(nóng)藥的類型、樣本問題、靈敏度和儀器在使用環(huán)境的選擇性。使用國家最先進(jìn)的儀器，水平在大約0,01 mg/kg（通常最低的MRL）的農(nóng)藥的確定分析在大多情況下很容易實(shí)現(xiàn)。7 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)量的確認(rèn)涉及第二部分樣品的分析而且當(dāng)?shù)谝徊糠值姆治鲲@示出涉嫌違規(guī)的殘留物其就會(huì)執(zhí)行。關(guān)于特性確認(rèn)的更多信息請(qǐng)參

35、閱SANCO / 2007 / 3131文獻(xiàn) 1 中描述的歐盟質(zhì)量控制指南。8精確度取自多實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)的涵義可能不適用與附錄B以外的農(nóng)藥的濃度范圍和矩陣根據(jù)ISO 5725-1和 ISO 5725-2方法的精確度的多實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)在附錄B中有總結(jié)9試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)至少包含以下內(nèi)容：所有信息對(duì)樣品的識(shí)別必要的；參考本歐洲標(biāo)準(zhǔn)；結(jié)果和的結(jié)果，已表示單位；日期和取樣步驟（如果可能的話）；在實(shí)驗(yàn)室收到的樣本日期；試驗(yàn)日期；任何特定值的測試過程；任何操作中沒有規(guī)定的方法或作為可選這可能會(huì)影響結(jié)果。通過繪制內(nèi)部溶液每個(gè)校準(zhǔn)水平對(duì)無量綱濃度比(/)的峰值圖PRcal mix，確定各活性物質(zhì)的校準(zhǔn)功能。從下面公式描述的相應(yīng)的校準(zhǔn)曲線圖：每一個(gè)預(yù)期的濃度比(/)可按照以下公式計(jì)算：在最后提取中的濃度比(/)取決于測試部分ma中農(nóng)藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)wR、內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)濃度CIST和測試部分中添加的量。當(dāng)從最后提取中得到的峰值比PRsample = /跟從